临床基因扩增检验的质量保证

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1、临 床 基 因 扩 增 检 验 的质 量 保 证卫 生 部 临 床 检 验 中 心 李 金 明 定 义n 质 量 保 证 (Quality Assurance,QA) 为 一 产 品 或 服务 满 足 特 定 质 量 要 求 提 供 充 分 可 信 性 所 必 要 的 有 计划 的 和 系 统 的 措 施 。 n 室 内 质 量 控 制 （ Internal Quality Control,IQC) 由实 验 室 工 作 人 员 ， 采 取 一 定 的 方 法 和 步 骤 ， 连 续 评价 本 实 验 室 工 作 的 可 靠 性 程 度 ， 旨 在 监 测 和 控 制 本实 验 室 工 作 的

2、 精 密 度 ， 提 高 本 室 常 规 工 作 中 批 内 、批 间 样 本 检 验 的 一 致 性 ， 以 确 定 测 定 结 果 是 否 可 靠 、可 否 发 出 报 告 的 一 项 工 作 。 定 义n 室 间 质 量 评 价 （ External Quality Assessment, EQA） 为 客 观 比 较 一 实 验 室 的 测 定 结 果 与 靶 值 的 差 异 ，由 外 单 位 机 构 ， 采 取 一 定 的 办 法 ， 连 续 、 客 观 地 评 价实 验 室 的 结 果 ， 发 现 误 差 并 校 正 结 果 ， 使 各 实 验 室 之间 的 结 果 具 有 可 比

3、 性 。 这 是 对 实 验 室 操 作 和 实 验 方 法的 回 顾 性 评 价 ， 而 不 是 用 来 决 定 在 实 时 的 测 定 结 果 的可 接 受 性 。 当 EQA用 来 为 执 业 许 可 或 实 验 室 认 证 的 目的 而 评 价 实 验 室 操 作 时 ， 常 描 述 为 实 验 室 能 力 验 证（ Proficiency testing, PT） 。 在 以 前 的 文 献 中 ，EQA常 描 述 室 间 质 量 控 制。 定 义n批 (Run) 在 相 同 条 件 下 所 获 得 的 一 组测 定 。 n均 值 （ Mean） n标 准 差 （ Standard

4、deviation, SD或 s )n变 异 系 数 （ Coefficient of variation, CV） 定 义 n 准 确 度 (Accuracy) 待 测 物 的 测 定 值与 其 真 值 的 一 致 性 程 度 。 准 确 度 不 能 直 接 以数 值 表 示 ， 通 常 以 不 准 确 度 来 间 接 衡 量 。 对一 分 析 物 重 复 多 次 测 定 ， 所 得 均 值 与 其 真 值或 参 考 靶 值 之 间 的 差 异 亦 即 偏 差 即 为 测 定 的不 准 确 度 。 n 偏 差 (Bias) 待 测 物 的 测 定 值 与 一 可接 受 参 考 值 之 间 的

5、 差 异 。 定 义n 精 密 度 (Precision) 在 一 定 条 件 下 所 获 得 的独 立 的 测 定 结 果 之 间 的 一 致 性 程 度 。 与 准确 度 一 样 ， 精 密 度 同 样 也 是 以 不 精 密 度 来间 接 表 示 。 测 定 不 精 密 度 的 主 要 来 源 是 随机 误 差 ， 以 标 准 差 （ SD） 和 /或 变 异 系 数（ CV） 具 体 表 示 。 SD或 CV越 大 ， 表 示 重复 测 定 的 离 散 度 越 大 ， 精 密 度 越 差 ， 反 之则 越 好 。 定 义n正 态 分 布 (G aussian distribution)

6、 当一 质 控 物 用 同 一 方 法 在 不 同 的 时 间 重复 多 次 测 定 ， 当 测 定 数 据 足 够 多 时 ，如 以 横 轴 表 示 测 定 值 ， 纵 轴 表 示 在 大量 测 定 中 相 应 测 定 值 的 个 数 ， 则 可 得到 一 个 两 头 低 ， 中 间 高 ， 中 为 所 有 测定 值 的 均 值 ， 左 右 对 称 的 “ 钟 形 ” 曲线 ， 亦 即 正 态 分 布 ， 又 称 高 斯 分 布 。 定 义n 正 态 分 布 的 基 本 统 计 学 含 义 可 用 均 数 （ ） 、标 准 差 （ s） 和 概 率 来 说 明 。 临 床 基 因 扩 增 检

7、 验 实 验 室常 规 测 定 步 骤n 标 本 收 集 ： 选 择 测 定 项 目 、 标 本 收 集 和 保 存 。n 实 验 室 测 定 ： 标 本 接 收 、 贴 标 签 、 样 本 处 理 、核 酸 扩 增 、 产 物 检 测 、 测 定 的 有 效 性 和 临 床诊 疗 价 值 。n 报 告 和 解 释 ： 结 果 发 出 、 结 果 解 释 和 临 床 管理 。 质 量 保 证 、 室 内 质 控 和 室 间 质 评 之 间 的关系 临 床 标 本 收 集 、 运 送 、 保 存及 其 质 量 控 制 n标 本 收 集 n标 本 保 存n标 本 运 送 标 本 收 集n标 本 采

8、 集 时 间 对 扩 增 检 测 结 果 的 影 响 n标 本 采 集 部 位 的 准 备 n标 本 的 类 型 和 采 集 量 n采 样 质 量 的 评 价 n采 样 及 运 输 容 器 n标 本 采 集 中 的 防 污 染 标 本 采 集 时 间 对 扩 增 检 测 结 果的 影 响n在 疾 病 发 展 过 程 中 ， 标 本 采 集 过 早 或过 晚 都 可 能 会 给 出 假 阴 性 结 果 。 标 本 采 集 部 位 的 准 备n血 液 标 本 采 集n分 泌 物 标 本 :采 集 部 位 的 清 洁 消毒 可 去 掉 污 染 的 微 生 物 或 其 它 杂物 ,但 应 适 度 ,过

9、 度 清 洁 消 毒 有 可能 会 去 掉 或 破 坏 靶 微 生 物 ,故 标本 采 集 部 位 的 准 备 应 由 训 练 有 素的 人 员 进 行 。 标 本 的 类 型 和 采 集 量n 标 本 的 类 型 : 血 清 (浆 )、 分 泌 物 、 痰 、 粪 便 、 尿和 脑 脊 液 等 。n 标 本 的 采 集 量 :应 根 据 所 测 病 原 体 而 定 。 一般 来 说 ， 如 果 标 本 的 量 对 病 原 体 培 养 够 用的 话 ， 则 其 量 亦 足 以 用 于 核 酸 提 取 及 其 后的 扩 增 检 测 。n 对 于 定 量 测 定 来 说 ， 对 标 本 的 收 集

10、 要 求 更为 精 确 。 采 样 质 量 的 评 价n血 清 (浆 )标 本 :溶 血 、 脂 血 等 ；n分 泌 物 、 痰 ： 评 价 内 容 包 括 细 胞 组 成 ，所 需 类 型 细 胞 的 数 量 和 核 酸 总 量 。 评 价 方 法 ： 包 括 肉 眼 观 察 ,显 微 镜 下 观察 和 化 学 分 析 等 。 采 样 及 运 输 容 器 n标 本 的 采 集 材 料 如 棉 签 应 为 一 次 性使 用 ；n采 样 及 运 输 容 器 应 为 密 闭 的 一 次 性无 菌 装 置 ；n采 样 所 用 的 防 腐 剂 、 抗 凝 剂 及 相 关试 剂 材 料 不 应 对 核

11、酸 扩 增 及 检 测 过程 造 成 干 扰 。 标 本 采 集 中 的 防 污 染 n采 集 中 要 特 别 注 意 污 染 ， 防 止 混 入操 作 者 的 头 发 、 表 皮 细 胞 、 痰 液 等 ；n 如 使 用 玻 璃 器 皿 ， 必 须 经 高 压 灭菌 ， 以 使 可 能 存 在 的 RNase失 活。 标 本 保 存 n靶 核 酸 (尤 其 是 RNA)易 受 核 酸酶 的 作 用 而 迅 速 降 解 ， 因 此 标本 的 保 存 对 于 核 酸 扩 增 测 定 的有 效 性 极 为 重 要 。 n使 用 G ITC作 为 稳 定 剂 保 存 标 本 ，标 本 可 在 室 温

12、 下 稳 定 约 7天 。 标 本 保 存n临 床 体 液 标 本 长 期 保 存 应 在 -70 下 。 n如 为 提 取 核 酸 后 用 于 DNA扩 增 分 析 的样 本 ， 可 于 10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.5 8.0)缓 冲 液 中 4 下 保 存 。 n用 于 RNA扩 增 分 析 的 样 本 ， 则 应 于 上述 缓 冲 液 中 -80 或 液 氮 下 保 存 。 n核 酸 的 乙 醇 沉 淀 物 则 可 于 -20 下 保 存 。 标 本 运 送 n样 本 一 经 采 集 ， 则 应 尽 可 能 快 的 送 至检 测 实 验 室 。n样 本

13、 中 如 加 入 了 适 当 的 稳 定 剂 ,如 用 于RNA测 定 加 入 GITC的 血 清 (浆 )样 本 和 用于 DNA测 定 的 EDTA抗 凝 血 等 ,则 可 在 室温 下 运 送 或 邮 寄 。n实 验 室 应 根 据 待 测 靶 核 酸 的 特 性 ， 对各 种 临 床 样 本 的 运 送 条 件 作 出 相 应 的规 定 。 临 床 基 因 扩 增 检 验 的 室 内 质 量 控 制n测 定 前 的 质 量 控 制n核 酸 样 本 的 制 备 及 其 质 量 控 制 n统 计 学 质 量 控 制n质 量 控 制 的 评 价 测 定 前 质 量 控 制n实 验 室 设 施

14、 、 仪 器 设 备 及 管 理n理 想 的 试 剂 和 操 作 方 法 n人 员 培 训 实 验 室 设 施 、 仪 器 设 备 及 管 理n临 床 基 因 扩 增 检 验 实 验 室 应 有 充 分 合理 的 空 间 、 良 好 的 照 明 和 空 调 设 备 ；n实 验 室 仪 器 设 备 应 保 养 良 好 ， 实 验 用品 要 达 到 相 应 的 要 求 。 加 样 器 的 校 准 ？带 滤 塞 吸 头 的 使 用 及 质 检 ？ 离 心 机 ？热 循 环 仪 ？ 水 浴 箱 和 /或 恒 温 干 浴 仪 ？酶 标 仪 和 洗 板 机 ？ 基因扩增仪器设备的质控仪器设备质控方法 频

15、度失控标准 扩增仪仪器校验实验当仪器移动时实验失败热电偶监测温度 扩增功能检测 每月一次 每4个月一次 如靶温度或温度差异超出允许范围 待测孔未出现扩增，检测温度程序打印每次测定时打印程序不对 加样器校准每年2次不符合要求水浴箱温度检测每次实验不符合要求 酶标仪预防性维护及校准每年2次不符合要求 带 滤 塞 吸 头 的 使 用 及 质 检n首 先 制 备 一 个 含 1 2%甘 油 及 色 素（ 如 甲 基 橙 ） 的 水 溶 液 ， 如 果 吸 头的 最 大 体 积 为 100l， 则 将 加 样 器吸 取 体 积 调 至 110 120l， 再 套 上吸 头 后 吸 取 上 述 有 色 液

16、 体 。 如 果 吸头 质 量 好 ， 则 有 色 液 体 不 应 出 现 在滤 塞 之 上 ， 否 则 说 明 滤 塞 不 严 。 带 滤 塞 吸 头 的 使 用 及 质 检n 用 实 验 来 检 验 带 滤 塞 吸 头 的 质 量 ： 先 纯 化 制 备 数份 强 阳 性 和 数 份 阴 性 核 酸 标 本 ， 然 后 将 加 样 器 吸取 量 设 至 扩 增 加 样 所 需 的 体 积 ， 使 用 待 评 价 带 滤塞 吸 头 对 一 份 强 阳 性 样 本 来 回 吸 取 10次 （ 模 拟 10份 阳 性 样 本 的 吸 取 ） ， 将 最 后 一 次 的 吸 取 液 加 至一 含

17、扩 增 反 应 液 的 管 中 ， 之 后 ， 换 一 个 新 吸 头 ，连 续 吸 取 10份 阴 性 样 本 分 别 至 10个 扩 增 反 应 管 中 ，此 过 程 重 复 3 5次 ， 最 后 对 每 一 管 按 所 用 试 剂 方法 进 行 扩 增 检 测 。 强 阳 性 样 本 应 为 强 阳 性 ， 阳 性弱 或 出 现 阴 性 则 说 明 吸 头 可 能 含 有 扩 增 抑 制 物 。所 有 阴 性 样 本 应 为 阴 性 ， 出 现 阳 性 则 表 明 吸 头 不能 有 效 地 防 止 气 溶 胶 对 加 样 器 的 污 染 。 核 酸 提 取 用 离 心 管 质 检n离 心

18、 管 PCR抑 制 物 质 检n其 他 扩 增 仪 孔 间 温 度 的 重 复 性 和 均 一 性的 检 测 方 法n 一 是 使 用 一 种 热 电 偶 探 针 、 微 伏 转 换 器 和 自 动 图 示记 录 仪 组 成 扩 增 加 热 模 块 孔 内 温 度 监 测 记 录 系 统 ，当 孔 间 温 度 变 异 超 出 1 时 ， 其 可 测 出 来 。n 具 体 做 法 是 将 装 有 TE缓 冲 液 并 上 加 石 蜡 油 的 扩 增 反应 管 放 置 于 扩 增 仪 各 孔 中 ， 热 电 偶 探 针 透 过 扩 增 反应 管 盖 插 至 缓 冲 液 中 ， 然 后 按 程 序 进

19、 行 一 个 常 规 的PCR扩 增 ， 加 热 模 块 如 为 96孔 ， 则 至 少 要 测 定 12孔 不同 位 置 孔 内 的 温 度 ， 在 整 个 扩 增 过 程 中 ， 可 移 动 热电 偶 探 针 至 上 述 不 同 孔 中 监 测 温 度 ， 但 每 一 孔 内 温度 监 测 至 少 要 有 一 个 扩 增 周 期 。 扩 增 仪 孔 间 温 度 的 重 复 性 和 均 一 性的 检 测 方 法n 第 二 种 方 法 并 非 直 接 测 定 孔 内 温 度 ， 而 是通 过 扩 增 功 能 来 间 接 获 知 孔 间 的 均 一 性 ，即 将 加 有 一 已 知 的 含 一

20、定 浓 度 的 阳 性 质 控样 本 的 扩 增 反 应 管 置 于 扩 增 仪 各 孔 中 按 常规 进 行 扩 增 检 测 ， 观 察 结 果 的 一 致 性 程 度 ，如 果 有 某 一 个 或 几 个 孔 结 果 有 问 题 ， 则 应确 定 这 一 个 或 几 个 孔 是 否 会 重 复 性 地 得 到假 阴 性 结 果 ， 如 果 是 ， 则 表 明 相 应 孔 的 热传 导 有 损 坏 。 理 想 的 试 剂 和 操 作 方 法 n试 剂 盒 的 质 检n定 量 测 定 的 精 密 度 是 测 定 组 成 步 骤 的变 异 和 的 平 方 根 (SD)= 上 式 中 SDa、 S

21、Db、 SDc是 步 骤 a、 b、 c等 （ 例 如 试 剂 准 备 、 标 本 采 集 、 核 酸提 取 、 扩 增 和 产 物 检 测 等 ） 的 标 准 差 ； SD SD SDa b c2 2 2 . 理 想 的 试 剂 和 操 作 方 法n改 善 测 定 精 密 度 的 措 施 必 须 首先 着 重 在 最 不 精 密 的 步 骤 上 ，应 对 试 剂 准 备 、 标 本 收 集 、 核酸 提 取 、 测 定 方 法 和 仪 器 操 作写 出 “ 标 准 操 作 程 序 ” (SOP) 人 员 培 训 n临 床 基 因 扩 增 检 验 的 操 作 主 要 是 标 本处 理 中 的

22、核 酸 提 取 步 骤 ， 这 其 中 所 涉及 的 又 主 要 是 加 样 器 的 使 用 ， 尽 管 操作 简 单 ， 但 由 于 均 为 微 量 操 作 ， 要 获得 稳 定 可 靠 的 测 定 结 果 ， 操 作 人 员 需要 一 定 的 专 业 技 术 知 识 和 经 验 .n知 其 然 又 知 其 所 以 然 。 核 酸 样 本 的 制 备 、 扩 增 检 测及 其 质 量 控 制n 一 般 核 酸 提 取 试 剂 促 使 靶 核 酸 从 细 胞 内 释出 的 原 理n 核 酸 的 分 离 纯 化n 靶 核 酸 提 取 的 质 量 n 临 床 标 本 及 核 酸 提 取 中 可 能

23、 存 在 的 抑 制 和干 扰 物 质 n 核 酸 样 本 制 备 及 扩 增 检 测 的 质 控 n 产 物 检 测 的 质 控 一 般 核 酸 提 取 试 剂 促 使 靶 核 酸从 细 胞 内 释 出 的 原 理n靶 核 酸 可 以 与 宿 主 细 胞 整 合 ， 核 内 游 离及 胞 浆 内 各 种 构 形 存 在 于 细 胞 内 ， 如 测定 的 是 病 原 微 生 物 ,则 靶 核 酸 存 在 于 细 菌 、病 毒 、 原 虫 或 真 菌 细 胞 内 ， 如 果 上 述 细胞 破 裂 ,则 靶 核 酸 亦 可 存 在 于 细 胞 外 。 n一 般 均 使 用 去 垢 剂 (如 Tri

24、ton-100)裂 解 细胞 ， 用 一 种 蛋 白 裂 解 酶 (如 蛋 白 酶 K)消化 结 合 于 核 酸 的 蛋 白 质 ， 从 而 将 靶 核 酸从 细 胞 内 释 放 出 来 。 核 酸 的 分 离 纯 化 n核 酸 的 分 离 纯 化 就 是 要 将 蛋 白 、 脂类 等 干 扰 核 酸 扩 增 的 物 质 去 除 。 n经 典 方 法n硅 吸 附 法n对 于 商 品 核 酸 提 取 试 剂 盒 ， 临 床 实验 室 在 使 用 前 ， 必 须 对 其 核 酸 提 取纯 度 和 效 率 进 行 评 价 。 临 床 标 本 及 核 酸 提 取 中 可 能 存 在 的抑 制 和 干

25、扰 物 质 n临 床 标 本 中 ： 血 清 或 血 浆 中 的 血 红 素及 其 代 谢 产 物 、 痰 中 酸 性 多 糖 和 糖 蛋白 成 份 、 降 解 靶 核 酸 的 核 酸 酶 等 。n核 酸 提 取 中 ： 许 多 试 剂 如 乙 二 胺 四 乙酸 (EDTA)、 去 垢 剂 如 十 二 烷 基 硫 酸 盐(SDS)和 chaotrope试 剂 如 异 硫 氰 酸 胍 和盐 酸 胍 等 、 酚 、 氯 仿 、 乙 醇 等 有 机 溶剂 。 对 临 床 标 本 中 可 能 存 在 的抑 制 /干 扰 物 的 质 控 措 施n质 控 措 施 ： 采 用 内 质 控（ internal

26、 control, IC）（ 通 常 称 为 内 标 ） 的 方 法 n内 标 有 两 种 ,即 竞 争 性 的 和 非 竞争 性 的 内 标 。 核 酸 提 取 及 扩 增 有 效 性 的 质 控 n 已 知 弱 阳 性 质 控 样 本 （ 基 质 与 待 测 标 本 相同 ） ： 至 少 带 1份 ， 其 最 后 的 检 测 结 果 ， 应是 核 酸 提 取 和 扩 增 检 测 的 有 效 性 的 综 合 反映 。n 已 知 阴 性 质 控 样 本 （ 基 质 与 待 测 标 本 相同 ） ： 至 少 带 1份 ， 扩 增 测 定 的 结 果 可 以 判断 核 酸 提 取 过 程 中 是

27、否 发 生 污 染 。 统 计 学 质 量 控 制 n理 想 的 室 内 质 控 样 本 的 条 件n测 定 中 质 控 样 本 的 设 置 、 数 量及 排 列 顺 序 n统 计 学 质 控 的 特 点 n统 计 质 控 方 法 理 想 的 室 内 质 控 样 本 的 条 件n 基 质 与 待 测 样 本 一 致 ；n 所 含 待 测 物 浓 度 接 近 试 验 的 决 定 性 水 平 ；n 稳 定 ；n 靶 值 或 预 期 结 果 已 定 ；n 无 已 知 的 生 物 传 染 危 险 性 ；n 单 批 可 大 量 获 得 ；n 价 廉 测 定 中 质 控 样 本 的 设 置 、 数 量及

28、排 列 顺 序n 每 次 检 测 究 竟 使 用 几 个 质 控 样 本 并 排 在 临 床 标本 中 的 哪 个 位 置 最 为 适 宜 ？ 从 理 论 上 说 ， 为 最大 可 能 地 检 出 实 验 的 随 机 和 系 统 误 差 ， 应 每 隔几 份 临 床 标 本 插 入 1份 质 控 样 本 ， 但 考 虑 国 内 目前 的 实 际 情 况 及 成 本 效 益 ， 一 般 来 说 ， 如 果 临床 基 因 扩 增 检 验 的 标 本 量 不 是 特 别 大 ， 定 性 测定 有 一 份 接 近 cut-off的 弱 阳 性 和 一 份 阴 性 质 控样 本 应 可 以 满 足 要

29、求 。 而 定 量 测 定 则 要 根 据 试验 的 测 定 范 围 ， 采 用 高 、 中 、 低 三 种 浓 度 的 质控 样 本 。 至 于 在 测 定 中 的 排 列 顺 序 ， 可 排 于 标准 品 或 校 准 品 之 后 ， 临 床 样 本 之 前 。 临 床 基 因 扩 增 检 验 室 内 质 控 的独 特 性n即 监 测 污 染 发 生 的 阴 性 质 控 的设 置 。 n应 该 包 括 1份 阴 性 原 血 清 样 本 、1份 在 标 本 核 酸 提 取 过 程 中 带 入的 一 个 空 管 和 仅 含 扩 增 反 应 混合 液 的 管 。 阴 性 原 血 清 质 控 样 本

30、 的 功 能 n监 测 实 验 室 的 以 前 扩 增 产 物 的污 染 ； n由 实 验 操 作 所 致 的 标 本 间 的 交叉 污 染 ；n扩 增 反 应 试 剂 的 污 染 。 在 标 本 核 酸 提 取 过 程 中 带 入 的 一 个空 管 的 功 能n基 本 功 能 与 阴 性 原 血 清 质 控 样 本相 同 ， 但 不 同 的 是 ， 其 基 质 为 水 ，不 含 阴 性 原 血 清 质 控 样 本 中 可 能有 的 扩 增 抑 制 物 ， 因 而 对 污 染 的反 映 更 为 灵 敏n不 能 取 代 原 血 清 阴 性 样 本 。 仅 含 扩 增 反 应 混 合 液 的 管

31、的 功 能n 监 测 扩 增 试 剂 是 否 发 生 污 染 ， 具 有 较 强 的污 染 鉴 别 性 。n 如 想 鉴 别 实 验 室 是 否 发 生 污 染 ， 可 将 一 个或 多 个 空 管 打 开 静 置 于 标 本 制 备 区 30 60分 钟 ， 然 后 加 入 扩 增 反 应 混 合 液 同 时 以 水替 代 核 酸 样 本 扩 增 ， 如 为 阳 性 ， 而 上 述 仅含 扩 增 反 应 混 合 液 的 管 为 阴 性 ， 则 说 明 实验 室 以 前 扩 增 产 物 的 存 在 。 统 计 学 质 控 的 特 点 n 检 验 误 差 有 两 类 ， 一 是 系 统 误 差

32、， 一 是 随 机误 差 。n 系 统 误 差 通 常 表 现 为 质 控 物 测 定 均 值 的 漂 移 ，是 由 操 作 者 所 使 用 的 仪 器 设 备 、 试 剂 、 标 准品 或 校 准 物 出 现 问 题 而 造 成 的 ， 这 种 误 差 可以 通 过 前 述 的 措 施 方 法 加 以 控 制 ， 是 可 以 排除 的 。n 随 机 误 差 则 表 现 为 测 定 SD的 增 大 ， 主 要 是 由实 验 操 作 人 员 的 操 作 等 随 机 因 素 所 致 ， 其 出现 难 以 完 全 避 免 和 控 制 。 统 计 学 质 控 的 功 能n统 计 学 质 控 的 功 能

33、 就 是 发 现 误 差 的 产生 及 分 析 误 差 产 生 的 原 因 ， 采 取 措 施予 以 避 免 。n开 展 统 计 质 量 控 制 前 ， 应 将 可 以 控 制的 误 差 产 生 因 素 尽 可 能 地 加 以 控 制 ，这 不 但 是 做 好 室 内 质 控 的 前 提 ， 也 是保 证 常 规 检 验 工 作 质 量 的 先 决 条 件 。 统 计 质 控 方 法 n 基 线 测 定n 质 控 规 则 的 表 达 方 式 及 定 义 n Levey-Jennings质 控 图 方 法 n Levey-Jennings质 控 图 结 合 Westgard多 规 则质 控 方

34、法 n 累 积 和 (CUSUM) 质 控 方 法 n “ 即 刻 法 ” 质 控 方 法 基 线 测 定n 最 佳 条 件 下 的 变 异 （ Optimal conditions variance, OCV） 和 常 规 条 件 下 的 变 异（ Routine conditions variance, RCV） ； n 当 RCV与 OCV接 近 ， 或 小 于 2 OCV时 ， 则RCV是 可 以 接 受 的 。 以 上 为 批 间 变 异 。n 批 内 变 异 的 测 定 ；n 室 内 质 控 物 的 测 定 准 确 度 的 评 价 。 临 床 基 因 扩 增 检 验 IQC统 计计

35、 算 问 题n可 使 用 质 控 样 本 扩 增 后 的 拷 贝 数/ml或 IU/ml来 进 行 统 计 计 算 ， 也 可用 其 对 数 值 进 行 。n由 于 基 因 扩 增 结 果 的 原 始 数 据 通 常很 大 ， 故 使 用 其 对 数 值 来 进 行 质 控统 计 分 析 可 能 要 更 为 方 便 一 些 。 质 控 规 则 的 表 达 方 式 及 定 义 n质 控 规 则 的 表 达 方 式 n质 控 规 则 的 功 能 n常 用 质 控 规 则 的 符 号 及 定 义 质 控 规 则 的 表 达 方 式n 通 常 质 控 规 则 以 符 号 AL来 表 示 ， 其 中 A

36、为 质 控 测 定中 超 出 质 量 控 制 限 的 测 定 值 的 个 数 ， L为 控 制 限 ，通 常 用 均 值 或 均 值 1 3SD来 表 示 。 n 当 质 控 测 定 值 超 出 控 制 限 L时 ， 即 可 将 该 批 测 定 判为 失 控 。 n 常 用 的 13S质 控 规 则 ， 其 中 1为 原 式 中 的 A， 3s为 原 式中 的 L， 表 示 均 值 3s， 其 确 切 的 含 义 为 ： 在 质 控测 定 值 中 ， 如 果 有 一 个 测 定 值 超 出 均 值 3s范 围 ，即 可 将 该 批 测 定 判 为 失 控 。 质 控 规 则 的 功 能 n简

37、单 地 说 就 是 用 于 判 断 测 定批 的 失 控 还 是 在 控 。 常 用 质 控 规 则 的 符 号 及 定 义 符 号 定 义n 12S 一 个 质 控 测 定 值 超 出 2s控 制 限 。n 13S 一 个 质 控 测 定 值 超 出 3s控 制 限 。n 22S 两 个 连 续 的 质 控 测 定 值 同 时 超 出 +2s或 2s控 制 限 。n R4S 同 一 批 测 定 中 ， 两 个 不 同 浓 度 质 控 物 的 测 定 值 之 间 的 差 值 超 出 4s控 制 限 。 n 41S 四 个 连 续 的 质 控 测 定 值 同 时 超 出 +1s或 1s控 制 限

38、 。n 7T 七 个 连 续 的 质 控 测 定 值 呈 现 一 个 向 上 或 向 下 的 趋 势 变 化 。n 10X 十 个 连 续 的 质 控 测 定 值 同 时 处 于 均 值 （ ） 的 同 一 侧 。 Levey-Jennings质 控 图 方 法 n也 称 Shewhart质 控 图 ， 是 由 美 国 的Shewhart 于 1924年 首 先 提 出 ， 并 用 于工 业 产 品 的 质 量 控 制 。n二 十 世 纪 五 十 年 代 初 ， Levey-Jennings将 其 引 入 临 床 检 验 的 质 量 控 制 。 经Henry和 Segalove的 改 良 ，

39、即 为 目 前 常用 的 Levey-Jennings质 控 图 。 Levey-Jennings质 控 图 Levey-Jennings质 控 图基 本 的 统 计 学 含 义n 稳 定 条 件 下 ， 在 20个 IQC结 果 中 不 应 有 多 于1个 结 果 超 过 2SD（ 95.5%可 信 限 ） 限 度 ； 在1000个 测 定 结 果 中 超 过 3SD（ 99.7%可 信 限 ）的 结 果 不 多 于 3个 。n 如 以 3s为 失 控 限 ， 假 失 控 的 概 率 为 0.3%。 质 控 图 的 记 录n质 控 结 果n日 期n试 剂n质 控 物 批 号 和 含 量n测

40、定 者 姓 名 等 。 Levey-Jennings质 控 图 方 法 的 特 点n 优 点 ： 简 单 明 了n 缺 点 ： 以 2s为 失 控 限 ， 假 失 控 的 概 率 太 高 ， 通 常不 能 接 受 。 以 3s为 失 控 限 ， 假 失 控 的 概 率 低 ， 但 误 差检 出 能 力 不 强 。 Levey-Jennings质 控 图 结 合Westgard多 规 则 质 控 方 法 n Westgard多 规 则 质 控 方 法 即 是 将 前 述 的 多 个 质 控规 则 同 时 应 用 进 行 质 控 判 断 的 方 法 。n 最 初 常 用 的 有 六 个 质 控 规

41、 则 ， 即 12S、 13S、 22S、R4S、 41S和 10X， 其 中 12S规 则 作 为 告 警 规 则 。n 13S和 R4S规 则 反 映 的 是 随 机 误 差 。 22S、 41S和 10X反映 的 是 系 统 误 差 ， 系 统 误 差 超 出 一 定 的 程 度 ， 也可 从 1 3S和 R4S规 则 反 映 出 来 。 Westgard多 规 则 质 控 方 法 的 特 点n在 Levey-Jennings质 控 图 方 法 的 基础 上 产 生 ， 具 有 Levey-Jennings 质控 图 方 法 的 优 点 ， 可 通 过 相 似 的 质控 图 来 进 行

42、分 析 。 n假 失 控 和 假 告 警 概 率 低 。 n误 差 检 出 能 力 增 强 。 累 积 和 (CUSUM) 质 控 方 法n累 积 和 (CUSUM) 质 控 方 法 于1977年 由 Westgard等 提 出 ,对 系统 误 差 有 较 好 的 测 出 能 力 。 常 用 的 累 积 和 (CUSUM) 质 控 规 则 质 控 规 则 起 动 累 积 和 计 算 的 阈 值 （ k） 质 控 限 （ h） 1.0s 2.7s 1.0s 3.0s 0.5s 5.1sCS ss0.1 7.2CS ss0.1 0.3CS ss5.01.5 累 积 和 (CUSUM) 质 控 图

43、“即 刻 ” 质 控 方 法 n “即 刻 法 ” 的 实 质 是 一 种 统 计 学方 法 ,即 Grubs异 常 值 取 舍 法 n只 要 有 3个 以 上 的 数 据 即 可 决 定是 否 有 异 常 值 的 存 在 。 室 内 质 控 数 据 的 评 价 n IQC为 一 集 体 活 动 ， 除 实 际 测 定 者 外 ， 还 应有 另 外 一 人 对 测 定 数 据 进 行 质 检 。n 不 能 将 IQC作 为 一 个 监 察 方 法 ， 当 发 现 一 次测 定 未 达 到 质 量 标 准 时 ， 应 以 建 设 性 的 而非 批 评 的 方 式 去 探 查 失 控 的 原 因

44、。n 除 了 将 IQC数 据 作 为 日 常 质 控 外 ， 还 应 定 期评 价 累 积 数 据 以 监 测 在 测 定 操 作 中 的 长 期变 化 趋 势 。n 评 价 应 定 期 进 行 。 弱 阳 性 质 控 样 本 常 见 的 失 控 原 因 n 核 酸 提 取 中 的 随 机 误 差 。 如 核 酸 提 取 中的 丢 失 、 有 机 溶 剂 的 去 除 不 彻 底 、 标 本 中扩 增 抑 制 物 的 残 留 等 。 n 仪 器 的 问 题 。 如 扩 增 仪 孔 间 温 度 的 不 均一 性 、 孔 内 温 度 与 所 示 温 度 的 不 一 致 性 等 。 n 试 剂 的

45、问 题 。 如 Taq酶 和 /或 逆 转 录 酶 的失 活 、 探 针 的 纯 度 及 标 记 效 率 和 核 酸 提 取试 剂 的 效 率 等 。 阴 性 质 控 样 本 的 失 控 原 因 n主 要 为 扩 增 产 物 的 “ 污 染 ” 和 /或 临 床 标 本 的 核 酸 提 取 过 程 中发 生 的 标 本 间 的 交 叉 “ 污 染 ” . IQC的 局 限 性n 在 免 疫 测 定 中 IQC可 能 测 不 出 的 误 差 n 测 定 前 测 定 中 测 定 后 样 本 鉴 定 不 对 样 本 吸 取 不 对 结 果 记 录 错 误 样 本 贮 存 中 变 质 试 剂 加 入

46、不 对n 此 类 误 差 的 发 生 率 在 不 同 的 实 验 室 有 所 不 同 ， 一般 要 求 小 于 0.1%， 且 应 均 衡 地 分 布 于 测 定 前 、 测定 中 和 测 定 后 的 不 同 阶 段 。 影 响 临 床 基 因 扩 增 检 验 结 果 的最 关 键 因 素n产 物 “ 污 染 ” （ Carry-over)n测 定 人 员 的 操 作 ： 标 本 混 淆 ； 贴 错标 签 、 核 酸 提 取 等n试 剂 避 免 基 因 扩 增 检 验 假 阳 性 结 果 的 措 施n 严 格 的 实 验 室 分 区 ；n 使 用 带 “ 滤 心 ” 的 吸 头 ；n 设 立

47、“ 阴 性 ” 质 控 （ 与 标 本 同 时 处 理 ） ；n 使 用 防 “ 污 染 ” （ 含 UNG） 的 PCR试 剂 ；n 临 床 “ 假 阳 性 ” 问 题 ： 病 原 微 生 物 如 结 核杆 菌 经 药 物 治 疗 后 已 死 亡 ， 但 PCR仍 可 为 阳性 ， 故 治 疗 结 束 后 至 少 两 周 内 不 宜 做 PCR检测 。 避 免 基 因 扩 增 检 验 假 阴 性 结 果 的 措 施n 避 免 由 于 来 自 于 标 本 的 血 红 蛋 白 、 肝 素 、某 些 激 素 或 来 自 标 本 处 理 中 的 去 垢 剂 、 有机 溶 剂 的 抑 制 作 用 的

48、措 施 ： 纯 化 核 酸 ； 标本 重 复 双 份 测 定 ； 稀 释 标 本 。n 使 用 “ 内 质 控 ” （ Internal Control,IC)以 避免 由 于 试 剂 、 扩 增 仪 或 标 本 处 理 不 当 所 致的 假 阴 性 ； 须 注 意 的 是 ， 如 果 靶 浓 度 很 高 ，可 致 在 靶 核 酸 和 IC之 间 产 生 竞 争 ， 而 使 IC受 抑 制 ， 此 时 IC可 为 阴 性 。 室 间 质 量 评 价 （ EQA）n EQAn Proficiency testing (PT) EQA 的 程 序 设 计n 确 定 质 评 方 案 ,定 期 发 放

49、 质 评 样 本 ；n 要 求 参 加 质 评 实 验 室 报 告 结 果 的 单 位 要 一致 ， 以 便 于 统 计 ；n 报 告 要 清 楚 、 简 洁 ； n 要 求 参 评 实 验 室 在 测 定 EQA样 本 时 ， 要 以与 常 规 样 本 完 全 相 同 的 方 式 测 定 ； n 对 测 定 方 法 、 试 剂 及 仪 器 等 归 纳 总 结 ；n 对 参 评 实 验 室 的 测 定 要 有 评 价 ； n EQA报 告 要 迅 速 及 时 。 EQA质 评 样 本 n样 本 特 征 与 患 者 样 本 应 尽 量 一 致n样 本 浓 度 与 试 验 的 临 床 应 用 相

50、适 应n在 样 本 发 放 的 条 件 下 稳 定n不 存 在 不 可 避 免 的 传 染 危 险 性 EQA靶 值n定 性 测 定 ， 应 为 明 确 的 阴 性 或 阳 性n定 量 测 定 ， 则 提 供 参 考 方 法 值 或 参加 实 验 室 的 修 正 均 值 或 参 考 实 验 室均 值 或 方 法 或 归 组 的 方 法 均 值 评 价 方 法n 特 定 参 评 实 验 室 的 评 分 根 据 其 与 其 它 实 验 室 得 分 之间 的 关 系 ， 可 分 为 绝 对 评 分 和 相 对 评 分 两 种 模 式 。 n 绝 对 评 分 就 是 根 据 已 定 的 靶 值 对 参

51、 评 实 验 室 测 定 的每 份 质 评 样 本 计 分 ， 然 后 再 计 算 该 次 质 评 的 总 分 ，以 得 分 的 高 低 评 价 参 评 实 验 室 的 水 平 。 n 相 对 评 分 则 是 将 参 评 实 验 室 质 评 得 分 与 所 有 参 评 实验 室 的 平 均 分 进 行 比 较 ， 观 察 其 得 分 在 全 部 参 评 实验 室 中 所 处 的 位 置 。 相 对 评 分 和 绝 对 评 分 的 例 子n相 对 评 分 ： 英 国 NEQAsn绝 对 评 分 ： 美 国 CAP 采 用 何 种 评 分 方 法 较 好 ？n 建 立 一 个 质 评 体 系 ，

52、上 述 绝 对 评 分 和 相 对评 分 的 方 法 均 可 以 采 用 ， 其 实 质 内 容 并 无太 大 的 差 别 ， 只 不 过 是 表 现 形 式 的 不 同 ，尤 其 是 在 定 量 测 定 。 从 室 间 质 量 评 价 对 改善 实 验 室 测 定 质 量 的 作 用 来 看 ， 究 竟 是 采用 上 述 哪 一 种 或 另 外 制 定 的 评 价 方 法 其 实并 不 重 要 ， 关 键 是 要 有 一 个 评 价 方 法 ， 从而 以 其 为 标 准 去 评 价 实 验 室 的 测 定 。 EQA对 测 定 技 术 的 评 价n使 用 适 当 的 统 计 学 方 法n全 面 地 对 方 法 、 试 剂 和 单 个 参 评 实 验室 测 定 技 术 进 行 评 价n指 明 严 重 误 差n适 当 时 评 价 测 定 的 其 它 方 面 （ 如 测 定干 扰 ） 。 EQA的 局 限 性n参 评 实 验 室 没 有 同 等 的 对 待 EQA样本 和 患 者 样 本n可 能 会 妨 碍 给 出 不 同 结 果 的 改 良 方法 的 发 展n在 不 同 的 EQA程 序 中 ， 对 实 验 室 的评 价 可 能 不 同 谢 谢！