生物制药工艺学基因工程制药

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1、基因工程制药 o第一节 概述 o第二节 基因工程药物的生产的过程o第三节 目的基因的获得o第四节 基因表达o第五节 基因工程菌生物代谢的特点o第六节 基因工程菌的不稳定性o第七节 基因工程菌中试o第八节 重组工程菌的培养o第九节 高密度发酵o第十节 基因工程药物的分离纯化 o第十一节 变性蛋白的复性o第十二节 基因工程药物的质量控制o第十三节 基因工程药物的制造实例 第一节 概述基 因 工 程 的 概 念 基 因 工 程 又 称 为 重 组 DNA技 术 或 基 因 克隆 技 术 ,在 分 子 水 平 上 进 行 遗 传 操 作 ， 按 设计 的 蓝 图 ， 从 供 体 中 提 取 或 人 工

2、 合 成 目 的基 因 ， 令 其 与 载 体 构 建 成 重 组 DNA， 再 转 移到 受 体 细 胞 ， 目 的 基 因 在 细 胞 中 表 达 得 到期 望 的 由 这 个 外 源 基 因 所 编 码 的 蛋 白 质 ,获得 新 的 遗 传 性 状 。 基因工程的诞生打破了物种的界限，实现了物种间的基因交流，在实验室里对生物直接进行改造，为生命科学的研究开辟了新的领域、注入了新的方法，为提高人类的生活质量和健康水平开辟了新的途径，在农业、工业、医药等领域有巨大的应用前景。 o基因工程是生物技术的核心，基因工程技术的成就之一是用于生物治疗的新型药物的研制。o世界上第一个基因工程产品人胰岛

3、素（美国，1982年）o中国第一个基因工程药物1b干扰素（1997年）o美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物药物研发榜首。 为什么选择基因工程l传统制药存在的问题： A.材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用； B.内源生理活性物质，或造价太高，令人望而却步，或来源困难而供不应求； C.由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制； D.提取中难免感染，后果严重。l 基因工程技术的特点：就是能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。 生化提取 基因工程表达人生长激素（侏儒症）成本高产量低质量难以保证成本低产量高活性强性质优 50具新鲜

4、尸体脑下垂体中提取 基因工程1-2升细菌培养液 基因工程药物在解决癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病等方面取得明显的效果，为上述疾病的治疗、预防和诊断提供了新型药物、新型疫苗和新型诊断试剂。 基因工程技术可生产的药物和制剂包括：o免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；o细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；o激素，如胰岛素、生长激素、心素纳；o酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。 基因工程技术生产药品的优点： a. 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质； b. 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生

5、理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；c. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；d. 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；e. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选 源。 关于中国o 20世纪70主末，开始应用DNA重组技术、淋巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开发新产品 改造传统制药工艺。o“863”高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之一是：新型药物、疫苗和基因治疗，重点是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生产的药品。o我国基因工程药物主要集中在仿制上。o下游技术落后于上游技

6、术 第二节 基因工程药物生 产过程 基 因 工 程 技 术 是 将 重 组 对 象 的 目 的基 因 插 入 载 体 ， 拼 接 后 转 入 新 的 宿主 细 胞 ， 构 建 成 工 程 菌 (或 细 胞 ） ，实 现 遗 传 物 质 的 重 新 组 合 ， 并 使 目的 基 因 在 工 程 菌 内 进 行 复 制 和 表 达的 技 术 基因工程药物制造的主要步骤o目的基因的克隆o构建DNA重组体o构建工程菌o目的基因的表达o外源基因表达产物的分离纯化o产品的检验 制备基因工程药物的基本过程获得目的基因组建重建质粒构建基因工程菌培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装 基因工程的上

7、游和下游目的基因载体重组DNA分子重组DNA进入宿主细胞转化/转染工程菌大规模培养表达产物分离纯化诱导上游下游实验室工厂化、产业化、商口化 基因工程重组菌构建示意图 o上游阶段： 主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。 此阶段的工作主要在实验室内完成。o下游阶段： 从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的

8、制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。基因工程药物生产的上游和下游 第三节 目的基因的获得克隆基因的常用方法： o基因组文库法（原核）o反转录法（真核）o PCR法（原核+真核）o反转录-聚合酶链反应法（真核）o化学合成法（原核+真核）o旧基因改造法（原核+真核） 一 构建基因组文库分离目的基因 基 因 组 DNA（ genomic DNA） ： 指 代 表 一 个 细胞 或 生 物 体 整 套 遗 传 信 息 （ 染 色 体 及 线 粒 体 ）的 所 有 DNA序 列 。基 因 组 文 库 ： 将 某 种 细 胞 的 基 因 组 DNA切 成 一定 大 小

9、 的 片 段 ， 并 与 适 当 的 载 体 重 组 后 导 入宿 主 细 胞 ， 这 种 含 有 整 个 基 因 组 DNA信 息 的集 合 。 基因组文库（DNA文库）构建流程 分离基因组DNA 限制酶 大小不同酶切片段 片段酶切、回收、纯化 分别与适当的载体连接 载体 DNA连接酶 导入细胞 转化或转染 克隆 繁殖成菌落或嗜菌斑 鉴定 分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定 筛选根据基因决定筛选策略 基因组文库法只适合原核基因的获得，不适用于真核基因。Notice: Why ? 原核基因与真核基因的区别o真核基因有内含子o真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中很小一部分，为其10-5-10-7，即

10、使多拷贝基因也只有10-5，因此从染色体中直接分离纯化目的基因极其困难真核基因的反转录克隆法 二 反转录法o从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成与该mRNA互补的DNA（cDNA第一链），再以 cDNA第一链为模板，最终合成双链DNA序列。o cDNA不含内含子。o获得cDNA文库。 反 转 录 合 成 基 因 的 步 骤 ： mRNA的 纯 化 cDNA第 一 链 的 合 成 cDNA第 二 链 的 合 成 cDNA的 克 隆 将 重 组 体 导 入 宿 主 细 胞 cDNA文 库 的 鉴 定 目 的 cDNA克 隆 的 分 离 和 鉴 定 cDNA克隆示意图

11、mRNA逆转录酶ss-DNA逆转录酶ds-cDNAds-cDNA RNaseH酶解除去mRNADNA聚合酶I核酸酶S1 1. mRNA的纯化o细胞内含有3种以上的RNA，mRNA占细胞内总RNA总量的2%5%，o真核细胞中mRNA的3-末端含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸Oligo(dt)-纤维柱上，可用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。 2. cDNA第一链的合成o可用寡聚脱氧胸苷酸（dt）作为引物，在反转录酶作用下，开始cDNA链的合成。3. cDNA第二链的合成o除去cDNA-mRNA杂合链中的mRNA链（碱解或RNaseH酶解）o然后以cDNA

12、第一链为模板开始合成cDNA第二链。由于第一链cDNA3-末端会形成发夹结构，所以可从这点开始合成第二链（Klenow酶或DNA聚合酶I） o切除发夹结构（核酸酶S1，专一性切除单链DNA） 4. cDNA克隆o用于cDNA克隆的载体有两类： 质粒DNA（如pUC、pBR322等） 10kbo根据重组后插入的cDNA能否表达、转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为： 表达型载体（pUC、gt11）有启动子 非表达型载体（pBR322、gt10 ） 5. 将重组体导入宿主细胞o以转化或转染的方向使重组DNA进入宿主细胞。6. cDNA文库的鉴定目的：评价库的好坏o表型改变 抗性基因失活和菌落或噬菌斑

13、颜色改变o结构特征 凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析 7. 目的cDNA克隆的分离和鉴定o核酸探针杂交法 根据目的蛋白质的氨基酸序列，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，众cDNA文库中分离特异的cDNA克隆。o免疫反应鉴定法 用表达型载体构建的cDNA文库，可用免疫学方法逐一鉴定各cDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的cDNA克隆。 三 PCR法直接克隆基因o PCR-多聚酶链式反应 (Polymerase chain reaction)o PCR是一种模拟天然DNA复制过程，在有DNA模板、DNA聚合酶、引物和四种dNTP的情况下，通过高温变性（90 -95 )退火，延伸这样

14、反复循环的过程，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。o可从基因组中、载体上扩增基因 PCR的条件o模板 双链DNAo引物 o dNTP 原材料：A、T、G、Co DNA聚合酶 链的延伸 PCR三步曲o PCR 反 应 分 三 步 完 成 ：第 一 步 变 性 -95 高 温 下 ， 双 链 DNA 变 性 成为 单 链 。第 二 步 退 火 -适 当 温 度 下 ， 引 物 DNA结 合 在适 于 配 对 的 DNA片 断 上 。第 三 步 延 伸 -72 ， 由 DNA 聚 合 酶 催 化 ， 从引 物 开 始 利 用 四 种 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 合 成 目 的基 因 DNA

15、。 PCR原理示意图 四 反转录-聚合酶链反应法 反转录与聚合酶链反应（PCR）结合的方法：mRNA经反转录合成cDNA第一链后，不再合成cDNA第二链，而是在特异引物协助下，用PCR方法进行扩增，特异地合成目的cDNA链。 五 化学合成法o较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸序列或目的蛋白质的氨基酸序列，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。o方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完

16、整的基因。设 计 合 成 纯 化 组 装 化学合成基因的限制：o不能合成太长的基因。最长50-60 bp，只适用于克隆小分子肽的基因。o人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难，如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一致，易造成中性突变。o费用太高。 六 对旧基因的改造 o蛋白质工程： 通过对基因功能相关区域的研究，采用基因修饰技术和点突变技术进行基因新功能研究和再确认，从而改变基因表达产物的生物学功能。 蛋白质工程药物的分子设计方法o定点突变某些关键氨基酸残基o增加、删除或调整分子上的某些肽段或结构域o功能互补的两种基因的融合o对表达产物的后修饰和改善 三 种 目 的 基 因 提 取 方 法 的 优 缺 点仅 限 于 合 成 核 苷 酸 对 较 少 的简 单 基 因专 一 性最 强化 学合 成 法 操 作 过 程 麻 烦 ， mRNA很 不 稳定 ， 要 求 的 技 术 条 件 较 高专 一 性 强反 转 录 法 工 作 量 大 ， 盲 目 ， 分 离 出 来的 有 时 并 非 一 个 基 因操 作 简 便广 泛 使 用基 因 文 库法 缺 点优 点