标记免疫分析ppt课件

l 体外分析技术是一组超微量体外分析技术的总称，它是利用某种特异性结合剂与被测物和标志物进展结合反响，从而对极微量物质进展定量分析的分析技术。l 1960年Berson和Yalow初次运用放射免疫分析法RIA测定胰岛素，开创了生物活性物质微量测定的新时代，是微量分析方法学上的一大突破。本章主要以RIA为例引见这类方法的根本原理及方法特点。l一、根本原理：放射免疫分析一、根本原理：放射免疫分析radio immunoassay，RIA是体是体外放射分析技术中建立最早、运用外放射分析技术中建立最早、运用最广的一类技术，其根本原理为竞最广的一类技术，其根本原理为竞争性抑制。即：放射性标志抗原和争性抑制。即：放射性标志抗原和非标志抗原包括规范抗原或待测非标志抗原包括规范抗原或待测抗原共同与特异性抗体发生可逆抗原共同与特异性抗体发生可逆性结合，如图性结合，如图8-1。这种竞争可用以。这种竞争可用以下反响式来表达：下反响式来表达：l 式中Ag*代表标志抗原，Ag代表非标志抗原，Ab代表特异性抗体，Ag*Ab代表标志抗原抗体复合物，AgAb代表非标志抗原抗体复合物。0 20 40 80 160 320 待1 待2抗原抗体的结合反响遵照质量作用定律，抗原抗体的结合反响遵照质量作用定律，即：即：当反响到达平衡时，当反响到达平衡时，k1AgAb=k2AgAb。设。设KA为平衡结为平衡结合常数，也称亲和常数，那么有：合常数，也称亲和常数，那么有：k1和k2分别代表结合速度常数和解离速度常数，Ag、Ab、AgAb分别代表游离抗原、游离抗体和抗原抗体复合物的浓度。假设Ab0和Ag0分别代表抗原、抗体的初始浓度，B和F分别代表反响平衡时结合和游离抗原的%，以分数表示，B+F=1，可以推导出B的函数式，由上式可看出是以由上式可看出是以B为函数的一元二次方程。为函数的一元二次方程。对每一特定的对每一特定的RIA系统，系统，Ab0和和KA是固定的，是固定的，*Ag0也是固定的，所以也是固定的，所以B在直角坐标上随非标志在直角坐标上随非标志 Ag0呈双曲线走向。呈双曲线走向。二、根本试剂二、根本试剂一、抗体一、抗体antibody(1)、抗体的制备：抗体是体外放射、抗体的制备：抗体是体外放射分析中运用最广的结合剂，是用纯化分析中运用最广的结合剂，是用纯化的免疫原免疫动物制备而得，免疫的的免疫原免疫动物制备而得，免疫的成败在于免疫原和动物种类以及注射成败在于免疫原和动物种类以及注射途径、佐剂的运用、注射剂量和时间途径、佐剂的运用、注射剂量和时间等。等。分子量超越5000的蛋白多肽物质具有较好的免疫原性，容易刺激高活度的抗体构成。分子量小于5000的肽类物质免疫原性低，需求与载体蛋白结合方能引起明显的抗体构成。应该指出，动物对抗原的免疫反响个体差别很大，当一批动物用同样的免疫原和免疫程序进展免疫时，往往只需部分动物产生称心的反响。2抗血清抗血清antiserum的质量鉴定：的质量鉴定：评价结合剂的主要目的有滴度、特异性和评价结合剂的主要目的有滴度、特异性和亲和力。亲和力。1滴度测定：滴度测定：测定方法是将抗血清稀测定方法是将抗血清稀释成不同浓度，分别参与一定量的标志释成不同浓度，分别参与一定量的标志抗原，在适当的反响条件下到达平衡后，抗原，在适当的反响条件下到达平衡后，分别分别B与与F，计算不同稀释度的抗血清与，计算不同稀释度的抗血清与标志抗原的结合百分率，以结合百分率标志抗原的结合百分率，以结合百分率为纵坐标，以抗血清稀释度为横坐标，为纵坐标，以抗血清稀释度为横坐标，绘制抗血清稀释曲线如图。绘制抗血清稀释曲线如图。选择结合率为50%时所对应的稀释度，作为该结合剂的稀释度，该稀释度即为滴度。抗体滴度越高阐明抗体的质量越好。2特异性测定：抗血清的特异性是特异性测定：抗血清的特异性是指抗体与待测物以外的构造类似物指抗体与待测物以外的构造类似物结合的程度又称交叉反响率。结合的程度又称交叉反响率。交叉反响百分率交叉反响百分率 =Y50/Z50100%其中其中Y50为被测物结合率为被测物结合率50%时的浓度值；时的浓度值；Z50为构造类似物结为构造类似物结合率合率50%时的浓度值。干扰轻者特时的浓度值。干扰轻者特异性高。异性高。3亲和力和亲和常数测定：亲和力表亲和力和亲和常数测定：亲和力表示特定的抗原、抗体之间的结合才干，示特定的抗原、抗体之间的结合才干，常用亲和常数常用亲和常数KA来表示。来表示。KA越大，表越大，表示抗原、抗体之间结合才干越强，示抗原、抗体之间结合才干越强，B/F值大，方法的灵敏度高。值大，方法的灵敏度高。随着单克隆抗体随着单克隆抗体monoclonal antibody，McAb技术的开展，提高技术的开展，提高了现代体外分析技术的特异性和亲和力。了现代体外分析技术的特异性和亲和力。二、放射性标志物二、放射性标志物 放射性标志物是体外放射分析的丈放射性标志物是体外放射分析的丈量根据，常用的标志核素有量根据，常用的标志核素有125I和和3H。对标志物的质量要求包括：对标志物的质量要求包括：1比活度比活度specific activity：体外：体外放射分析法的定量范围普通在放射分析法的定量范围普通在10-9-10-12mol程度，标志物的用量应等于或小于程度，标志物的用量应等于或小于被测物的最小量，以得到较好的灵敏度。被测物的最小量，以得到较好的灵敏度。高比活度的标志物是确保分析方法灵敏高比活度的标志物是确保分析方法灵敏度的前提。度的前提。2放化纯度放化纯度radiochemical purity：普通要求标志物的放化纯度在普通要求标志物的放化纯度在95%以上，以上，假设放射性杂质过多，规范曲线的斜率降假设放射性杂质过多，规范曲线的斜率降低，将会影响测定的灵敏度。低，将会影响测定的灵敏度。3免疫活性免疫活性immune activity：标志：标志物在标志和储存等过程中会呵斥损伤，使物在标志和储存等过程中会呵斥损伤，使标志抗原的免疫活性下降，与抗体发生反标志抗原的免疫活性下降，与抗体发生反响的才干减弱，甚至丧失，因此抗原活性响的才干减弱，甚至丧失，因此抗原活性的检测非常重要。要求标志抗原与待测抗的检测非常重要。要求标志抗原与待测抗原具有一样的免疫活性。原具有一样的免疫活性。4稳定性稳定性stability：稳定性是目的志抗原在合理储存的条稳定性是目的志抗原在合理储存的条件下，坚持其全部性能不变的程度。许多件下，坚持其全部性能不变的程度。许多要素可影响其性能的稳定性，如标志方法、要素可影响其性能的稳定性，如标志方法、标志位置、置换程度、理化环境等都可使标志位置、置换程度、理化环境等都可使放射性核素从标志抗原的分子上零落下来，放射性核素从标志抗原的分子上零落下来，或呵斥标志分子聚合或解离，使放化纯度或呵斥标志分子聚合或解离，使放化纯度明显下降。当标志方法合理，保管条件完明显下降。当标志方法合理，保管条件完善时，货架期可达善时，货架期可达1-3月。月。三、规范品三、规范品calibration standard 规范品是样品定量的根底，它的质规范品是样品定量的根底，它的质和量的变化会直接影响样品的测定值。和量的变化会直接影响样品的测定值。对规范品的要求包括：对规范品的要求包括：1规范品与待测物质应属同一物质；规范品与待测物质应属同一物质；2在与结合剂发生反响时，应与待测在与结合剂发生反响时，应与待测配体有相等的活性和亲和力；配体有相等的活性和亲和力；3高度纯化，不含影响分析的杂质；高度纯化，不含影响分析的杂质；4规范品的定量一定要准确。规范品的定量一定要准确。四、分别技术四、分别技术 在放免分析中，当抗原、抗体反响在放免分析中，当抗原、抗体反响到达平衡后，必需将到达平衡后，必需将B与与F分别，分别分别，分别测定其放射性。理想的分别技术应兼备测定其放射性。理想的分别技术应兼备以下几点：以下几点：1将将B与与F尽能够完全分尽能够完全分别，并且不改动最初的平衡形状；别，并且不改动最初的平衡形状；2B与与F的分别不易受血浆或血清等外界的分别不易受血浆或血清等外界要素的干扰；要素的干扰；3分别试剂廉价易得，分别试剂廉价易得，操作简便、分别迅速、反复性好。几种操作简便、分别迅速、反复性好。几种常用的分别技术引见如下：常用的分别技术引见如下：一沉淀法一沉淀法precipitation method 也称也称PEG法。溶解于水中得蛋白质，法。溶解于水中得蛋白质，其分子周围有水化层，以此坚持蛋白质其分子周围有水化层，以此坚持蛋白质在水中得稳定性，蛋白质分子吸水才干在水中得稳定性，蛋白质分子吸水才干的大小取决于蛋白质分子电荷的多少。的大小取决于蛋白质分子电荷的多少。在普通RIA中，反响体系PH值多为中性附近，接近蛋白质的等电点，球蛋白所带的电荷很少，构成水化层的才干较弱，当参与适当浓度的聚乙二醇或碱金属中性盐如硫酸胺等夺取其周围的水分子，使它失去水化层，从而将抗体球蛋白B沉淀下来，与游离部分的抗原分别。这种分别方法的优点是操作简便，分别迅速，价钱低廉，但是，这种方法易受环境温度、pH值、离子强度和蛋白质含量的影响，并且有些抗原也能够被同时沉淀下来，所以，非特异性结合高。二双抗体法二双抗体法double antibody method 在在RIA中，当抗原、抗体反响到达平衡中，当抗原、抗体反响到达平衡后，由于抗原抗体复合物的浓度很低，而后，由于抗原抗体复合物的浓度很低，而且处于可溶性形状，不能直接经过离心的且处于可溶性形状，不能直接经过离心的方法加以分别。于反响体系中参与第二抗方法加以分别。于反响体系中参与第二抗体，构成抗原体，构成抗原-第一抗体第一抗体-第二抗体复合物，第二抗体复合物，经过离心将经过离心将B与与F别分开来。双抗体法为一别分开来。双抗体法为一种特异性的分别方法，非特异性结合低，种特异性的分别方法，非特异性结合低，但主要缺陷是分别时间长，第二抗体用量但主要缺陷是分别时间长，第二抗体用量多等。多等。AgAb1Ab2 Ag Ab1 Ab1 Ab2Ag Ab1 Ab2三双抗体三双抗体-PEG法法double antibody-PEG method 这种方法是目前被广泛采用的一种方法，它兼这种方法是目前被广泛采用的一种方法，它兼顾了双抗体法和顾了双抗体法和PEG法各自的优点，抑制了双抗法法各自的优点，抑制了双抗法分别时间长和沉淀法非特异性结合高的缺陷，并且分别时间长和沉淀法非特异性结合高的缺陷，并且使第二抗体和使第二抗体和PEG的用量大为减少，在常温参与分的用量大为减少，在常温参与分别剂后，无需温育，直接离心，可获得称心的结果。别剂后，无需温育，直接离心，可获得称心的结果。四吸附分别法四吸附分别法adsorptive separation method 运用经过特殊处置的吸附剂，将游离的小分子运用经过特殊处置的吸附剂，将游离的小分子抗原或半抗原吸附，经过离心，随着吸附剂的沉淀，抗原或半抗原吸附，经过离心，随着吸附剂的沉淀，将将F沉淀下来，而抗原沉淀下来，而抗原-抗体复合物分子大，不被吸抗体复合物分子大，不被吸附，仍保管在溶液中，从而将附，仍保管在溶液中，从而将B与与F别分开。常用的别分开。常用的吸附剂有葡聚糖包被的活性炭吸附剂有葡聚糖包被的活性炭DCC，离子交换，离子交换树脂等。树脂等。五固相分别法五固相分别法 这种分别法是将抗原或抗体经过特殊技术结这种分别法是将抗原或抗体经过特殊技术结合在固相载体上，免疫反响在固相载体上完成，合在固相载体上，免疫反响在固相载体上完成，到达平衡后构成固相的抗原到达平衡后构成固相的抗原-抗体复合物，可与抗体复合物，可与游离部分分别。固相分别技术的方法较多，比如，游离部分分别。固相分别技术的方法较多，比如，试管固相法：将抗体试管固相法：将抗体IgG直接包被于试管底部，直接包被于试管底部，运用时将非标志抗原和标志抗原参与试管，抗原运用时将非标志抗原和标志抗原参与试管，抗原与包被在管底的抗体结合到达平衡後，弃去上清与包被在管底的抗体结合到达平衡後，弃去上清F，洗涤后测定反响管，洗涤后测定反响管B的放射性即可。的放射性即可。固相分别技术的主要优点是操作简便、迅速，分固相分别技术的主要优点是操作简便、迅速，分别效果好，非特异性结合低，是一种比较有出路别效果好，非特异性结合低，是一种比较有出路的分别方法。的分别方法。六磁化分别技术六磁化分别技术magnetizing separation technique 磁化分别法是将磁化资料引入磁化分别法是将磁化资料引入RIA体系，体系，当反响到达平衡后，借助磁力将当反响到达平衡后，借助磁力将B与与F分别，分别，从而省去了离心的步骤。从而省去了离心的步骤。七微孔滤膜法七微孔滤膜法millipore filter method 微孔滤膜法通常采用醋酸纤维素滤膜或玻微孔滤膜法通常采用醋酸纤维素滤膜或玻璃纤维素滤膜，在放免反响到达平衡后，将反璃纤维素滤膜，在放免反响到达平衡后，将反响液参与装有微孔滤膜的滤器上，抗原抗体复响液参与装有微孔滤膜的滤器上，抗原抗体复合物保管在滤膜上，游离部分被滤掉。合物保管在滤膜上，游离部分被滤掉。五、数据处置规范曲线拟合五、数据处置规范曲线拟合 RIA的数据处置是以规范品的检测的数据处置是以规范品的检测结果为根据，拟合出规范曲线，再经过结果为根据，拟合出规范曲线，再经过规范曲线求出待测样品的浓度值，规范规范曲线求出待测样品的浓度值，规范曲线是衡量样品的客观尺度。规范曲线曲线是衡量样品的客观尺度。规范曲线的拟合方式要慎重选择，使它可以真实的拟合方式要慎重选择，使它可以真实的反响丈量的结果，减少人为要素的引的反响丈量的结果，减少人为要素的引入。目前常用的方式为数学模型法。入。目前常用的方式为数学模型法。1、Logit-Log模型模型 Logit-Log转换是使转换是使双曲线直线化的最常用方法。它是将规双曲线直线化的最常用方法。它是将规范品浓度转换成范品浓度转换成Log浓度，作为横坐标，浓度，作为横坐标，而把而把B转换成转换成LigitB，LigitB=LogBx/B0-Bx。其中。其中B0是是0剂量结合率，剂量结合率，Bx是任何剂量为是任何剂量为X时的结合率如图：时的结合率如图：可以看出，这是一条随剂量添加而下降的直线。这种方法的缺陷是：由于剂量取对数，0剂量在拟合时不用，所以灵敏度有损失；假设反响系统不是理想方式，用本方法处置将有较大偏向。2、四参数Logistic模型 四参数Logistic模型是国际原子能机构IAEA和世界卫生组织WHO引荐的数据处置模型，是对Logit-Log模型的开展。其通式为：其中X是抗原剂量，Y是结合%，a、b、c、d为四个参数。对RIA来说，a可取实验所得的最大结合率B0，b可取同一批数据用Logit-Log法作线性回归所得的斜率，c可取使B0下降一半所需抗原浓度ED50，d可取实验所得NSB。四参数Logistic模型的图形如图：3、其他拟合模型、其他拟合模型 如四参数单位点作用模型的稳定如四参数单位点作用模型的稳定性较好，个别规范管出现坏点对拟合性较好，个别规范管出现坏点对拟合结果的影响较小；还有二次多项式拟结果的影响较小；还有二次多项式拟合法、折线拟合法等。该当指出，不合法、折线拟合法等。该当指出，不论采用何种数学模型进展曲线拟合，论采用何种数学模型进展曲线拟合，实验的结果应该是一样的或相近的，实验的结果应该是一样的或相近的，都不能改善实验过程低劣所带来的影都不能改善实验过程低劣所带来的影响。响。六、六、RIA的分析误差和质量控制的分析误差和质量控制 RIA是一类高灵敏度的超微量分析技术，易受各种要素的影响而使检测结果失真。因此，质量控制体系应包括消费及运用两个重要环节。作为消费厂家，应建立严厉的质量检测程序，以保证进入市场的产品都符合质量要求，这是首要环节。作为用户那么应建立严厉的质量控制体系，以保证检测的质量。根据不同的目的，质量控制体系可分为实验室内部质量控制和实验室间质量评价。一误差的来源一误差的来源 按误差发生的统计学性质可将其分为：按误差发生的统计学性质可将其分为：1、系统误差、系统误差systematic error 这种误差这种误差常表现为检测结果呈倾向性的偏高或偏低，常表现为检测结果呈倾向性的偏高或偏低，是一些可以确定的要素导致的。是一些可以确定的要素导致的。1方法误差，如规范品稀释体积不正确；方法误差，如规范品稀释体积不正确；2仪器和试剂误差，如仪器形状不佳；量仪器和试剂误差，如仪器形状不佳；量器不准；器不准；3操作误差，如不正确的操作习惯等。操作误差，如不正确的操作习惯等。系统误差是可以经过努力消除的。系统误差是可以经过努力消除的。2、随机误差、随机误差random error 这种误差是这种误差是由偶尔要素所引起，误差的出现是随机的，由偶尔要素所引起，误差的出现是随机的，与真值的偏向是双向的。常见的缘由如加与真值的偏向是双向的。常见的缘由如加样误差，由分别剂或离心机呵斥的错分误样误差，由分别剂或离心机呵斥的错分误差等。差等。二实验室内部质量控制二实验室内部质量控制internal quality control 实验室内部质量控制偏重对检测质量实验室内部质量控制偏重对检测质量的控制，它保证从搜集样本开场到发出报的控制，它保证从搜集样本开场到发出报告为止的全过程中，能及时发现检测过程告为止的全过程中，能及时发现检测过程中出现的各种误差，分析产生的缘由，找中出现的各种误差，分析产生的缘由，找出纠正的方法，以确保检测的质量。常用出纠正的方法，以确保检测的质量。常用的评价目的有精细度、准确度、特异性、的评价目的有精细度、准确度、特异性、灵敏度、稳定性、有效性。灵敏度、稳定性、有效性。1、精细度、精细度precision 精细度是指在一样精细度是指在一样的条件下，对某一样品多次检测所得结果的的条件下，对某一样品多次检测所得结果的符合程度，即反复性。符合程度，即反复性。RIA系统的精细度是系统的精细度是首先和随时应思索的，是最重要的质量参数。首先和随时应思索的，是最重要的质量参数。评价方法如下：评价方法如下：1、规范误差、规范误差SD和变异系数和变异系数2、准确度、准确度accuracy 准确度是指测定值与真值的符合程度。准确度是指测定值与真值的符合程度。考核符合程度的实际往往需求多份测定的考核符合程度的实际往往需求多份测定的结果进展计算。准确度、精细度之间的关结果进展计算。准确度、精细度之间的关系：系：1准确度、精细度均好。准确度、精细度均好。2准确度较好，精准确度较好，精细度差。细度差。3准确度差，精细度好。准确度差，精细度好。4准确度、准确度、精细度均差。精细度均差。实验室内常用回收实验，健全性实验，实验室内常用回收实验，健全性实验，“零程零程度测定等评价方法的准确度。度测定等评价方法的准确度。附回收率附回收率recovery rate的测定：的测定：1回收率：回收率是反响测定值偏向的质控回收率：回收率是反响测定值偏向的质控目的，测定方法是设回收管和对看管，对看管目的，测定方法是设回收管和对看管，对看管中参与待测样品，回收管中参与待测样品和知中参与待测样品，回收管中参与待测样品和知量的分析物，经过测定全过程，比较知量和测量的分析物，经过测定全过程，比较知量和测得量之间的一致程度，实际上回收率普通为得量之间的一致程度，实际上回收率普通为90%-110%之间，回收率的计算方法：之间，回收率的计算方法：2质控样品的运用：质控样品的运用：1质量控制样品质量控制样品quality control sample为了更加准确的对样本进展定为了更加准确的对样本进展定量，我们运用质量控制样品，它是含有量，我们运用质量控制样品，它是含有一种或几种测定物其量值是经过标定一种或几种测定物其量值是经过标定的靶值，用来比较和评价测定系统的的靶值，用来比较和评价测定系统的偏向和反复性的实验用血清。偏向和反复性的实验用血清。2对质控样品的要求：对质控样品的要求：A、质控样品中的分析物应与待测样品、质控样品中的分析物应与待测样品具有一样的生物学活性和免疫原性，其具有一样的生物学活性和免疫原性，其他组成成分也尽量一样。他组成成分也尽量一样。B、质控样品中分析物的浓度应是准确定量的，、质控样品中分析物的浓度应是准确定量的，并且应有一个合理的浓度范围，普通根据患者和并且应有一个合理的浓度范围，普通根据患者和正常人血清中被测物的浓度，制定高、中、低三正常人血清中被测物的浓度，制定高、中、低三个剂量程度，高者应小于规范曲线的最大剂量点，个剂量程度，高者应小于规范曲线的最大剂量点，中者应为规范曲线的中间剂量点，低者应大于规中者应为规范曲线的中间剂量点，低者应大于规范曲线的最小剂量点，这样能更好得发现整个检范曲线的最小剂量点，这样能更好得发现整个检测范围内出现的变化，准确判别误差的性质和大测范围内出现的变化，准确判别误差的性质和大小。小。C、在合理储存的条件下，能长时间保管而不影、在合理储存的条件下，能长时间保管而不影响其性能，以便监控测定系统的远期重现性。响其性能，以便监控测定系统的远期重现性。D、质控样品的管数约为总样品管数的平方根，、质控样品的管数约为总样品管数的平方根，运用时将其分置于待测样本的不同位置。运用时将其分置于待测样本的不同位置。3、灵敏度灵敏度sensitivity灵敏度是指刚能灵敏度是指刚能与零规范管的测定结果在统计学上区别开与零规范管的测定结果在统计学上区别开来的最低浓度，即用该方法的最小可测值。来的最低浓度，即用该方法的最小可测值。计算方法是累积多批普通为计算方法是累积多批普通为10次丈量次丈量结果，计算出零规范管的结合率为结果，计算出零规范管的结合率为x-2SD时时对应的剂量值，即为灵敏度。由此可见，对应的剂量值，即为灵敏度。由此可见，灵敏度和精细度有一定的关系，当精细度灵敏度和精细度有一定的关系，当精细度好时，零规范管的结合率较高，对应的浓好时，零规范管的结合率较高，对应的浓度值较小，最小可测值较小，即灵敏度较度值较小，最小可测值较小，即灵敏度较高。高。4、稳定性、稳定性stability 稳定性是指测定试稳定性是指测定试剂在合理保管和正确运用的条件下。在规剂在合理保管和正确运用的条件下。在规定的有效期内，坚持其全部性能不变。常定的有效期内，坚持其全部性能不变。常用目的有：用目的有：1零规范结合率：是指在没有未标志配零规范结合率：是指在没有未标志配体存在下，由标志配体与结合剂之间产生体存在下，由标志配体与结合剂之间产生的最大结合率，实际上不应低于的最大结合率，实际上不应低于33%，这，这个目的主要用来反响结合剂的质量，它在个目的主要用来反响结合剂的质量，它在整个有效期内应坚持稳定。整个有效期内应坚持稳定。2非特异性结合率：它是指在没有结合非特异性结合率：它是指在没有结合剂的存在下，标志配体被分别试剂结合呵剂的存在下，标志配体被分别试剂结合呵斥的结合率，由于检测过程中的种种缘由，斥的结合率，由于检测过程中的种种缘由，非特异性结合总会或多或少地存在，普通非特异性结合总会或多或少地存在，普通应控制在应控制在5%以下。以下。5、特异性、特异性specificity：特异性是指特异性是指该反响体系不受干扰物质影响的程度，该反响体系不受干扰物质影响的程度，反映的是对分析物测定的专注程度。交反映的是对分析物测定的专注程度。交叉反响率越小，反响体系对分析物测定叉反响率越小，反响体系对分析物测定的专注性越好。的专注性越好。6、有效性、有效性affectivity：有效性主要有效性主要是指临床诊断符合率及临床运用评价。是指临床诊断符合率及临床运用评价。检测结果能有效地实现实验目的，应有检测结果能有效地实现实验目的，应有可信的正常值及正常范围，在正常和异可信的正常值及正常范围，在正常和异常之间应有良好的分别，以便得出结论，常之间应有良好的分别，以便得出结论，如有些要作有或无、阳性或阴性的回答，如有些要作有或无、阳性或阴性的回答，有些要确定浓度的高低等。有些要确定浓度的高低等。应该指出，上面提到的各种质控目应该指出，上面提到的各种质控目的，对于全面评价检测系统的质量及检的，对于全面评价检测系统的质量及检测者的操作程度虽然是必要的，然而在测者的操作程度虽然是必要的，然而在实验室常规检测任务中，要完成如此众实验室常规检测任务中，要完成如此众多的质控目的是不能够的，也是没有必多的质控目的是不能够的，也是没有必要的。通常可根据实践需求和实验室条要的。通常可根据实践需求和实验室条件，选择数项质控目的用于批内质量控件，选择数项质控目的用于批内质量控制和批间质量控制。制和批间质量控制。三实验室外部质量评价三实验室外部质量评价external quality control 实验室外部质量评价是对各实验室之间实验室外部质量评价是对各实验室之间的测定结果按一致的评价方案及方法比较分的测定结果按一致的评价方案及方法比较分析，发现误差，找出缘由，提出改良方法，析，发现误差，找出缘由，提出改良方法，以提高各实验室之间所得结果的可信性和可以提高各实验室之间所得结果的可信性和可比性。外部质量评价要在做好内部质量控制比性。外部质量评价要在做好内部质量控制的根底上才干进展。通常是根据任务需求，的根底上才干进展。通常是根据任务需求，由一个担任单位来指点，提出方案及要求，由一个担任单位来指点，提出方案及要求，提供实施外部质量评价用的一致样品，分发提供实施外部质量评价用的一致样品，分发至各参与单位进展检测，然后将所得结果反至各参与单位进展检测，然后将所得结果反响给担任单位进展整理分析，对各有关单位响给担任单位进展整理分析，对各有关单位的检测质量进展评价，促进检测质量的提高的检测质量进展评价，促进检测质量的提高和资料的可比性。和资料的可比性。免疫放射分析是利用过量放射标志抗体来测定样品中的抗原或半抗原。所用的标志抗体是过量的，抗原全部是非标志的，所以反响系统是非竞争性的全量反响。为了与放射免疫分析法相区别，它的开创人Miles一开场就将其命名为免疫放射分析immunoradiometric assay，IRMA并不断沿用到如今。一、根本原理一、根本原理 放射性核素标志在抗体上，然后以过量标志抗体与抗原结合，多余的抗体经过一定手段除去，测定复合物的放射性，其活度与待测抗原的量呈正相关。由于不存在竞争反响，其灵敏度明显高于RIA。如下式表式：IRMA中要分别的是游离抗体和复合物，中要分别的是游离抗体和复合物，都是大分子，普通分别方法难以奏效，目前都是大分子，普通分别方法难以奏效，目前主要靠单克隆抗体作分别剂。也就是每一主要靠单克隆抗体作分别剂。也就是每一IRMA系统至少要有两个抗体，一个起分别作系统至少要有两个抗体，一个起分别作用，一个起丈量作用。所以，一个用，一个起丈量作用。所以，一个IRMA方法方法的建立，至少需求两个抗原决议簇，对很多的建立，至少需求两个抗原决议簇，对很多小分子半抗原不适用。小分子半抗原不适用。一一IRMA同样遵照质量作用定律同样遵照质量作用定律 IRMA的函数式也是双曲线，假设以的函数式也是双曲线，假设以B为为纵坐标，它们是随抗原量添加而上升的曲线。纵坐标，它们是随抗原量添加而上升的曲线。二、二、IRMA的丈量范围宽的丈量范围宽 抗体含量越大，那么欲到达饱和时抗体含量越大，那么欲到达饱和时所需求的抗原更多，这阐明丈量范围宽。所需求的抗原更多，这阐明丈量范围宽。但标志抗体过高，游离抗体的量也增多，但标志抗体过高，游离抗体的量也增多，分别时将有明显的分别误差，使分别时将有明显的分别误差，使NSB升升高，低浓度抗原的丈量精细度降低。所高，低浓度抗原的丈量精细度降低。所以标志抗体的最正确浓度应经过实验来以标志抗体的最正确浓度应经过实验来选择。选择。三、三、IRMA和和RIA的主要区别：的主要区别：二、二、IRMA分类分类 一、双抗体夹心法一、双抗体夹心法double antibody sandwich method 此法采用固相抗体来替代经典的固相抗此法采用固相抗体来替代经典的固相抗原的原的IRMA法，固相抗体先与待测物或规范法，固相抗体先与待测物或规范品结合，再与标志的另一抗体反响，构成品结合，再与标志的另一抗体反响，构成固相抗体固相抗体-抗原抗原-标志抗体复合物，未结合抗体标志抗体复合物，未结合抗体留在上清液中被弃去，测固相放射性。如下留在上清液中被弃去，测固相放射性。如下式表示：式表示：上式中的上式中的Ab1、*Ab2分别作为抗原上二个抗原分别作为抗原上二个抗原决议簇的单抗，决议簇的单抗，SP表示固相。表示固相。二、标志双抗法二、标志双抗法labeled double antibody method 标志抗体即为夹心法中那个标志抗体的抗体，亦即双抗，这样设计是为了简化标志每一特异性抗体，只需标志这个双抗体，即可作为通用示踪剂，例如用125I标志了兔抗鼠的IgG，那么一切运用非固相的鼠抗体作为第二抗体的，均可用此标志的抗抗体作为示踪剂，如下式表示：三、双标志抗体法三、双标志抗体法double labeled antibody method 有些构造复杂的抗原有有些构造复杂的抗原有3个或更个或更多个抗原决议簇，为此，可以用两个多个抗原决议簇，为此，可以用两个标志抗体进展标志抗体进展IRMA分析，以提高复分析，以提高复合物的放射性比活度，从而提高方法合物的放射性比活度，从而提高方法灵敏度和精细度。最后构成的标志复灵敏度和精细度。最后构成的标志复合物见以下图：合物见以下图：三、数据处置三、数据处置 采用计算机数学模型的方法进展处置，常采用计算机数学模型的方法进展处置，常用的数学模型包括：三参数单位点质量定律数用的数学模型包括：三参数单位点质量定律数学模型、五参数学模型、五参数Logistic模型、线性内插模型等。模型、线性内插模型等。四、免疫放射分析的特点四、免疫放射分析的特点 一示踪剂一示踪剂 IRMA法中的示踪剂为标志抗体，是一种法中的示踪剂为标志抗体，是一种IgG蛋白分子，含有多个酪氨酸或组氨酸残基，蛋白分子，含有多个酪氨酸或组氨酸残基，易被放射性碘化，目前示踪剂的标志多用固相易被放射性碘化，目前示踪剂的标志多用固相氧化剂碘化法，如氧化剂碘化法，如Iodogen法等，很少影响其免法等，很少影响其免疫活性，标志率可达疫活性，标志率可达70%左右。左右。二反响动力学二反响动力学 质量作用定律以为反响速度与反响物的浓质量作用定律以为反响速度与反响物的浓度呈正比，在度呈正比，在IRMA中标志抗体是过量的，且中标志抗体是过量的，且反响是非竞争性的，抗原抗体是全量反响，故反响是非竞争性的，抗原抗体是全量反响，故反响速度比反响速度比RIA法快，普通反响法快，普通反响2-3小时即达平小时即达平衡，当天出结果。衡，当天出结果。三灵敏度三灵敏度 IRMA的灵敏度比的灵敏度比 RIA有明显的提高，有明显的提高，约为约为10-100倍，这在某些分析工程中具有倍，这在某些分析工程中具有重要意义。如甲状腺功能主要目的有三重要意义。如甲状腺功能主要目的有三项，即项，即FT3、FT4的放免测定和的放免测定和TSH的的IRMA测定，测定，IRMA测定测定TSH能可靠的区能可靠的区分正常人和甲亢病人血清分正常人和甲亢病人血清TSH含量的差含量的差别，只需别，只需TSH低于正常，低于正常，FT3或或FT4任一任一项高于正常即可诊断为甲亢，在复杂情项高于正常即可诊断为甲亢，在复杂情况下，况下，TRH实验时实验时TSH高于正常，应否高于正常，应否认甲亢。认甲亢。四规范曲线的任务范围四规范曲线的任务范围 中选择的标志抗体质和量适当，中选择的标志抗体质和量适当，IRMA的任务范围宽。普通情况下，待测的任务范围宽。普通情况下，待测物含量低者不用浓缩，高者不用稀释，物含量低者不用浓缩，高者不用稀释，给临床检测带来方便，也防止了由于浓给临床检测带来方便，也防止了由于浓缩和稀释带来的误差。缩和稀释带来的误差。五特异性五特异性IRMA运用的固相抗体和标志抗体是分别运用的固相抗体和标志抗体是分别针对抗原的两个抗原决议簇的单抗，不针对抗原的两个抗原决议簇的单抗，不易发生交叉反响，因此特异性高。易发生交叉反响，因此特异性高。六方法的稳健性六方法的稳健性在免疫反响中，有些抗原抗体间的亲和常在免疫反响中，有些抗原抗体间的亲和常数数KA有明显的温度依赖性，降低温度有有明显的温度依赖性，降低温度有利于利于KA值的提高，有利于添加灵敏度。值的提高，有利于添加灵敏度。根据质量作用定律，当抗体的浓度大于根据质量作用定律，当抗体的浓度大于1/KA，KA的影响就明显减少。的影响就明显减少。IRMA中中Ab0总是过量的，温度对总是过量的，温度对KA的影响较小，的影响较小，普通在普通在4-37的温度改动对实验结果无明的温度改动对实验结果无明显影响，所以显影响，所以IRMA常采用常采用37温育，反温育，反响平衡时间明显缩短。方法的稳健性好。响平衡时间明显缩短。方法的稳健性好。七七IRMA的主要缺陷的主要缺陷 IRMA对蛋白和多肽抗原的检测是优对蛋白和多肽抗原的检测是优越的。但它的典型的两位点夹心法需求越的。但它的典型的两位点夹心法需求二个抗原决议簇的抗原，这就大大地限二个抗原决议簇的抗原，这就大大地限制了对短肽及其它半抗原活性物的检测。制了对短肽及其它半抗原活性物的检测。在体外分析方法中，除了放射免疫分析和免疫放射分析外，还包括其它非放射性核素标志的免疫分析。如酶标志免疫分析，化学发光免疫测定，稀土元素标志的免疫分析法等。它们与前者一样，都是利用抗原与抗体的结合具有高度特异性这一重要特性，而不同之处只是利用的标志示踪物不同，因此其标志物的测定方法也不同。它们除了与前者同样具有高度特异性及敏感性外，还抑制了放射性核素能够呵斥的环境污染，保管期短等缺陷，因此得到了广泛的运用。一、酶标志免疫分析法一、酶标志免疫分析法 酶标志免疫分析法酶标志免疫分析法enzyme immunoassay，EIA是以酶替代放射性核是以酶替代放射性核素标志抗体或抗原作为主要试剂的免疫测定素标志抗体或抗原作为主要试剂的免疫测定法。它是将抗原抗体结合的高度特异性与酶法。它是将抗原抗体结合的高度特异性与酶促反响的高度敏感性有机的结合起来，用酶促反响的高度敏感性有机的结合起来，用酶标志抗体抗原，检测待测标本中的未知标志抗体抗原，检测待测标本中的未知抗原抗体，当相应的抗原抗体特异性结抗原抗体，当相应的抗原抗体特异性结合后，参与相应的酶的底物，酶可以高效专合后，参与相应的酶的底物，酶可以高效专注催化和分解底物，生成有颜色的产物。根注催化和分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的有无和深浅，可以判别待测标本中据颜色的有无和深浅，可以判别待测标本中有无特异性抗原抗体以及量的多少。本有无特异性抗原抗体以及量的多少。本实验是一种敏感、特异、简便，只需普通光实验是一种敏感、特异、简便，只需普通光谱分析仪器的微量测定技术。谱分析仪器的微量测定技术。二、化学发光免疫分析法二、化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析法chemiluminescences immunoassay，CLIA，是以化学发光物质替代放射性核素作为示踪剂，将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高度特异的抗原抗体反响结合起来的一种超微量的分析法。其特点是：设备简单，试剂稳定，无放射性污染，自动化程度高。三、稀土元素标志的免疫分析法三、稀土元素标志的免疫分析法 稀土元素即镧系元素，其中有铕Eu、钛Tb、钐Sm、和镝Dy四种元素能发射离子荧光，这些稀土元素的螯合物，可以与抗原抗体结合，所以又称镧系荧光免疫分析。此螯合剂上的稀土元素在紫外光的激发下，可产生继续一定时间，一定光峰的荧光。而其它非特异性荧光寿命很短，待其衰减后，丈量镧系元素的特异性荧光，可以完全排除背景荧光的干扰，此法又称时间分辨荧光免疫分析time-resolved fluoimmunoassay，TrFIA。本法操作方便，灵敏度高，特异性强，无放射性，标志物稳定性好，制备简单并可长期保管，加之曲线剂量宽，自动化程度高分析系统类似放免法等优点，深受生物医学任务者的高度注重，目前国外消费的TRFIA 试剂盒包括甲状腺激素、类固醇激素，病毒性肝炎标志物、肿瘤相关抗原、蛋白质类、药物、多肽类和蛋白质类激素等，它们在根底医药学和临床医学各领域的运用，必将推进生物学检测技术的进一步开展，成为新一代标志免疫分析技术中的一支生力军。四、其它免疫分析法四、其它免疫分析法 其它免疫分析法如半抗原标志的免疫分析法，免疫PCR技术等同窗们自学。