产气荚膜梭状芽孢杆菌检验

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1、魏氏梭菌 目录 09/uuoeoeoeuoeuuu.html 1、 概 述 产 气 荚 膜 梭 状 芽 孢 杆 菌 又 称 魏 /卫 氏 梭 菌自 然 界 广 泛 存 在 (创 伤 感 染 ） 。： 动 物 性 食 品 原 料 食 品 加 热 后 未 及 时 冷 却 ， 所 含 耐 高 温 而残 余 的 产 气 荚 膜 梭 菌 芽 孢 会 迅 速 发 芽 ， 大 量繁 殖 ， 菌 数 可 达 数 10万 /g， 食 用 前 又 未 加 热 ，则 有 可 能 引 起 产 气 荚 膜 梭 菌 食 物 中 毒 。 食 品 中 产 气 荚 膜 梭 菌 检 验 的 主 要 目 标 是检 验 食 品 被

2、该 菌 污 染 的 程 度 ， 其 重 点 项 目 是活 菌 数 测 定 及 证 实 试 验 。 2、 生 物 学 特 性 G+(陈 旧 培 养 物 阴 性 菌 ） 无 鞭 毛 可 形 成 荚 膜 和 芽胞 的 大 杆 菌大 小 ： 为 (1 2) m X(2 10) m 。芽 孢 ： 卵 圆 形 位 于 菌 体 中 央 或 近 端 ， 直 径 大 于 菌 体 的 直 径 ， 有 的 菌 株 难 形 成 芽 胞 。荚 膜 ： 在 人 和 动 物 活 体 组 织 内 ， 或 在 含 血 清 的 培 养 基 内 生 长 时 可 形 成 荚 膜 。 Clostridium perfringensww

3、w.biol.vt.edu/ research/micimm/index.phphttp:/oregonstate.edu/research/Images/SarkerSlide.jpg http:/ www.uni-ulm.de/./ Diagnostik/Erreger/c_keim.htm *不 严 格 的 厌 氧*普 通 营 养 琼 脂 上 可 生 长 ， 若 加 入 葡 萄 糖 、 血 液 则 生 长 更 好 。 *适 宜 生 长 温 度 为 3747 。*生 长 和 繁 殖 速 度 极 快 ， 在 适 宜 条 件 下 8min/代 。*在 45 高 温 下 可 进 行 快 速 分

4、离 纯 培 养 ， 每 培 养 34h 传 种 1次 ， 较 易 分 离 纯 化 。 Clostridium Perfringens Toxindtirp.dtra.mil/./ agents/AgentsBW_toxins.asp 培 养 ： 大 量 产 气 ， 培 养 5h-6h变 浑 浊 ；中 生 长 ： 能 够 分 解 乳 糖 产 酸 ， 将 酪 蛋 白 凝 固 产 生 大 量 气 体 ， 冲 散 酪 蛋 白 ， 使 其 成 海 绵 状 。中 培 养 ： 产 生 大 量 气 体 ， 肉 渣 或 肉 块 略 带 粉 红 ， 但 不 消 化 。上 培 养 ： 15h 24h形 成 S型 菌

5、 落 ， 在 营 养 不 足 或 琼 脂 浓 度 高 的 平 板 上 可 形 成 锯 齿 状 带 放 射 条 纹 的 R型 菌 落 。 www.msu.edu/course/ fsc/441/resulex10.htmlat 45C， Clostridium perfringens is virtually the only organism that will produce the Stormy Fermentation 。 ： 菌 落 周 围 出 现 双 层 溶 血 环 ， 内 层 溶 血 完 全 ， 外 层 溶 血 不 完 全 ， 好 似 靶 状 ， 菌 落 本 身 略 带 灰 黄 色

6、 至 浅 灰 褐 色 ， 与 空 气 接 触 30min后 ， 有 时 可 能 逐 渐 变 为 灰 绿 色 、 甚 至 鲜 绿 色 ， 这 是 本 菌 的 特 征 之 一 。 Clostridium perfringens bacteria on a blood agar plate Courtesy Glenn Songer, The University . of Arizona College of Agriculture and Life Sciences. ： www.genomenewsnetwork.org/ articles/01_02/Clos. Clostridium pe

7、rfringens shows double-zone hemolysis on blood agar. Note the small area of beta hemolysis (complete lysis of red blood cells) surrounded by a larger zone of alpha hemolysis (partial hemolysis). The plate is sitting on a black lab bench www.cat.cc.md.us/./ labmanua/lab16/bloodcp.html Clostridium per

8、fringens Growing on Blood Agar www.genomenewsnetwork.org/ articles/01_02/Clos.www.cat.cc.md.us/./ labmanua/lab16/bloodcp.html 菌 落 周 围 出 现 乳 光 浑浊 带 ， 此 反 应 能 被 本 菌 的 抗 毒 素 抑 制 。 *由 于 发 酵 乳 糖 ， 菌 落周 围 的 培 养 基 颜 色 发 生 变化 *本 菌 不 消 化 牛 奶 ， 不分 解 游 离 脂 肪 ， 菌 落 周 围不 出 现 透 明 环 及 虹 彩 层（ 肉 毒 梭 菌 可 形 成 ） 。 www.

9、sat.affrc.go.jp/./ Cl_perfringens.htm *发 酵 葡 萄 糖 、 麦 芽 糖 、 乳 糖 及 蔗 糖 ， 产 酸 产 气 ， *液 化 明 胶*还 原 硝 酸 盐 为 亚 硝 酸 盐 。*能 将 亚 硫 酸 盐 还 原 为 硫 化 物 ， 在 含 亚 硫 酸 盐 及 铁 盐 的 琼 脂 中 形 成 黑 色 菌 落 *发 酵 牛 奶 中的 乳 糖 ， 使 牛 奶凝 固 ， 同 时 大 量产 气 ， 凝 块 碎 裂 ，即 所 谓 暴 风雨 式 发 酵 ” ， 这是 本 菌 的 重 要 生化 特 征 之 一 ， 也是 鉴 别 的 主 要 指标 。 www.wood

10、send.org/ aaa/micro.html A型 与 C型 菌 株 的 芽 胞 ： 耐 热 性 强 ， 煮 沸 1 3h， 繁 殖 型 菌 体 不 耐 热 。 www.pouch-hcho.co.jp/ japanese/virus23.html 毒 素 ： 产 气 荚 膜 梭 菌 能 产 生 外 毒 素 和 肠 毒 素 。 外 毒 素 ： 致 死 毒 素 、 坏 死 毒 素 和 溶 血 毒 素 ， 毒 性 不 强 不 耐 热 。 肠 毒 素 ： 不 耐 热 ， 60 经 10min即 可 破 坏 不 耐 酸 ， 对 碱 有 抵 抗 性 ， 对 胰 蛋 白 酶 等 蛋 白 分 解 酶 比

11、 较 稳 定 。 酶 ： 纤 维 蛋 白 酶 、 透 明 质 酸 酶 、 胶 原 酶 等 这 些 毒 素 和 酶 促 使 组 织 分 解 、 坏 死 、 产 气 、 水 肿 及 病变 扩 散 和 全 身 中 毒 等 。 分型： 根据毒素和抗血清中和试验将此菌分成A，B，C ，D，E 和F六个型。 A型：最常见，引起气性坏疽和食物中 毒； A型最早由Welch andNuttal(1892)分离， 所以叫卫氏/魏氏梭菌 C型：可引起肠炎。 *对人致病的主要是A、C和F型 4.1 庖 肉 培 养 基 产 生 大 量 气 体 ， 肉 渣 或 肉 块 略 带 粉 红 ， 但 不 消 化 4.2 亚 硫

12、 酸 盐 -多 粘 菌 素 -磺 胺 嘧 啶 琼 脂 （ SPS） - 能 将 亚 硫 酸 盐 还 原 为 硫 化 物 ， 在 含 亚 硫 酸 盐 及 铁 盐 (含 有 柠 檬 酸 铁 胺 )的 琼 脂 中 形 成 黑 色 菌 落 ； 前 面 分 离 培 养 和 计 数 用 （SPS） 4.3 液体硫乙醇酸盐培养基（FT） 大量培养该菌用4.4 动力硝酸盐培养基 -无鞭毛，不运动； 还原硝酸盐为亚硝酸盐 4.5 含 铁 牛 奶 培 养 基 -发 酵 牛 奶 中 的 乳 糖 ， 使 牛 奶 凝 固 ， 同 时 大 量 产 气 ， 凝 块 碎 裂 ， 即 所 谓 暴 风 雨 式 发 酵 ” /“

13、暴 烈 发 酵 ” ， 这 是本 菌 的 重 要 生 化 特 征 之 一 ， 也 是 鉴 别 的 主 要 指 标 。 观 察 2h， 5h不 发 酵 为 阴 性Iron Milk Medium. It is a medium used in Most Probable Number analysis of Clostridium perfringens. When placed at 45C, CP is virtually the only organism that will produce the Stormy Fermentation (seen in the right tube).

14、 The coagulation of milk fat forms a plug thereby restricting oxygen (which is necessary for this strict anaerobe). Stormy fermenation usually occurs within 6 to 8 hours www.msu.edu/course/ fsc/441/resulex10.html 4.6 卵 黄 琼 脂 培 养 基 检 查 卵 磷 脂 酶 ， 本 菌 卵 磷 脂 酶 阳 性 ， 接 种 点 （ 每 个 平 板 接 种 10点 以 上 ） 的 底 部 及

15、 其 周 围 形 成 乳 白 色 的 浑 浊 带 。4.7 0.1 蛋 白 胨 水 稀 释 剂 ；4.8 硝 酸 盐 还 原 试 剂 :甲 萘 胺 液 和 对 氨 基 苯 磺 酸 液 ；4.9 革 兰 氏 染 色 液 。 www.pouch-hcho.co.jp/ japanese/virus23.html肉毒梭菌对比 5、 检 验 程 序 计数30300个菌落的稀释倍数活菌计数培养 检 验 程 序 续 36，1824h36，24h 46 ,25h 爆发酵无 1 活 菌 计 数 培 养 ： 1： 10稀 释 的 样 品 用 蛋 白 胨 水 依 次 稀 释 至 10-2 10-6倍 ， 取 1m

16、l放 入 2个 平 板 ， 分 别 加 15ml SPS琼 脂 ， 于 36 培 养 24h， 选 取 长 有 30300 个 黑 色 菌 落 的 平 板 ， 计 数 黑 色 菌 落 数 。 www.msu.edu/course/ fsc/441/resulex10.html 2、 证 实 试 验 (1)纯 培 养 ： 由 平 板 上 任 取 10个 黑 色 菌 落 ， 分 别 接 种 FT培 养 基 ， 于 (36 1) 培 养 18 24h， 大 量 繁 殖 。 (2)菌 体 形 态 和 染 色 检 验 ： 用 培 养 液 涂 片 ， 革 兰 氏 染 色 镜 检 。 产 气 荚 膜 梭 菌

17、 为 革 兰 氏 阳 性 粗 大 杆 菌 ， 其 耐 热 株 有 卵 形 芽 孢 ， 位 于 菌 体 中 央 或 近 端 。 (3)检 查 动 力 和 硝 酸 盐 还 原 实 验 ： 用 接 种 环 (针 )穿 刺 接 种 动 力 硝 酸 盐 培 养 基 ，于 (36 1) 培 养 24h. -判 断 有 无 动 力 -产 气 荚 膜 梭 菌 无 动 力 ； -滴 加 硝 酸 盐 还 原 试 剂 “ 甲 萘 胺 液 和 对 氨 基苯 磺 酸 液 ” 各 0.5 ml， 观 察 硝 酸 盐 是 否 被 还 原 -产 气 荚 膜 梭 菌 ， 能 将 硝 酸 盐 还 原 为 亚 硝 酸 盐 。 （

18、红 色 ） (4)牛乳乳糖发酵产气“暴发酵”试验： 取生长旺盛的FT培养液1ml接种于含铁牛乳培养基，在46水浴中培养2h后观察有无“暴发酵”现象。5h内不发酵者为阴性。 产气荚膜梭菌发酵乳糖，产酸凝固酪蛋白并大 量产气，呈“暴风雨式发酵”现象，但培养基不变黑。 (5)卵 磷 脂 酶 检 查 试 验 ： 用 接 种 环 取 FT培 养 液 点 种 于 卵 黄 琼 脂 平 板 (每 块 平 板 至 少 可 接 种 10点 )， 于 厌 氧 培 养 ， 观 察 接 种 点 的 变 化 。 产 气 荚 膜 梭 菌 产 生 卵 磷 脂 酶 ， 分 解 卵 黄 中 的 卵 磷 脂 ， 接 种 点 的 底

19、 部 及 周 围 乳 白 色 的 混 浊 带 。 3、 菌 数 计 算 根 据 黑 色 菌 落 的 计 数 和 证 实 试 验 的 结 果 ， 计 算 1 g(ml)食 品 检 样 的 含 菌 数 。 例 如 ： 104稀 释 液 的 平 板 长 有 黑 色 菌 落 100个 ， 而 供 做证 实 试 验 的 10个 菌 落 中 有 7个 被 确 证 为 产 气 荚 膜 梭 菌 ， 则1g(mL)食 品 检 样 所 含 产 气 荚 膜 梭 菌 数 为计 算 ： www.msu.edu/course/ fsc/441/resulex10.html 复 习 题1、食 品 中 产 气 荚 膜 梭 菌 检 验 的 主 要 目 标 就验 食 品 被 该 菌 污 染 的 程 度 ， 因 此 ， 其 检验 的 重 点 项 目 是 活 菌 数 测 定 及 证 实 试 验 。能 引 起 奶 中 乳 糖 暴 发 酵 。2、 对 产 气 荚 膜 梭 菌 的 检 验 程 序 进 行 说 明 。