基因克隆(包括DNA提取技术步骤)

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1、基因克隆DNA 克隆是指在体外将目的基因或 DNA 片段同能够自我复制的载体 DNA 连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过 程，又称为重组DNA技术。DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的 DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞 技术和重组子筛选技术等。一 DNA的提取二目的DNA片段的获得（酶切）三体外重组1 LB培养基的配制2大肠杆菌感受态细胞的制备3载体的选择四导入受体细胞五重组子的筛选1插入失活法实验一 DNA 提取取 0.5 克以下的鱼类组织或 20ul 血液：1准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织

2、放入离心管，破碎。（常温操作） 2恒温箱裂解，55C。30min。3加等体积Tris饱和酚（酚：氯仿：异戊醇25： 24： 1），先颠倒混匀后静置抽提 10分钟，离心4度12000g 10分钟。（注意酚在油层下面）4取上清（把枪头去掉部分，注意液面。蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位 于上层水相中），加入等体积CI（氯仿：异戊醇24： 1），先颠倒混匀后静置抽提10 分钟，离心 4 度 12000g 10分钟。5汇集上清，加2倍无水乙醇（-30度保存），颠倒混匀可观察到絮状DNA。在-30 度冰箱沉淀30min。离心4度12000g 10分钟。6弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离

3、心5分钟。7 重复一次上述操作。7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。8 溶解于 200ulddwater。9 定量 DNA。裂解液的配制1ml 体系200ul0.5M EDTA（PH=8.O高压灭菌。作用抑制酶的活性螯合 DNA 酶发挥作用需要的金属离子50ul10%SDS （蛋白质变性剂）10ul1MTris-cl（PH=8.0 高压灭菌）缓冲溶液5ulPK （消化）735ul灭菌超纯水EDTA(0.5 M，pH8.0)将186.1 g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H20）加入800ml水中，在磁 力搅拌器上剧烈搅拌。用NaOH调节pH值至8.0 （约需20g NaOH颗粒），定容至

4、1L。 分装后高压蒸汽灭菌。 EDTA 二钠盐加入 NaOH 将溶液的 pH 值调至接近 8.0 时， 才会溶解。实验二目的DNA片段的获得（酶切）获得了包含目的基因在内的DNA,这些DNA或来自于目的生物基因组DNA 或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链cDNA。由于基因组DNA较大，不 利于克隆，必须将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法是核酸限制性 内切酶消化。仪器：台式离心机 、 恒温水浴 、取液器、 电泳仪 、电泳槽、 紫外观测仪 试剂EcoRI,Hi nd III酶,DNA 样品（浓度 0.3|jg/|jl） 1X TAE 缓冲液。操作（一）EcoR I单酶切。1, 取1支

5、干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入（ul）灭菌水13EcoRI缓冲液 2DNA43ugEcoRI110U20ul 体系。2, 37C保温14小时，也可过夜。3, 保温结束后65-70C10min灭活酶（如为热稳定性酶，则用氯仿抽提）。4，取10pl左右的反应液加入1卩1电泳加样缓冲液，电泳。目的片段回收。 注意：1,样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒。2, 加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀。 3，反应体系的体积要尽量少，要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10。 4，为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板 DNA 的浓度应很高，因此

6、如 底物DNA浓度过低则应进行真空浓缩。实验三 LB 培养基的配制LB 培养基是- 一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。含有酵母提取物、 蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源、能源和磷酸盐，蛋白胨主 要提供氮源，NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝 固剂。琼脂在常用浓度下96C时溶化。琼脂在40T时凝固（高压灭菌融化琼脂 糖），通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气 温不同而有所不同。LB培养基用来培养细菌，将其pH调至中性或微碱性，利于细菌生长繁殖。器材和试剂酵母提取物，蛋白胨，NaCl，琼脂，氨苄青霉素（Amp）； lmol

7、/L NaOH； 锥形瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，细菌培养皿，培养基分装器，天平，牛角匙，高 压蒸汽灭菌锅，pH试纸，记号笔，纱布，封口胶。1000ml体系LB液体培养基：参考分子克隆实验指南在 950 ml 去离子水中加入 :胰化蛋白胨 （bacto-typtone）10g ，酵母提取物 （bacto-yeast extract） 5g ，NaCl10g摇动容器直至溶质溶解 .用1mol/LNaOH （大约1ml ）调pH至74 （适合E.coli的生长） 用去离子水定容至 1L.在 15psi 高压下蒸汽灭菌 20min. （全过程需要 2 小时）锡箔。常温保存。 氨节青霉素（Amp），用无菌

8、水配制成50mg/mL溶液，置-20C冰箱保存。LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉。1. 称量 按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl 10g. 放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。2在烧杯中加入950 ml去离子水，摇动容器直至溶质溶解用1mol/LNaOH （800ul）调pH至7.4，再用去离子水定容至1L。转移到试剂瓶中再加入 加15g琼脂粉。高压灭菌。2抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到55 C时（手可触摸）在超净台加入 1/500 体积 50mg/ml 抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并 充分摇匀。一定要在温度降下之前

9、加好抗生素，并且倒好板。（类似琼脂 糖制胶）3. 倒板：一般 10ml 倒 1 个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外 下照 10-15 分钟。4. 保存：用封口胶封边，并 倒置放于4C保存，一个月内使用。1kg=1000g 1g=1000mg 1mg=1000ug 1ug=1000ng试验四 大肠杆菌感受态细胞的制备 (超净台)细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化(Transforma tion )是指质粒DNA或以它为载体的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0C, CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷 酸复合物粘附于细

10、胞表面，经42C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。 将细菌放置在非选择性液体培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新 表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在含氨苄青霉素的选择性固体培养基上。 【仪器、材料与试剂】(一)仪器1. 超净UV工作台 2.低温4C离心机 3.恒温摇床37C 180rpm/min4. -80C冰箱 5.恒温水浴器(二)材料1. 氯化钙(CaCl) 2.LB培养基(液体)3大肠杆菌DH5a (kit) 4. 50mL离心管25. 吸嘴、小指管 6.试管、培养皿、锥形瓶等 ( 三 ) 试剂1. 0.05 mol/L CaCl溶液(分子量110.98 )灭菌后4C

11、保存。22. 氨苄青霉素(Amp),用无菌水配制成50mg/mL溶液，置-20C冰箱保存。3. LB液体培养基。大肠杆菌感受态细胞的制备1. 从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于含有5 mL LB液体培养基的试管中， 37 Co 180rpm/min振荡培养过夜。2. 取5 mL菌液转接到一个含有100 mL LB液体培养基1000ml锥形瓶中，37C 180rpm/min 振荡培养 90min。3将菌液转移到冰预冷的50 mL离心管中，冰上放置10 min。4. 4C,离心 10 min(4 000 r/min),回收细胞。 5倒出培养液，将管倒置1 min以便培养液流尽。6. 用冰冷的0.0

12、5 mol/L CaCl 20mL悬浮沉淀，立即放在冰上保温10 min。27. 4C 4 000 r/min，离心 10 min，回收细胞。8. 用冰冷的2 mL 0.05mol/L CaCl 悬浮细胞(务必放冰上)。加入甘油至终浓度2 为15%；9. 使用1.5ml离心管分装细胞，每200 ul 份。此细胞为感受态细胞。-80C保 存备用。本实验使用生物公司感受态大肠杆菌 DH5a。本实验使用克隆载体质粒是 PGEM(R)-3ZF(+) VECTOR载体的选择基因工程的载体应具有一些基本的性质：1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的 DNA 片 段得以扩增。2）分子

13、量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源 DNA 片段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因 Amp），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限 制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型 的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。（蓝白斑法）DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage）， 柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ss

14、DNA phage ），噬粒载 体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC ）等。从总体上讲，根据载体的使用 目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。T7 1EcoRI Sac I Kpnl Aval Smal Bam HI Xbal Sall Accl Hindi Pstl Sphl HindlllY寸莒8僉rttast1 5511362890846 9122223334455 6PGEM（R）-3ZF（+） VECTOR 酶切位点及复制起始点。本实验使用克隆载体质粒是PGEM(R)-3ZF(+) VECTOR规格目录号数量价貉况;pGEl奨就個 20lle&81P2

15、251pGE? E JZff-j V?z toi- 20?说明:pGEMZfi；+用pGEM-3Zf-) 旣血由冈!営衍生 而来含有丝状噬菌牡坨的复制起点口载体上的(3-半乳糖昔齬的肽編码医中有塞克隆位点容克隆位点旁边还含有EF师TTRN一谋合酶启动子门)o选用合适的E. mil菌株(比如尽；i於)就能通过蓝白筛选的方法把萤肚插入失活的重组克隆克接鉴别出来哆克隆位点区域含有一些单一的限制性位点 如EcoRI： Saci KpnZ: Aval SmL.BamHL Xbal7 Sail, Acd, Hindi； Pstl7 SphllKHiiidino pGEM- 迄f(-)和pGEMT药-就悻除

16、了 fl起点的方向外苴它都呈-亠样的口 阂此可以作为标准克隆载体体外转录的樓板也可用于制备环化sDNAo特点 蓝白谎选:能方便地鉴定重组克隆“ 通便此载怀能用于标堆克隆 車谨OXA制备以及在与冬克隆区威相连的5P3和T- RX_碌合酶启动子的作用下进行体外转录口 方便总克隆区域的具有劣种限制性内切煎位点在克隆时可选_择多种限制性SSn操作手AB編号pGE?&-3ZfH Tschnizi! Bullstm TBOS pGEM&-3Zz(-) VKtor Izlmkal Bullet in IB045 储存条件载祥储存于二忧细議菌株储存于-?兀口 GsnBatikg E?-.L AccBtotiX

17、uinba-： .-)X65306; 口 X30实验五 体外重组体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切 酶能够切割 DNA 分子形成有粘性末端，用同一种酶切割载体的多克隆位点便可 获得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通过 T4 DNA 连接酶的作用便可形成 重组体，此为粘末端连接。当目的 DNA 片断为平端，可以直接与带有平端载体 相连，此为平末端连接，但连接效率比粘端相连差些。外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，重新组合的DNA叫重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经 酶切的载体分子与外源DNA分

18、子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接 酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分 子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特 性，使两个平末端的双链DNA分子连接起来。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4 DNA连接酶与辅助 因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶-AMP复合物再结合到具有5 -磷酸基和3， -羟基切口的DNA上 .使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起 来。连接反应的温度在37时有利于连接酶的活性。但在这个温度下，粘性末端 的氢键结合是不稳定的。实验温

19、度选择在12-16C，连接12-16 h（过夜），既可最 大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用a互补现象 进行筛选是最常用的一种鉴定方法。载体具有一段大肠杆菌0半乳糖苷酶的启动 子及其编码肽链的DNA序列，此结构称为lacZ，基因。lacZ基因编码的a肽 链是0 半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各 自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的0 半乳 糖苷酶分子。lacZ基因编码的a肽链与失去了正常氨基端的0半乳糖苷酶突变 体互补，这种现象称为a互补。由a互补而形成的

20、有功能活性的0半乳糖苷酶， 可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-0 -D-半乳糖苷）显色测定出来，它能将无色的 化合物X-ga l切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lacZ 基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种 0 半乳糖苷酶突变的大肠杆菌 细胞后，便会产生出有功能活性的0半乳糖苷酶，在IPIG（异丙基硫代0 -D-半乳 糖苷）诱导后，在含有X-ga l的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段 插入到位于lacZ中的多克隆位点后，就会破坏a肽链的ORF，从而不能合成与受 体菌内突变的0半乳糖苷酶相互补的活性a肽，而导致不能形成有功能活性的0 半乳

21、糖苷酶，含有重组质粒载体的克隆是白色菌落。（一）设备1.恒温摇床 2.恒温水浴器 3.恒温培养箱 4.台式离心机 5.低温离心机 （二）材料I. 胰蛋白胨2.酵母提取物3.氯化钠（NaCl） 4.氨苄青霉素5.氯化钙（CaCl ）26.二甲基甲酰胺7.限制性内切酶8. T4 DNA连接酶9.大肠杆菌II. PGEM（R）-3ZF（+） VECTOR 12.培养皿 13.接种针14.玻璃涂棒 15.试管 16.酒精灯 17.镊子、牙签等 （ 三 ） 试剂13 mol/L KAc（pH 5.2） （分子量98.14 ）高压灭菌，常温保存。2. X-gal:将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20 m

22、g/mL，不需过滤灭菌，分装小 包装，避光贮存于-20C。3. IPTG：取2 g IPTG溶于8 mL双蒸水中，再用双蒸水补至10 mL,用0.22卩滤膜 过滤除菌，每份1 mL,贮存于-20C。（一）质粒DNA的制备：PGEM（R）-3ZF（+） VECTOR 。（二）制备重组DNA1. 在灭菌的Eppendor f管中，质粒酶切。2. 在另一无菌Eppendorf管中，全基因组酶切。3. 反应完毕后各取2酶解液做电泳分析。基因组做胶回收。-20C保存。4. 余下的质粒酶解液加入1/10体积的3 mol/L KAc（pH 5.2）溶液，再加2倍体积的 无水乙醇（-20C保存），-20C冰箱

23、，2h （沉淀DNA）。12 000 r/min 4C离心15 min，弃上清，加常温70%乙醇洗沉淀物，再离心，去上清，真空干燥后，加50 L 灭菌水。连接试验20u l体系超净水7酶切质粒5酶切DNA510XBuffer2T4 DNA连接酶 1PCR仪上14 C过夜。 在琼脂糖上观察连接产物，对照组是质粒酶切产物和基因组酶切产物。实验六 转化实验载体 DNA 分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在 原核细胞（如大肠杆菌）中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增， 最终获得大量的重组DNA分子。将外源重组DNA分子导入原核宿主细胞的方法有转化（transformati

24、on）， 转染（transfection）,转导（transduction）。重组质粒通过转化导入到宿主细 胞中，同样重组噬菌体DNA可以通过转染技术导入。2. 在200ul新制备的感受态细胞中，加入5ul连接产物，混匀，冰上放置30 min。 同时做一个对照管。受体菌对照：200受态细胞+5ul无菌双蒸水。3将管放到42 C水浴，1-2 min。4. 冰上放置1-2 min。5. 每管加800L LB液体培养基（轻轻混匀），37C温育45 min。慢摇。6. 在预制的LB琼脂平板上，加40L 20 mg/mL X-gal和4L 200 mg/mL IPTG 溶液，并用灭菌玻璃推子（酒精灯上烧

25、后冷却），均匀涂布于琼脂凝胶表面。7. 200ul己转化的感受态细胞均匀涂在上面的培养皿上。将平皿放置37C温箱30 min，至液体被吸收。8倒置平皿37C培养12-16 h，出现菌落。实验七 重组子的筛选从不同的重组 DNA 获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克 隆的过程就是筛选。插入失活法 外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或0-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗 生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非 重组子。本实验使用 0-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法。白色菌斑为目的菌斑。上述方法获得的阳性克隆最后要进行测序分析，以最终确认目的基因。