酵母菌筛选的方案

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1、第一部分：酵母筛选收集一. 土样中酵母的分离：1. 土壤的米集处理采用五点取样法从葡萄地土壤中取样。由于土壤中的微生物一般 在5-25cm的土层里，所以先用灭菌铲除去土壤的表皮，然后采取土 壤200-300g，至于无菌塑料袋内，并标明采取地点、日期。将其运 回实验室后至于冰箱中保存，备用。将采回的样品用四分法获取样品20-30g，将其置于研钵中研磨 均匀。2. 土壤中菌种的分离：称取1 g 土壤，置于液体培养基灭菌葡萄汁，经28 C，12 h， 180 rpm摇床富集培养。取1 ml富集培养液，分别进行五个梯度稀 释（1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000

2、），再用移液枪分 别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品 均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖 好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25 C或28 C ）的恒温箱 中培养，每个梯度做三个重复。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩 的菌落为止。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml的 链霉素或者100mg/L的氯霉素。观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形 态，进行分析和初步的归类。二. 葡萄果表酵母的分离：1. 葡萄的采集：葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此 在采收葡萄时，将果梗与葡萄一

3、起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡 萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无 损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。2. 菌种分离步骤：将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。随机选取并称量约10g成熟葡萄，放入盛有90ml无菌水的三 角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养30min后静置，制 成菌悬液，吸取50卩1放入YEPD固体培养基，三个重复，以无菌 刮铲刮匀，25C培养2448h。观察菌落的大小及生长状况。然后将静置后的菌悬液进行梯度稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、 10-7）,再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀

4、释液，注入平板上， 利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面 破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25 C 或28C ）的恒温箱中培养，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml的 链霉素或者100mg/L的氯霉素。观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形 态，进行分析和初步的归类。三. 自然发酵过程中酵母菌的分离：将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。称量约100g新鲜成熟度好的各品种葡萄，手工破碎，放入无菌 的500ml三角瓶，接着分别按30ug/ml添加链霉素，置于28C培养， 每隔24h取发酵

5、液1ml，加入9 ml无菌水中，然后进行梯度稀释至 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取样时期分别为:I，葡萄浆果破碎压 榨后（添加S02）； II，发酵旺盛期，葡萄汁含糖量下降20%时；III， 发酵后期，葡萄汁含糖量下降70%时；IV，发酵结束前，残糖10%以 下时。取0.1ml稀释后各菌液放入固体培养基，涂布均匀（注意不能 使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，28C条件下 使其自然发酵2448h，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml的 链霉素或者100mg/L的氯霉素。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。观

6、察每一个菌 落，编号并作详细描述。如：菌落颜色、表面结构、边缘、颜色等， 进行分析和初步的归类。四. 设备表面酵母的分离：取擦拭过设备表面的棉球，将其中的菌液挤出，取1m菌液经梯 度稀释法结合划线分离得到单菌落。以上菌液通过梯度稀释法进行划 线分离单菌落：无菌条件下取1 ml含菌的样品处理液一用无菌的生 理盐水稀释为若干梯度（10-1-10-7）将稀释液涂布于固体培养基平 板，28 C培养3d菌落计数一观察，编号并记录。观察和记录完毕后，挑选不同菌落中的每一菌株制成水浸片(染色), 并编号。将各个水制片在高倍镜下观察各株菌的个体形态，并记录。 选出具有典型酵母菌菌落特征的单菌落，用灭菌后的接种

7、环挑去不同 菌落，在分离培养基上连续划线分离23次，进行纯化。菌种的保藏：分离纯化得到的酵母单菌落接种于培养基进行液体培养，培养的条件 为：温度是28 C，转速为180 r/min，时间为1824 h。当菌体 培养好后，将菌液和灭菌后的甘油按体积比为7: 3的比例进行混 合，混合摇匀后于-20 C下保藏待用。PS：以上分别进行培养基筛选试验，可选培养基：(1) PDA培养基：去皮马铃薯300g，加水煮沸1020min，过滤加入葡萄糖200g， 加水至1L。灭菌。(2) YEPD：葡萄糖20g、蛋白胨20g、牛肉膏10g、琼脂20g、水1000ml 将葡萄糖溶解在水中，添加蛋白胨及酵母浸膏，混匀

8、后，加琼脂 溶化，灭菌。YEPD液体培养基：酵母浸粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L,葡萄糖 20 g/L,琼脂15 g/L,固体培养基可加入2 %琼脂。第二部分：酿酒酵母筛选及其鉴定一筛选1酿酒酵母的无性繁殖方式筛选对液体培养基培养48h的酵母菌株，在16X40倍显微镜镜检，筛选 出以多端出芽繁殖的菌株。2 WL琼脂培养基筛选酿酒酵母WL琼脂培养基（%质量分数）：酵母浸粉0.5,胰蛋白胨0.5,葡萄糖5, 琼脂2,磷酸二氢钾0.055，氯化钾0.0425，氯化钙0.0125，氯化铁 0.00025,硫酸镁 0.0125,硫酸锰 0.00025,溴甲酚绿 0.0022, pH 6.5, 12

9、1C 灭菌 20 min；将分离出来的酵母菌株，接种液体培养基活化24h后接种到WL琼脂 培养基，27C培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色（浅黄色） 至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。3赖氨酸培养基筛选赖氨酸培养基成分（L-1）： D-葡萄糖10g, L-组氨酸1mg, DL-蛋氨酸 加g, DL-色氨酸加g,对一氨基苯甲酸200p g,生物素20p g,叶酸 2p g,肌醇10mg，烟酸400p g,泛酸加g，盐酸吡哆醇400p g,核 黄素200p g,盐酸硫胺素400p g,硼酸500p g,结晶氯化铜40p g, 碘化钾100p g,结晶氯化铁200p g,结晶硫

10、酸锰400p g,结晶钼酸 钠200p g,结晶硫酸锌400p g,磷酸二氢钾850mg,磷酸氢二钾150mg, 结晶硫酸镁500mg,氯化钠100mg,结晶氯化钙100mg,赖氨酸盐酸 盐 2.5g，琼脂 20g, pH 自然，121C灭菌 20 min； 接种液体培养基活化24h后，按照1%接种量接种酵母到5mL无菌水 中进行饥饿处理，5d后，接种到赖氨酸培养基，27C培养5d后观 察是否有酵母生长，培养48h后没有菌落出现的继续培养，直到15d 后仍无菌落生长说明可能是酿酒酵母。二酿酒酵母的鉴定1. 形态与培养特征将菌种接种到液体培养基中，25C培养37d，观察是否发酵、培养 液是否混浊

11、，是否形成环或岛，沉淀量多少及松紧状况，并制水浸片 于显微镜下观察，记录酵母的无性繁殖方式与细胞的形状。将酵母在 琼脂培养基上划线，于28C培养3d4d，观察其菌落形态。2. 酵母假菌丝的观察将菌株在25C活化后，在琼脂平板上划线接种（每个平板2-3条），在菌线上盖上无菌盖玻片，在28C下培养5d10d。3. 酵母菌子囊抱子的观察产子囊抱子培养基：酵母膏3g、麦芽汁3g、蛋白胨5g、葡萄糖10 g、 琼脂20g、水1000 mLo上述培养基于121 C灭菌20min,做斜面； 菌株在25C琼脂培养基活化1-2d后，接种到生抱培养基斜面上划 线，25 C培养3d，镜检是否有子囊抱子。凡未见抱子的

12、在17C左 右保持46周，每周再检查是否出现子囊抱子。4. 同化碳源试验鉴定所需同化物质共18种，为半乳糖、棉籽糖、赤藓糖醇、蔗糖可 溶性淀粉、核糖醇、麦芽糖、D-木糖、D-甘露糖醇、纤维二糖、L- 阿拉伯糖、琥珀酸、海藻糖、D-核糖、柠檬酸、乳糖、L-鼠李糖和肌 醇。将上述糖分别加入到含有杜氏发酵管的氮源基础培养基（YNB） 中，使糖浓度达到50mmol/L，经过滤（0.20p m）除菌。以含YNB而 不含碳源的试管作为不生长的空白对照。酵母菌经活化后分别接入到 上述培养基中，25C条件下培养分别在1、2和第3周观察，以试管 中出现混浊计为阳性，否则计为阴性。重复3次，结果观察标准：将 已培

13、养数天的试管于混合振荡器上摇动，使内容物充分混匀。在一张 白色卡片上画一条约3/4mm宽的线，将卡片紧靠试管，直对自然光 观察，如果能看到不连续线段的清晰边缘，则记为+ ;如果溶液非常 澄清，记为-，表示未有酵母生长。5. 发酵糖类试验鉴定所需发酵碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖、菊糖 乳糖和核糖。将上述糖分别加入到含有杜氏发酵管的生理生化培养基 中,使糖的浓度达到50 mmol/L ,经过滤（0.20p m）除菌。酵母菌 经活化后分别接入到上述培养基中，25C条件下培养，每隔2d观察 发酵情况，连续观察2周，4周后再观察一次，每次观察时注意杜氏 小管中气体的量，以及出现的速度，判断

14、发酵情况。以杜试管中有气 泡记为阳性，无气泡为阴性，三次重复。6. 同化氮源供试氮源有硫酸铵、天门冬素、硝酸钾、亚硝酸钠、L-赖氨酸。该试 验主要考察酵母菌在分别以硫酸铵、天门冬素、硝酸钾、亚硝酸钠、 L-赖氨酸为惟一氮源时的生长情况。碳源基础培养基中加入硝酸钾， 加入量为0.078%（w/w），115C灭菌20mino接种隔夜活化的酵母，于 25C培养1周。试验设置3个重复，以不加入氮源的培养基作为对照。7. 生成类淀粉化合物试验生成类淀粉化合物培养基：硫酸铵0.2%、磷酸二氢钾0.2%、七水合 硫酸镁0.1%、酵母膏0.1%、葡萄糖2%、琼脂2%。上述培养基溶于蒸 馏水中，并用盐酸调整溶液

15、pH值达4.8,然后于115C灭菌20 min； 接种隔夜活化的酵母，28C培养12d后，在平板长菌处周围滴加 Lugols碘液，凡能产生类淀粉化合物的酵母会在菌落周围呈现蓝紫 色或绿色为正反应，即能生成类淀粉。有时出现棕色是肝糖反应，会 混淆结果，因此应将培养物保存几小时或过夜，如是棕色则会消失， 而蓝色仍然会保留。8. 0.1%、0.01%放线菌酮抗性测试溶解1g放线菌酮于2.5mL丙酮中，向丙酮溶液中加入6.7g氮源基础 培养基，再加入含10g葡萄糖的蒸馏水，充分混匀后过滤(0.20p m) 除菌。取上述溶液加入到有蒸馏水(已高压灭菌)的试管中，制成含 0.1%、0.01%放线菌酮的培养

16、基。向培养基中接种已活化好的酵母， 25C培养3周。结果观察标准同碳源同化测试。三.菌株26S rDNA D1/D2区序列分析1. 菌落PCR DNA的制备：挑取新鲜单菌落置于30p l 0.2% SDS中；漩涡混匀器上混匀15 秒；90C 热激 4min； 4C 13000rpmX 1min，离心，取上清液 20p L 至新的无菌离心管中，-20C保藏。2. 菌株26SrDNAD1/D2区的PCR扩增26SrDNAD1/D2 区 PCR 扩增的引物对为 NL1 ( 5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ) 和NL4(5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3) ； T

17、aq DNA Polymerse Buffer (1X )，MgCl2 2.0mmol/L，dNTPs 40 p mol/L，Taq 酶 1U，模板 DNA60ng,引物各0.6p mol/L，加超纯水至50p l。反应程序为95C 5min； 94C 1min； 52C 1min； 72C 1min20s，循环 36 次；72C 延 伸8min。所得PCR产物使用凝胶回收试剂盒进行纯化后，送出去进 行测序。第四部分：耐受性分析1. 酒精耐受性测定将灭菌后的YEPD培养基降温至40C左右，按10%、12%、14%、16%、 18%(v/v)的浓度加入乙醇，接种新鲜单菌落在YEPD平板进行生长实

18、 验，一周后以生长状况表征其酒精耐受性。2. 渗透胁迫耐受性测定力口入 0.7mol/L、1.0mol/L、1.2 mol/L、1.4 mol/L、1.6 mol/L、1.8 mol/L、2.0 mol/L、2.2 mol/L、2.4 mol/L KCL 到 YPD 液体培养基 中，接种新鲜单菌落进行生长实验，以生长状况表征其渗透胁迫耐受 性。培养2d后以生长状况表征其耐受性。3. 高温耐受性测定在37C和42C下，YEPD斜面培养进行生长实验，以生长状况表征 其高温耐受性。培养两周后以生长状况表征耐受性。4. 营养饥饿耐受性测定将各菌株在无菌水中25C分别静置饥饿5d、6d、7d、8d、9d

19、、10d， 在YPD液体培养基进行生长实验，培养2d后以生长状况表征其营养 饥饿耐受性。5. 高糖耐受性测试在含有10%、20%、30%、40%、50%、60%的葡萄糖的YEPD斜面培养基 进行生长实验，以生长状况表征其对不同浓度糖的耐受性。培养两周 后观察生长差异。6. 低pH值的耐受性测试在 pH 值分别为 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 的 YPD 液体培 养基中进行生长试验，以生长状况表征其对低pH值得耐受性测试。 培养2d后观察生长差异。7. 发酵力紫外分光光度法测定葡萄糖的含量：在碱性的条件下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色 的氨基化合物，

20、而非还原糖则被氧化为糖酸或者其它的产物。该棕红 色物质在540nm波长处具有最大吸收，且在一定浓度范围内光吸收的 值与还原糖的量呈一定线性关系，通过比色法可测定样品的含糖量。 标准曲线的绘制方法：取7只25mL的容量瓶，按照下表加入各种试 剂：管号0123456Glc标液00.20.40.60.81.01.2H02.01.81.61.41.21.00.8DNS试齐U1.51.51.51.51.51.51.5测定不同浓度葡萄糖标准液在540 nm波长处的吸光度，计算出各管 中标准葡萄糖含量，以吸光度值对各管标准葡萄糖含量作曲线得到标 准葡萄糖曲线。实验数据填入下表，绘制标准曲线。葡萄糖标准曲线的数据（单位：mL）管号0123456Glc含量00.20.40.60.81.01.2OD540PS：平板菌落计数：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分 分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由 每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原 样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即 可换算出样品中的含菌数。