基因工程与基因重组

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1、基因重组与基因工程基因重组与基因工程生物工程定义 生物工程是生物工程是生物技术生物技术的总称，是对生命有机体的总称，是对生命有机体在在分子分子水平、水平、细胞细胞水平、水平、组织组织水平、水平、个体个体水平进行水平进行不同层次的创造性设计和改造，使之能定向组建具不同层次的创造性设计和改造，使之能定向组建具有特定性状的新物种或新品系，从而造福人类的现有特定性状的新物种或新品系，从而造福人类的现代应用技术学科。代应用技术学科。生物技术的四大体系生物技术的四大体系 基因工程基因工程 细胞工程细胞工程 酶工程酶工程 发酵工程发酵工程 重组重组DNA技术技术recombinant DNA techniq

2、ue，又叫，又叫DNA克隆克隆DNA cloning。在体外将各种来源的遗传物质。在体外将各种来源的遗传物质同源的或异源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的同源的或异源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA与载体与载体DNA结合成一具有自我复制能力的结合成一具有自我复制能力的DNA分子复分子复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，以获得该的转化子细胞，再进行扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆mo

3、lecular cloning。一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念一一DNA克隆克隆 由于由于DNA克隆研究对象常常是特异的基因片段，所克隆研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作基因克隆以又称作基因克隆gene cloning。实现基因克隆所采。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为基因工程用的方法及相关工作统称为基因工程genetic engineering。1997年年2月月23日日英国英国 Wilmut 从复杂的生物有机体基因组中，别离出目的基因从复杂的生物有机体基因组中，别离出目的基因片段。片段。用适宜的酶切割目的基因和载体，产生匹配的末用适宜的酶切割目的基因和载体，产

4、生匹配的末端端 在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有且具有 选择标记的载体分子上，形成重组选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。分子。将重组将重组DNA分子转移到适当的受体细胞亦称宿分子转移到适当的受体细胞亦称宿主细胞，主细胞，并与之一起增殖。并与之一起增殖。筛选出获得了重组筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。从分子的受体细胞克隆。从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。供进一步研究使用。基因克隆的根本步骤基因克隆的根本步骤基因克隆的根本步骤基因克隆的根本步骤粘性

5、末端粘性末端质粒质粒目的基因目的基因粘性末端粘性末端匹配的粘性末端匹配的粘性末端酶切后的目的基因片段酶切后的目的基因片段接接(连接连接)连接后的重组连接后的重组质粒质粒DNA分子分子重组质粒重组质粒目的基因目的基因大肠杆菌大肠杆菌转转(转化转化)染色体染色体真好玩!筛筛(筛选筛选)分解抗生分解抗生素的酶素的酶含抗生素的培养基含抗生素的培养基还活着还活着!玩完啦玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大量生长大量生长提取大量提取大量质粒质粒酶酶切切鉴定鉴定您已经掌握基因克隆的主要步骤！别离目的基因和载体别离目的基因和载体DNA。用适宜的酶切割上述用适宜的酶切割上述两者，产生匹配的末两者，产生匹配

6、的末端。端。连接酶将目的基因装连接酶将目的基因装入载体。入载体。转入细菌。转入细菌。筛选具有抗药性克隆。筛选具有抗药性克隆。二重组二重组DNA中的工具酶中的工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 连接酶连接酶 聚合酶聚合酶 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶restriction endonuclease定义：能识别定义：能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链链DNA的一类核酸内切酶。的一类核酸内切酶。主要来源于原核生物，可将侵入宿主细胞的外源性主要来源于原核生物，可将侵入宿主细胞的外源性

7、DNA迅迅速降解，而对细菌自身的速降解，而对细菌自身的DNA，那么通过甲基化酶在该限制酶，那么通过甲基化酶在该限制酶切位点甲基化修饰而保护自身的切位点甲基化修饰而保护自身的DNA不被降解。限制性内切酶不被降解。限制性内切酶和甲基化酶共同构成细菌的限制和修饰系统。限制性内切酶由和甲基化酶共同构成细菌的限制和修饰系统。限制性内切酶由于能限制外源于能限制外源DNA的的“入侵而得名。入侵而得名。限制酶的命名限制酶的命名 限制酶的命名是根据含有该酶的微生物种属而限制酶的命名是根据含有该酶的微生物种属而定。通常有三个斜体字母的缩写表示。定。通常有三个斜体字母的缩写表示。第一个大写字母取自细菌属名的第一个字

8、母；第一个大写字母取自细菌属名的第一个字母；第二、三个小写字母取自微生物种名的头两个字母；第二、三个小写字母取自微生物种名的头两个字母；第四个字母代表该微生物同种内不同的株系；如果第四个字母代表该微生物同种内不同的株系；如果同一株名发现几种限制酶，那么根据其被发现和别同一株名发现几种限制酶，那么根据其被发现和别离的先后顺序，用罗马数字表示。离的先后顺序，用罗马数字表示。例如，从大肠杆菌例如，从大肠杆菌Escherichia ColiRY13株中发株中发现别离的第一种限制酶，称为现别离的第一种限制酶，称为EcoR I。限制性内切酶的分类和特点限制性内切酶的分类和特点 根据限制酶的组成、辅因子及切

9、割DNA方式不同，可分为 I、II、III型。重组DNA技术中常用的是II型限制性内切酶。II型酶作用特点是有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5 端为磷酸基，3 端为羟基。识别顺序一般为46个碱基，通常是回文结构palindrome。回文结构回文结构 II类限制性核酸内切酶识别类限制性核酸内切酶识别DNA 位点的核苷酸序列呈位点的核苷酸序列呈二二元旋转对称元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构回文结构。EcoR I 5 GAATT C3 3 C TTAAG5 II型酶切割双链型酶切割双链DNA产生产生3种不同的切

10、口：种不同的切口：在对称轴中心同时切割双链，产生平末端在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端或称钝性末端blunt end，如，如Hpa I：5 GTTAAC3 Hpa I 5 GTT AAC33 CAATTG5 3 CAA TTG 5 在在对称轴两侧相对位点对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从分别切割一条链。从 5 端端切割产切割产生生 5 端突出的粘性末端端突出的粘性末端，如，如EcoRI：5 GAATT C3 EcoR I 5 G AATTC33 C TTAAG5 3 CTTAA G 5 从从3 端端切割产生切割产生3 端突出的粘性末端端突出的粘性末端。如。如Pst I：5 C

11、 TGCAG3 Pst I 5 CTGCA G33 GACGT C5 3 G ACGTC 5 表表15-2一些常用的限制性内切酶位点一些常用的限制性内切酶位点 一些限制酶虽然识别序列不完全相同，但能产生一些限制酶虽然识别序列不完全相同，但能产生相同类型的粘性末端，称为同尾酶，所产生的末端称相同类型的粘性末端，称为同尾酶，所产生的末端称配伍末端配伍末端compatible end，可进行相互连接。产生，可进行相互连接。产生平末端的酶切割平末端的酶切割DNA后，也可彼此连接。后，也可彼此连接。连接酶可催化连接酶可催化DNA分子中相邻分子中相邻5 磷酸和磷酸和3 羟基末端之间羟基末端之间形成磷酸二酯

12、键，使形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段分子或片段连接。常用的有连接。常用的有T4噬菌体噬菌体DNA连接酶和连接酶和E.Coli DNA连连接酶。接酶。2.DNA连接酶连接酶3.聚合酶聚合酶 重组重组DNA技术中，聚合酶技术中，聚合酶polymerase的最重要作的最重要作用是以用是以DNA或或RNA为模板在体外合成为模板在体外合成DNA或或RNA。可分为。可分为DNA聚合酶和聚合酶和RNA聚合酶两大类。聚合酶两大类。名称名称 功能及应用功能及应用大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 以以DNA为模板，催化为模板，催化5 3 核酸链的延长，另有核酸链的延长

13、，另有3 5 的外的外切酶切酶 大片段大片段（klenow）活性。常用于活性。常用于DNA 3 末端的标记和填充、末端的标记和填充、cDNA第二链的合成、第二链的合成、DNA测序。测序。Taq DNA聚合酶聚合酶 以以DNA为模板，催化为模板，催化5 3核酸链的延长，另有核酸链的延长，另有弱的弱的5 3的外切的外切 酶酶活性，耐高温。常用于活性，耐高温。常用于PCR及及DNA测序。测序。末端转移酶末端转移酶 催化催化NTP中的中的NMP通过其磷酸基与通过其磷酸基与DNA 3-OH连接而使连接而使DNA链链 延长，延长，无需模板无需模板。常用于。常用于3 端标记或形成端标记或形成DNA共聚尾巴。

14、共聚尾巴。逆转录酶逆转录酶 以以RNA为模板，合成为模板，合成cDNA链链（5 3），另有），另有RNA酶酶H活性。活性。常常 用于用于cDNA第一、二链的合成及反转录第一、二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。）。RNA聚合酶聚合酶 以以DNA为模板合成为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链。常用于离体条件下，合成单链RNA作为作为 杂交探针。杂交探针。T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶polynucleotide kinase催化催化ATP的的-磷酸基转移至磷酸基转移至DNA或或RNA的的5 末端羟基上。常用于单链末端羟基上。常用于单链或双链或双链DNA和和RNA探针的探针的5 端标记

15、。端标记。4.多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶5.碱性磷酸酶碱性磷酸酶 牛小肠碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶calf intestinal alkaline phosphatase,CIP，催化，催化DNA或或RNA的的5 磷酸基水解。常用于去除线状载磷酸基水解。常用于去除线状载体体DNA两端的两端的5 磷酸基团，防止载体自身连接环化；也用于用磷酸基团，防止载体自身连接环化；也用于用32P标记标记DNA的的5 末端之前除去原来的末端之前除去原来的5 磷酸基。磷酸基。应用重组DNA技术有时是为别离、获得某一感兴趣的基因或DNA片段，或是获得感兴趣的表达产物 蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基

16、因。目的基因有两种类型，即cDNA和基因组DNA。三目的基因三目的基因target gene四四 基因工程载体基因工程载体基因载体：或称克隆载体基因载体：或称克隆载体cloning vector,是在基因工程中是在基因工程中为为“携带感兴趣的外源携带感兴趣的外源DNA目的基因、外源基因、实目的基因、外源基因、实现外源现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，具有自我复制和表达功能。其中，为使插入的外分子，具有自我复制和表达功能。其中，为使插入的外源源DNA 序列可转录、进而翻译成多肽链而特异设计的克隆载序列可转录、进而翻译成多肽

17、链而特异设计的克隆载体又称表达载体。体又称表达载体。能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制。具有一个以上的单一限制性酶切位点多克隆位点，multiple cloning sites，以便目的基因的 插入。具有适宜的筛选标记如抗药性基因，酶基因等，以 便筛选阳性克隆。载体分子量小，以便容纳较大目的基因，拷贝数高。在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代而不易丧失。理想载体应具备的根本条件理想载体应具备的根本条件载体的分类载体的分类 质粒质粒（plasmid）噬菌体噬菌体（phage）病毒病毒（virus）克隆载体克隆载体（cloning vector）表达载体表达载体（expression v

18、ector）常用的载体按来源分为常用的载体按来源分为载体按得到的产物分类可分为载体按得到的产物分类可分为质粒质粒plasmid 质粒是存在于细菌染色体外的小型质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链环状双链DNA分子，分子，能在宿主细胞能在宿主细胞独立自主地进行复制独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息遗传信息，会赋予宿，会赋予宿主细胞主细胞新的遗传性状新的遗传性状。因为质粒。因为质粒DNA有自我复制功能及携有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组带遗传信息等特性，可作为重组 DNA操作的载体。操作

19、的载体。染色体染色体质粒质粒 pBR322 质粒图谱氨苄青霉素氨苄青霉素抗性基因抗性基因四环素抗四环素抗性基因性基因多克隆位点多克隆位点噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体是一种细菌病毒，可作为克隆载体。目前使用的噬菌体载体主要有噬菌体衍生物载体、M13噬菌体载体等。除M13噬菌体载体外，这类载体的特点是其容量比质粒载体大，即可插入较大的外源DNA片段如20kb以上。可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。噬 菌 体头部头部尾部尾部尾丝尾丝 噬菌体 噬菌体lambdla bacteriophage是一种大肠杆菌病毒，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿

20、主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。DNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。噬菌体侵入细菌后，即可裂解生长环状噬菌体侵入细菌后，即可裂解生长环状DNA在细菌在细菌中屡次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗中屡次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，又可以溶源生长粒，裂解宿主菌，又可以溶源生长噬菌体噬菌体DNA整合整合到细胞染色体基因组到细胞染色体基因组DNA中，与染色体中，与染色体DNA一起复制，一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌示示意意图图裂解生长裂解生长 噬菌体基因组

21、中有较大区域仅与溶源生长有关，而对噬菌体基因组中有较大区域仅与溶源生长有关，而对裂解生长并非绝对需要，因此可以缺失或被裂解生长并非绝对需要，因此可以缺失或被外源外源DNA取代。取代。经改造的经改造的噬菌体衍生载体可分两类噬菌体衍生载体可分两类:一类是一类是插入型载体插入型载体，即外源基因插入到载体上单一的限，即外源基因插入到载体上单一的限制酶位点，如制酶位点，如gt系列等。系列等。另一类是另一类是置换型置换型，即两个限制酶位点之间的，即两个限制酶位点之间的DNA片段可片段可被外源被外源DNA取代，如取代，如Charon，EMBL系列等。系列等。M13噬菌体载体噬菌体载体 M13噬菌体基因组是噬

22、菌体基因组是单链环状单链环状DNA，当它侵犯宿主菌后，当它侵犯宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链在细菌胞内酶的作用下，单链DNA转变成复制型双链转变成复制型双链DNA，可提取出来做基因重组。可提取出来做基因重组。经改造的经改造的M13噬菌体有噬菌体有M13 mp系列和系列和pUC系列。系列。M13噬菌体载体噬菌体载体pUC19互补：单独存在的互补：单独存在的及及 片段都没有半乳糖苷酶片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞的活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内个片段时，宿主细胞内才有才有 半乳糖苷酶活性，半乳糖苷酶活性，使特异性作用物使特异性作用物X

23、-gal变为蓝色化合物。变为蓝色化合物。突变型突变型lac-E.coli表达表达-半乳糖苷半乳糖苷酶的酶的 片段片段。如果插入的外源基因是在如果插入的外源基因是在lacZ基因内，就会影基因内，就会影响响lacZ的表达，利用的表达，利用lac-E.coli为转染或感染细为转染或感染细胞，在含胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌的培养基上生长时会出现白色菌落；假设无外源基因插入，那么出现蓝色菌落。落；假设无外源基因插入，那么出现蓝色菌落。多克隆位点多克隆位点编码编码-半乳半乳糖苷酶的糖苷酶的片段片段病毒载体病毒载体 是一类是一类真核载体真核载体，能把基因引入到，能把基因引入到 真核细胞中

24、，并真核细胞中，并在其中被表达。因此是研究真核细胞表达及调控的有力在其中被表达。因此是研究真核细胞表达及调控的有力工具。如工具。如:腺病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒等。腺病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒等。二、重组二、重组DNA技术根本原理技术根本原理 目的基因目的基因的获取的获取 克隆克隆载体载体的选择和构建的选择和构建 外源基因与载体的外源基因与载体的连接连接 重组重组DNA导入受体菌导入受体菌 重组体的重组体的筛选筛选 克隆基因的克隆基因的表达表达一目的基因的获取一目的基因的获取 化学合成法化学合成法 基因组基因组DNA cDNA 聚合酶链反响聚合酶链反响1.化学合成法化学合成法 某种基因的核

25、苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出编码该多肽链的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。利用该法合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽、干扰素基因等2.基因组基因组DNA 利用限制性核酸内切酶将染色体利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切割成一定基因水平切割成一定基因水平的许多片段，将这些片段与适当的克隆载体拼接成重组的许多片段，将这些片段与适当的克隆载体拼接成重组DNA分分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组不同细菌所包含的重

26、组DNA分子可能为不同的染色体分子可能为不同的染色体DNA片段，这样全部转化细菌所携带的各种染色体片段就代表了染片段，这样全部转化细菌所携带的各种染色体片段就代表了染色体的整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的色体的整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组所有基因组DNA片段的集合称为基因组片段的集合称为基因组DNA文库文库genomic DNA library。基因组。基因组DNA文库涵盖了基因组全部的遗传信息。文库涵盖了基因组全部的遗传信息。建立基因组文库后，需结适宜当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，再进行扩增，将重组DNA别离、回收，以获得目

27、的基因。3.cDNA 把细胞总mRNA通过逆转录合成总cDNA，再与适当载体连接后转入受体菌，从而得到含有某种生物体全部cDNA集合称为cDNA 文库，cDNA library。然后用适当的方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA。cDNA文库文库的特点是它只包括已经的特点是它只包括已经被转录被转录成成mRNA的那些的那些基因序列基因序列，且，且不包括内含子及调控序列不包括内含子及调控序列，所以，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。文库的复杂性要比基因组文库低的多。但由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的但由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达所决定的

28、，因此各自的特定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各自的mRNA种类就不同，由此产生的种类就不同，由此产生的cDNA又是独特的。与又是独特的。与基因组基因组DNA文库类似，由文库类似，由总总mRNA制作的制作的cDNA文库包文库包含了细胞表达的各种含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴信息，自然也含有我们感兴趣的编码趣的编码cDNA。4.4.聚合酶链反响聚合酶链反响polymerase chain reaction,PCRpolymerase chain reaction,PCR 参见参见437页页PCR PCR 的根本原理的根本原理 体外高效、快速、特异地扩增目的基因或体外高效

29、、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。片段的技术。其原理类似于其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给的体内复制，只是在试管中给DNA的体的体外合成提供一种适宜条件外合成提供一种适宜条件模板模板DNA，寡核苷酸引物，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，适宜的缓冲液系统和聚合酶，适宜的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增得以迅速扩增 DNA的体内复制：的体内复制：原料：模板原料：模板DNA基因组基因组DNA，随机小分子随机小分子RNA引物，引物，dNTPs酶：酶：DNA聚合酶，解旋酶，引发酶聚合酶，解旋酶，引发酶反响

30、条件：胞液环境，反响条件：胞液环境，37 反响过程：模板反响过程：模板DNA解旋、引发体的解旋、引发体的形成、延长三阶段形成、延长三阶段产物：模板产物：模板DNA 基因组基因组DNA拷拷贝数增加一倍贝数增加一倍 原料：模板原料：模板DNA基因组基因组DNA，cDNA一对特异性寡核苷酸引物，一对特异性寡核苷酸引物，dNTPs酶：酶：Taq DNA聚合酶聚合酶反响条件：适宜的缓冲液，三种变化的反响条件：适宜的缓冲液，三种变化的温度温度94，50-70，72，一定的循环，一定的循环数数25-35反响过程：反响过程：DNA模板变性解链、模板变性解链、模板与引物退火模板与引物退火、引物延伸、引物延伸 三

31、阶段，三阶段，多循环多循环产物：目的产物：目的DNA特异性拷贝数增加特异性拷贝数增加2n倍倍PCR：DNADNA模板变性模板变性与体内与体内DNA解链过程不同，解链过程不同，PCR中作为模板的中作为模板的双链双链DNA是通过是通过95左右的左右的高温高温使其发生变性，形成使其发生变性，形成单链单链DNA 模板与引物退火模板与引物退火 PCR通常需要两条寡核苷酸链作为通常需要两条寡核苷酸链作为DNA合成时的引物合成时的引物primer,这两个引物分别与待扩增模板这两个引物分别与待扩增模板DNA的目标片段的目标片段两端的序列互补。在降低温度的过程中，通过控制退火条两端的序列互补。在降低温度的过程中

32、，通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。primers 引物引物短短，不易缠绕；，不易缠绕；设计的引物是与模板设计的引物是与模板DNA两端序列互补；两端序列互补；引物的量引物的量远大于远大于模板分子的量，引物与模板模板分子的量，引物与模板DNA形成双形成双链的几率远远高于链的几率远远高于DNA分子自身的复性。分子自身的复性。引物延伸引物延伸在在PCR反响体系中的反响体系中的DNA聚合酶，能够催化反响体系中游聚合酶，能够催化反响体系中游离的单核苷酸离的单核苷酸dNTPs由引物由引物53方向，按碱基配对方向，按碱基配对的原那么延伸，形成两条与

33、模板的原那么延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。互补的复制链。Taq 酶酶dNTPSl 新合成的链又可作为下轮循环反响的模板。新合成的链又可作为下轮循环反响的模板。热变性热变性-复性复性-延伸的过程就是一个延伸的过程就是一个PCR循环循环 每一循环后的模每一循环后的模板均比前一循环增加板均比前一循环增加1倍。理论上讲，扩增倍。理论上讲，扩增DNA产量是呈指产量是呈指数上升的，即数上升的，即n个循环后，产量为个循环后，产量为2n拷贝。而实际上，拷贝。而实际上，PCR的扩增倍数为的扩增倍数为1+Xn，X为扩增效率，平均为为扩增效率，平均为75%热变性热变性-复性复性-延伸延伸25-35 次循环

34、次循环百万倍扩增百万倍扩增 尽管尽管PCR扩增扩增DNA非常有效，但目的非常有效，但目的DNA序列的指数扩增序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。并不是一个无限制的过程。在正常的反响条件下，经在正常的反响条件下，经30次循环之后，酶的催化反响趋于次循环之后，酶的催化反响趋于饱和，就会出现平台效应饱和，就会出现平台效应(Plateau)，产物的量不再增加。，产物的量不再增加。“平台效应出现的迟早还取决于酶的性能、模板平台效应出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷的拷贝数、贝数、dNTP浓度等多种因素。浓度等多种因素。三外源基因与载体的连接三外源基因与载体的连接二克隆载体的选择二克隆载体的选择

35、 粘性末端连接粘性末端连接 平端连接平端连接 同聚物加尾连接同聚物加尾连接 人工接头连接人工接头连接1.粘性末端连接粘性末端连接 外源外源DNA片段与片段与载体用载体用同一种同一种限制性限制性内切酶切割，获得相内切酶切割，获得相同的粘性末端，相互同的粘性末端，相互互补配对，在互补配对，在DNA连接酶作用下，形成连接酶作用下，形成重组重组DNA分子。分子。5CCG G3 5C CGG33G GCC5 3G GC C 5Hpa II2.平端连接平端连接 因载体分子和目的因载体分子和目的DNA分子之间并不一定都产生互补分子之间并不一定都产生互补的粘性末端，有的限制性内切酶只能切成的粘性末端，有的限制

36、性内切酶只能切成平末端平末端。平末端仍。平末端仍用用T4DNA连接酶连接酶连接，只是连接，只是效率低效率低，需要的，需要的DNA浓度更高。浓度更高。3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接 同聚物加尾连同聚物加尾连接是利用同聚物序接是利用同聚物序列，如列，如polyG与与poly C之间的之间的退火退火作用完作用完成连接。成连接。在末端转移酶作用下，在在末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，如将片段末端加上同聚物序列，如将polydC加到双链加到双链DNA片段片段3 羟基上，而将羟基上，而将polydG加到质粒加到质粒载体载体3 羟基上，制造出粘性末端，然后进行粘性末端连接。羟基上，制造出

37、粘性末端，然后进行粘性末端连接。4.人工接头连接人工接头连接 接头接头linker是指人工合成的一段双链寡核苷酸，是指人工合成的一段双链寡核苷酸，其中包含一个或两个酶切位点。首先将接头与目的其中包含一个或两个酶切位点。首先将接头与目的DNA片段进行平末端连接，继而用适当的内切酶将接头部片段进行平末端连接，继而用适当的内切酶将接头部位切出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。位切出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。四重组体导入受体细胞四重组体导入受体细胞 在分子克隆中，将质粒或以它为载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为转化transformation。以噬菌体和真核病毒作载体构建的重组分

38、子导入受体细胞的过程称为转染transfection。基因片段特别是纯化的DNA很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预先加以处理，使其提高基因导入细胞的效率。例如用低温CaCl2冰浴处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率。这种经过预处理的、容易导入外源核酸分子的受体细胞被称作“感受态细胞competent cell。五重组体的筛选五重组体的筛选 通过转化、转染等方式，重组体DNA分子被导入受体细胞，经适当涂布的培养基培养得到大量转化子菌落或转染噬菌斑。因为每一重组体只携带某一段外源基因，而转化或转染时每一受体菌又只能接受一个重组体分子，所以设法将众多的转化菌落或噬菌斑区分开来，并鉴定哪一菌落

39、或噬菌斑所含的重组DNA分子确实带有目的基因，即可得到目的基因的克隆，这一过程即为筛选screening。根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取不同的筛选方法。胞表达情况不同，可采取不同的筛选方法。1.直接筛选法直接筛选法 1抗药性标志筛选抗药性标志筛选 2标志补救标志补救 3分子杂交法分子杂交法2.非直接筛选法非直接筛选法 免疫学方法免疫学方法抗药性标志筛选抗药性标志筛选 如果克隆载体携带有某种如果克隆载体携带有某种抗药性标志基因抗药性标志基因，如，如Ampr或或Tetr，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该，

40、转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗生素的培养板上生存并形成菌落，这样就可将转化菌与非抗生素的培养板上生存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。转化菌区别开来。如果重组如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，如插入时将外源基因插入标志基因内，如插入Tetr内，使标志基因内，使标志基因Tetr失活，阳性重组子那么不能在含失活，阳性重组子那么不能在含有有Tet的培养板上生长。用插入失活筛选的重组子载体往往的培养板上生长。用插入失活筛选的重组子载体往往带有另一个抗生素抗性基因如带有另一个抗生素抗性基因如Ampr，因此可以通过双抗生，因此可以通过双抗生素对照筛选，即阳性转化子可

41、以在含素对照筛选，即阳性转化子可以在含Amp的培养板上生长的培养板上生长而不能在含而不能在含Tet的培养板上生长。的培养板上生长。标志补救标志补救 假设克隆的基因能够在宿主菌内表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救marker rescue。-互补：互补：通过通过蓝白斑蓝白斑筛选可以筛选、鉴定重组体与筛选可以筛选、鉴定重组体与非重组体载体。非重组体载体。当外源基因插入后，当外源基因插入后，LacZ基因被破坏，基因被破坏，不能合成完整的不能合成完整的-半乳糖苷酶，因此半乳糖苷酶，因此不能分解底物不能分解底物X-gal，菌落成菌落成白色白色-半乳糖

42、苷酶能半乳糖苷酶能分解分解X-gal，形，形成成蓝色蓝色菌落。菌落。分子杂交法分子杂交法molecular hybridization参见参见435页页核酸分子杂交核酸分子杂交molecular hybridization：指用标记的：指用标记的DNA或或RNA片段探针检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配片段探针检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原那么发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的对原那么发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。核酸序列的位置或大小显示出来。探针：带有可检测标记的序列的探针：带有可检测标记的序列的DNA或或RNA片段。

43、片段。核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理变性（变性（denaturation）复性（复性（renaturation）杂交（杂交（hybridization）预杂交（预杂交（prehybridization）变性变性denaturationl概念：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢概念：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双股螺旋或发夹结构翻开，有规那键断裂，疏水作用被破坏，双股螺旋或发夹结构翻开，有规那么的结构被破坏，形成单链分子。么的结构被破坏，形成单链分子。l变性的因素：加热、酸、碱、尿素、甲酰胺等变性的因素：加热、酸、碱、尿素、甲酰

44、胺等l增色效应增色效应hyperchronic effect：核酸变性时，紫外吸收值：核酸变性时，紫外吸收值A260随之升高的现象。随之升高的现象。热变性热变性 DNA的熔解曲线的熔解曲线Tm值值melting temperature:热变性时，热变性时，50%DNA分子变性的温分子变性的温度。又叫解链温度、熔解温度。度。又叫解链温度、熔解温度。复性复性renaturation 概念概念：在适当条件下，变性：在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新缔合，的两条互补单链重新缔合，形成双链的过程。形成双链的过程。热变性后，热变性后，缓慢降低温度缓慢降低温度至比至比Tm值低值低20-30时，变时，

45、变性的单链性的单链DNA可恢复其双链结构，称为可恢复其双链结构，称为退火退火。杂交杂交hybridization 来源不同来源不同的两条的两条单链单链核酸分子通过碱基互补可形成异源核酸分子通过碱基互补可形成异源双螺旋。如双螺旋。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA杂交分子。杂交分子。预杂交预杂交prehybridization 概念概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。前的处理过程称为预杂交。常

46、用的封闭物常用的封闭物：变性的非特异性：变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子，如鲑鱼精子DNA、小、小牛胸腺牛胸腺DNA，又称为覆盖，又称为覆盖DNA。变性、复性、杂交示意图变性、复性、杂交示意图核酸探针：带有可检测标记的核酸探针：带有可检测标记的DNA或或RNA片段，用于检片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。测待测样品中的靶核酸序列。探针探针分类分类放射性放射性标记核酸探针标记核酸探针非放射性非放射性标记核酸探针标记核酸探针印迹杂交印迹杂交 概念：指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然概念：指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。后与存在于液相中的核

47、酸探针进行杂交的过程。探针与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少可反响出待测的核探针分子显示的位置及其量的多少可反响出待测的核酸分子是否存在相应的基因序列及其大小。酸分子是否存在相应的基因序列及其大小。分类分类DNA印迹杂交（印迹杂交（Southern blotting）RNA印迹杂交（印迹杂交（Northern blotting）提取提取DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱变性碱变性转移到转移到NC膜膜与与DNA或或RNA探针探针杂交杂交放射自显影放射自显影DNA印迹杂交印迹杂交Sou

48、thern blotting检测靶分子为检测靶分子为DNA,检测检测靶分子是否含有目的基因靶分子是否含有目的基因将琼脂糖将琼脂糖凝胶凝胶上的上的DNA分子转移到分子转移到硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜上上 菌落原位杂交菌落原位杂交In situ hybridization含有与探针互补序列的菌落或噬菌含有与探针互补序列的菌落或噬菌斑经放射自显影后，在斑经放射自显影后，在X X光底片上光底片上出现杂交点。出现杂交点。将转化后得到的菌落或噬菌斑原位将转化后得到的菌落或噬菌斑原位转移到转移到NCNC膜上，得到一个与平板菌膜上，得到一个与平板菌落或噬菌斑分布完全一致的复制品。落或噬菌斑分布完全一致的复制品。

49、原位裂解细胞，碱变性，核酸分原位裂解细胞，碱变性，核酸分子被固定于膜上子被固定于膜上参加标记的参加标记的DNADNA或或RNARNA探针进行杂交探针进行杂交根据阳性反响位置，可从保存的母根据阳性反响位置，可从保存的母板上挑出所需的阳性克隆。板上挑出所需的阳性克隆。RNA印迹杂交印迹杂交Northern blotting 检测靶分子为检测靶分子为RNA。主要用于检测某一组织或细。主要用于检测某一组织或细胞中的特异胞中的特异mRNA的表达水平，或比较不同组织或的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。细胞的同一基因的表达情况。与与Southern blotting不同的是在转移前不需进

50、行不同的是在转移前不需进行限制性内切酶切割。限制性内切酶切割。杂交方法杂交方法适适 用用 范范 围围Southern 印迹印迹检测经凝胶电泳分开的检测经凝胶电泳分开的DNA分子，需转印到膜上分子，需转印到膜上Northern 印迹印迹检测经凝胶电泳分开的检测经凝胶电泳分开的RNA分子，需转印到膜上分子，需转印到膜上斑点杂交斑点杂交检测未经分离的、固定在膜上的检测未经分离的、固定在膜上的DNA或或RNA分子分子菌落或噬菌斑杂交菌落或噬菌斑杂交检测固定在膜上的、经裂解后从细菌或噬菌体中释检测固定在膜上的、经裂解后从细菌或噬菌体中释放出的放出的DNA分子分子原位杂交原位杂交检测细胞或组织中的检测细胞

51、或组织中的DNA或或RNA分子分子免疫学方法免疫学方法 免疫学筛选是利用特异抗体与目的基因表达的抗原产物相互作用进行筛选，特异性和敏感性也较高，尤其适用于筛选不为宿主菌提供任何选择标记的基因，或者是已获得了该基因编码的蛋白质产物的多克隆或单克隆抗体，用这些抗体来检测目的基因表达的产物。免疫学方法很多，如Western blot，免疫化学方法、酶联免疫吸附剂测定enzyme linked immunosorbent assay，ELISA、放射免疫沉淀、免疫荧光抗体技术等，可对目的基因表达的蛋白进行定性，甚至定量检测。基因工程的最终目的是在一个适宜的系统中，基因工程的最终目的是在一个适宜的系统中

52、，使外源基因高效表达，从而产生有重要价值的蛋白使外源基因高效表达，从而产生有重要价值的蛋白质产品。其过程包括外源基因克隆，外源基因在宿质产品。其过程包括外源基因克隆，外源基因在宿主细胞中经转录、翻译、加工等过程表达相应蛋白主细胞中经转录、翻译、加工等过程表达相应蛋白以及蛋白产物的别离纯化等过程。以及蛋白产物的别离纯化等过程。六克隆基因的表达六克隆基因的表达目前世界范围内开发的基因工程多肽目前世界范围内开发的基因工程多肽药物药物、疫苗疫苗、抗体抗体有有500500多种多种 E.coli是当前采用最多的原核表达体系，运用是当前采用最多的原核表达体系，运用E.coli表达表达有用的蛋白质必须使构建的

53、表达载体符合以下标准：有用的蛋白质必须使构建的表达载体符合以下标准：含大肠杆菌适宜的选择标志含大肠杆菌适宜的选择标志 具有能调控转录、产生大量具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子的强启动子 含适当的翻译控制序列含适当的翻译控制序列 含有合理设计的多克隆位点，以确保目的基因按一定含有合理设计的多克隆位点，以确保目的基因按一定 方向与载体正确连接。方向与载体正确连接。外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 E.coli表达体系在实际应用中缺乏之处：表达体系在实际应用中缺乏之处：缺乏转录后加工机制，缺乏转录后加工机制，E.coli表达体系只能表达体系只能表达克隆表达克隆 的的cD

54、NA，不宜表达真核基因组，不宜表达真核基因组DNA 缺乏适当的翻译后加工机制，缺乏适当的翻译后加工机制，E.coli表达体表达体系的真核系的真核 蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰饰表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体很难在很难在E.coli表达体系中表达大量的可溶性蛋表达体系中表达大量的可溶性蛋白质白质外源基因在真核细胞中表达外源基因在真核细胞中表达 目前常用的目前常用的真核表达体系真核表达体系有酵母、昆虫和哺乳动物细胞有酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达体系。表达体系。利用真核细胞作为基因的表达体系已被证明具有许多原利用

55、真核细胞作为基因的表达体系已被证明具有许多原核表达体系所不具备的优势核表达体系所不具备的优势 不仅可以表达克隆的不仅可以表达克隆的cDNAcDNA,也可表达真核也可表达真核基因组基因组DNADNA 识别和去除内含子识别和去除内含子,经经剪接加工剪接加工形成成熟的形成成熟的mRNAmRNA 对蛋白进行对蛋白进行翻译后加工翻译后加工,最大限度地保证蛋白质的最大限度地保证蛋白质的 生物学活性生物学活性 三、三、DNADNA重组技术对医学和生命科学开展的奉献重组技术对医学和生命科学开展的奉献 对人类遗传信息的认识对人类遗传信息的认识 基因工程药物与疫苗基因工程药物与疫苗 转基因动物和植物转基因动物和植

56、物 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗镰刀型红细胞贫血镰刀型红细胞贫血 Chehab Chehab等设计一对引物把含有突变的等设计一对引物把含有突变的DNADNA片段共片段共294bp294bp扩增，扩增产物用限制性内切酶扩增，扩增产物用限制性内切酶 OxaN I OxaN I消化，琼脂糖凝胶电消化，琼脂糖凝胶电泳后染色观察：泳后染色观察：正常人有正常人有2 2个片段，个片段，191 191 和和 103bp 103bp，镰刀状红细胞贫血的镰刀状红细胞贫血的 纯合子，仅有一个片段纯合子，仅有一个片段294bp 294bp 杂合子有杂合子有191191、103103和和294bp 3294bp 3个片段个片段 思考题一、根本概念 DNA重组技术 限制性核酸内切酶 回文结构 目的基因 基因组DNA文库 cDNA文库 -互补二、简述题二、简述题1.何谓基因重组技术，简述其根本过程。何谓基因重组技术，简述其根本过程。2.何谓目的基因，有哪些来源？何谓目的基因，有哪些来源？3.解释基因载体，哪些解释基因载体，哪些DNA 可作为基因载体？可作为基因载体？表达体系和真核表达体系各自的优、缺点。表达体系和真核表达体系各自的优、缺点。