生物化学试验基础

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1、生 物 化 学 实 验第一节第一节 生生 物物 化化 学学 实实 验验 绪绪 论论 1)生物化学生物化学实验实验不同于化学和生物学不同于化学和生物学实验实验，而有其独特的，而有其独特的实验实验技能和基本操技能和基本操作。作。课课前必前必须认须认真真预习预习，明确，明确实验实验目的、原理、操作关目的、原理、操作关键键步步骤骤及注意事及注意事项项。2)要十分注意要十分注意实验实验安全，未安全，未经实验经实验指指导导老老师师允允许许不得开、关任何不得开、关任何电电源和源和仪仪器器设备设备开关（按开关（按钮钮）。）。3)实验时应实验时应本着本着认认真、真、积积极的极的态态度，在教度，在教师师的指的指导

2、导下完成每次下完成每次实验实验。注意。注意观观察察实验过实验过程中出程中出现现的的现现象和象和结结果，并果，并对实验结对实验结果展开果展开讨论讨论。结结果不良果不良时时，必，必须须重做。重做。4)实验实验中，听从老中，听从老师师指指导导，严严格遵守操作格遵守操作规规程，取用程，取用试剂时试剂时，应应仔仔细细辨明辨明标标签签，以免取，以免取错错。取完。取完试剂试剂后，后，应应及及时时将瓶盖盖好，放回原将瓶盖盖好，放回原处处，切忌乱拿乱放，切忌乱拿乱放，“张张冠李戴冠李戴”。并。并应应及及时时将将实验结实验结果和原始数据如果和原始数据如实记录实记录在在实验报实验报告上，告上，按按时时写出写出实验报

3、实验报告。告。5)实验实验后，必后，必须须把把仪仪器洗器洗净净放入放入仪仪器柜内；清器柜内；清扫实验扫实验台面、地面；台面、地面；试剂试剂瓶要瓶要摆摆放整放整齐齐。要。要经经常保持常保持实验实验室内清室内清洁洁，不乱，不乱丢纸丢纸屑及所有固体屑及所有固体废废弃物。弃物。6)自自觉觉遵守遵守课课堂堂纪纪律，不律，不迟迟到早退；保持室内安静；不高声到早退；保持室内安静；不高声谈谈笑。同学笑。同学间应间应互助友互助友爱爱。4 实验室规则实验室规则7)爱护实验爱护实验器材，非本次器材，非本次实验实验使用的使用的仪仪器器设备设备未未经经老老师师允允许许不得乱不得乱动动。本次。本次实验实验必必须须使用的使

4、用的仪仪器器设备设备，在了解，在了解仪仪器性能和操作器性能和操作规规程之前，不得冒然使用，更不可擅自程之前，不得冒然使用，更不可擅自拆卸或将部件拆卸或将部件带带出室外。出室外。实验过实验过程中，如程中，如发现设备损发现设备损坏或运坏或运转转异常，异常，应应立即立即报报告老告老师师。8)实验实验室内室内严严禁禁饮饮、食及吸烟、食及吸烟!对对腐腐蚀蚀性或易燃性性或易燃性试剂试剂，操作，操作时时要格外小心。如酒要格外小心。如酒精、乙精、乙醚醚等低沸点有机溶等低沸点有机溶剂剂，使用，使用时应时应禁明火，禁明火，远远离火源，若需加离火源，若需加热热要用水浴加要用水浴加热热，不可直接在火上加，不可直接在火

5、上加热热。用吸量管吸取。用吸量管吸取试剂时应试剂时应使用吸球，使用吸球，严严禁用嘴吸取。禁用嘴吸取。对对于有于有毒、腐毒、腐蚀蚀的的试剂试剂更更应应注意，注意，应应避免其直接接触人体及衣物。乙避免其直接接触人体及衣物。乙醚醚、丙、丙酮酮等易燃等易燃试剂试剂应远应远离火源，以免离火源，以免发发生意外生意外。9)注意注意实验实验室室卫卫生、整生、整洁洁。废废弃液体弃液体应应倒入水槽，放水冲走，有毒倒入水槽，放水冲走，有毒废废弃物弃物应应放入放入废废物缸并及物缸并及时时作无害化作无害化处处理理,实验实验用用过过的棉花、的棉花、废纸废纸、沉淀、沉淀废废渣及其他渣及其他废废弃物品等均弃物品等均应应放入指

6、定容器，不得随意乱扔或放入指定容器，不得随意乱扔或丢进丢进水槽。水槽。10)每次每次实验课实验课由学生由学生轮轮流流值值日。日。值值日生要日生要负责负责打打扫实验扫实验室的室的卫卫生，整理生，整理实验实验室。室。检检查查水、水、电电，关好，关好门门窗，窗，经经老老师检查师检查后，方可离开后，方可离开实验实验室。室。4 实验室规则实验室规则第二节 紫外-可见分光光度计的使用原理和方法 紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱朗伯朗伯-比耳定律比耳定律紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计分析条件的选择分析条件的选择测定方法测定方法标准系列标准系列未知样品未知样品特点特点利用自然光利用自然光比较吸收光的

7、互补色光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）准确度低（半定量）不可分辨多组分不可分辨多组分方法简便，灵敏度高方法简便，灵敏度高1)紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法(UV-VIS)按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析定性分析、定定量分析量分析及结构分析结构分析,所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。2.1紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱紫外光：紫外光：远紫外光（远紫外光（10-200 nm10-200 nm）和）和近紫外光近紫外光（2

8、00-400 nm200-400 nm）的电磁辐射。的电磁辐射。可见光：可见光：400-800 nm400-800 nm的电磁辐射。溶液中物质的电磁辐射。溶液中物质选择性的吸收可见光中某种颜色的光，溶液就选择性的吸收可见光中某种颜色的光，溶液就会呈现出一定的颜色。会呈现出一定的颜色。比色分析法比色分析法：比较有色物质溶液颜色深浅来：比较有色物质溶液颜色深浅来确定物质含量的方法。确定物质含量的方法。分光光度法分光光度法：使用分光光度计进行吸收光谱：使用分光光度计进行吸收光谱分析的方法。分析的方法。2)紫外-可见分光光度法的特点：(1)与其它光谱分析方法相比，其仪器设备仪器设备 和操作都比较简单，

9、费用少，分析速度快和操作都比较简单，费用少，分析速度快;(2)灵敏度高灵敏度高;(3)选择性好选择性好;(4)精密度和准确度较高精密度和准确度较高;(5)用途广泛用途广泛。3)紫外-可见吸收光谱n物质对光的选择性吸收 物质对光光的吸收是选择性选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础光谱法的基础。通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线吸收曲线。在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长max进行物质含量的测定。吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同以A作图 吸收光

10、谱特征：定性依据 吸收峰max 吸收谷min 肩峰sh 图示4)影响紫外-可见吸收光谱的因素n物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性等）不同，吸收光谱的形状形状、吸收吸收峰峰的位置、吸收强度吸收强度等可能发生变化。n温度 在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。溶剂溶剂 注意如下几点：（1）尽量选用低极性溶剂；（2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；（3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。5)紫外-可见吸收光谱的应用 紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量定量分析分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定。设入射光强度为I0，吸收光强度为

11、Ia，透射光强度为 It，则 I0=Ia+Itl吸光度和透光度吸光度和透光度透光率透光率 （透射比）（透射比）Transmittance透光率定义：透光率定义：0IITtT 取值为取值为0.0%100.0%全部吸收全部吸收T=0.0%全部透射全部透射T=100.0%入射光入射光 I0透射光透射光 It吸光度吸光度:为透光度倒数的对数，用A表示A=lg1/T=-lgT=lgI0/It透光度：透光度：透光度为透过光的强度It与入射光强度I0之比，用T表示：即 T=It/I0n朗伯朗伯-比尔定律比尔定律朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘

12、积成正比，即 A=kc l 式中比例常数k(吸光系数)与吸光物质的本性、入射光波长(单色光纯度)及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。偏离朗伯-比耳定律的因素（1）入射光为非单色光）入射光为非单色光（3）光程的不一致性。）光程的不一致性。光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。（2）溶液的不均性。）溶液的不均性。实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可使吸光质点的吸光特性变化大。2.3 紫外-可见分光光度计基本结构:光源光源单色器

13、单色器吸收池吸收池检测器检测器信号显示系统信号显示系统 样品样品光源单色器吸收池检测器信号显示系统0.575光源光源单色器单色器检测器检测器显显示示光源：光源：用于提供足够强度和稳定的连续光谱。分光光度计中常用用于提供足够强度和稳定的连续光谱。分光光度计中常用的光源有的光源有热辐射光源热辐射光源和和气体放电光源气体放电光源两类。两类。热辐射光源热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯,钨灯和碘钨钨灯和碘钨灯可使用的范围在灯可使用的范围在350 2500 nm；气体放电光源气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。用于紫外光区，如氢灯和氘灯。它们可在它们可在180 4

14、00 nm范围内产生连续光源。范围内产生连续光源。在紫外光区只能用石英比色皿在紫外光区只能用石英比色皿。紫外。紫外可见分光光度计通可见分光光度计通常都配有可见和紫外两种光源。常都配有可见和紫外两种光源。光源：光源：提供符合要求的入射光。提供符合要求的入射光。要求：要求：在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。紫外光源-氘灯(180-400 nm)(气体放电光源)可见光源-钨灯(350-2500nm)(热辐射光源)氘灯氘灯氢灯氢灯钨灯钨灯 单色器的主

15、要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。2 单色器 单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。单色器的作用从波长范围较宽的入单色器的作用从波长范围较宽的入射光线中，过滤分出波段较窄的单色射光线中，过滤分出波段较窄的单色光光 吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。3 吸收池 吸收池的种类很多，其光径可在0.110cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区石英石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的

16、吸收和反射应一致）要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4 检测器 检测器的作用是检测光信号，将光信号转变为电信号并予以放大。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。条件前提：固定仪器和测定CACKA样样同上条件固定条件查得测定样品曲线分别测定配制标准系列过程：CAACA标样标样标样标样AACCAACCAXCXA（吸光度）（吸光度）C（浓度）（浓度）实验室常用的水实验室常用的水:自来水自来水 去离子水去离子水不是没有离子的水，而是经过离子交换得到不是没有离子的水，而是经过离子交换得到的没有干扰离子，的没有干扰离子，PH值中性的水，干扰离子一般指钙、镁、值中性的水，干扰离子一般指钙、镁、碳酸根、硫酸根等，但是去离子水一般含有的有机物质是碳酸根、硫酸根等，但是去离子水一般含有的有机物质是不能去除的。不能去除的。蒸馏水蒸馏水是经过多次蒸馏得到的，有一次、二次之分，是经过多次蒸馏得到的，有一次、二次之分，一般的有机杂质可以去除，但是无机离子还是存在。一般的有机杂质可以去除，但是无机离子还是存在。还原糖与DNS 反应产生棕红色物质,加入足够量的酒石酒石酸钾钠酸钾钠是为了消除溶解氧的影响,添加苯酚苯酚可增加试剂的显色作用,添加亚硫酸钠亚硫酸钠可进一步增强试剂的稳定性.