基因工程的基本操作程序2-公开课.ppt

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1、 在宿主细胞内大量复制并稳定存在 具有一个至多个限制酶切割位点，以供外源 DNA片段插入 具有标记基因，供重组 DNA的鉴定和选择 四环素抗 性基因 氨苄青霉素 抗性基因 人胰岛素基因 目的基因 插入点 目的基 因 DNA连接酶 目的基因 插入点 目的基因 人胰岛素基因 目的 基因 含有 四环素 的 完全培养基 含有 氨苄青霉素 的完全培养基 死 亡 死 亡 存 活 存 活 死 亡 存 活 1.2 基因工程的基本操作程序 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 . . . 1、从 基因文库 中获取（序列未知） 2、利用 PCR技术 扩增

2、（序列已知） 基因文库 基因组文库 部分基因文库如： cDNA文库 聚合酶链式反应 一、目的基因的获取 3、人工合成 (基因比较小，序列已知 ) 反转录法 根据已知的氨基酸序列合成 DNA（化学合成） 依据： 目的基因的有关信息。 如： 根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物 mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性 从基因文库中获取目的基因 利用 PCR技术扩增目的基因 概念： PCR全称为 _，是一项 在生物 _复制 _的核酸合成技术。 原理： _ 多聚酶链式反应 体外 特定 DNA片段 DNA复制 一段已知目的基因的核苷酸序列 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷

3、酸序列 基因的核苷酸序列 目的基因 化学合成 推测 推测 人工合成法 （ 基因较小，核苷酸序列已知 ） mRNA RNA DNA 杂合双链 单链 DNA 双链 DNA 逆转录酶 DNA聚合酶 反转录法 化学合成法 二、基因表达载体的构建（ 核心 ） 1.目的 A. 使目的基因在受体细胞中 稳定存在 并 遗传 给子代 B.同时使目的基因能 表达和发挥作用 2.基因表达载体的 组成 ： a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 质粒 目的基因 限制酶 DNA连接酶 重组 DNA 3.基因表达载体的构建过程 （ 1）用 _切割质粒， 使其出现切口露出 _。 （ 2）用 _切割目 的基因，使

4、其产生 _ _。 （ 3）将目的基因插入质粒的 _处，加入 _，形成了一个重组 DNA分子 限制酶 黏性末端 同种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 三、将目的基因导入受体细胞 -转化 目的基因进入 _内，并且在 受体细胞内维持 _和 _的过程 稳定 表达 受体细胞 方法 将目的基因导 入植物细胞 将目的基因导 入动物细胞 将目的基因导 入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 Ca2+处理法 1、将目的基因导入 植物 细胞 （ 1） 农杆菌转化法 特点 : a.能感染 双子叶 植物和 祼子 植物 , 对单子叶植物无感染能力 b.Ti质粒的 T DNA可转移至

5、受体细胞并 整合到其染色体上 Ti质粒 目的基因 构建 表 达 载 体 转入 农杆 菌 整合 植物细胞染 色体 DNA 表达 新性 状 外源基因 导入 植物 细 胞 （ 2） 基因枪法 特点：成本高 适用于 单子叶植物 （ 3）花粉通道法 我国转 基因抗 虫棉就 是用这 种方法 获得 2、将目的基因导入 动物细胞 方法： 显微注射法 程序： 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物 3、将目的基因导 入微生物细胞 （ 1）方法： Ca2+处理法（ 增加细胞膜通透性 ） （ 2）微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 （ 3）过程： Ca2+处理 大

6、肠杆菌 感受态 细胞 表达载体 与感受态 细胞混合 感受态细 胞吸收 DNA 四、目的基因的检测与鉴定 检测（ 分子水平 ） : 是否 插入 目的基因 是否 转录 是否 翻译 鉴定 : 个体生物学水平鉴定 （ 1）检测转基因生物染色体的 DNA上 是否插 入了目的基因 A 方法 : DNA分子杂交 B 过程 : 1.检测 基因探针 通过分子杂交与目的基因结合， 产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因 显示出来。 (2)检测目的基因 是否转录出了 mRNA 方法 : 分子杂交法 过程 :用上述探针和转基因生物的 mRNA杂交 , 若出现 杂交带 ,表明目的基因转录出了 mRNA。 （ 3）检测

7、目的基因 是否翻译成蛋白质 方法 : 抗原 -抗体杂交 提 取 方法 抗原 -抗体杂交 苏云金杆菌 Bt毒素蛋白 将 Bt毒蛋白注 射小鼠体内 从小鼠血管抽出 血液分离出抗 Bt毒素的抗体 抗体 蛋白质 出现杂交带 脱分 化 组 织 培 养 2.鉴定（个体生物学水平 ） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 目的基因的表达和检测 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 抗原抗体杂交法 DNA-RNA分子杂交法 DNA分子杂交法 受体是否具有 转基因特征 个体 水平 目的基因是否翻译 目的基因是否转录 目的基因是否插入转 基因生物的染色体 分子 水平 方法 检测对象 非编码区 非编码区 编码区 外显子 内含子

8、 终止子 基因的结构 启动子 原核 真核 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 _的 编码区是间隔的、 _的 相同点 都由能够编码蛋白质的 _和具 有调控作用的 _区组成的 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思 考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ 连续 不连续 编码区 非编码 编码区 非编码区 非编码区 mRNA前体 mRNA 单链 DNA cDNA 转录 剪接 逆转录 复制 启动子 终止子 基因 不含 非编 码系列 。 即不含 非 编码区 和 内含子 模板 DNA PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50 引物 1 引物 2 DNA引

9、物 95 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物 1 引物 2 DNA引物 72 Taq酶 Taq酶 基因组 DNA文库与 cDNA文库的比较 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72 第 1轮结束 第 2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95 50 72 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72 第 2轮结束 过程： a、 变性 （ 90 -95 ）：双链 DNA在受热下， _ 断裂，形成 _ b、 复性 （ 55 -65 ）：温度降低， 引物 与单链

10、DNA 结合，形成局部 _。 c、 延伸 （ 70 -75 ）：在 Taq酶 的作用下，合成与 模板互补的 _。 氢键 单链 DNA 双链 DNA链 方式：以 _方式扩增，即 _ 条件：前提条件 :_ 结果： 指数 2n 短时间内大量扩增目的基因 已知基因的核苷酸序列 DNA复制 PCR技术 场所 解旋方式 酶 PCR技术扩增与 DNA复制的比较 高温 解旋酶 体外复制 主要在细胞核内 热稳定的 DNA聚合酶 细胞内的 DNA聚合酶 （ 3）人工合成法： 在 基因较小，核苷酸序列已 知 的情况下， 可以利用 DNA合成 仪 人工合成 化学合成法 、 反转录法 蛋白质 mRNA DNA 推测 推

11、测 DNA DNA合成仪合成 根据已知的氨基酸序列合成 DNA法 ： 生物 某个发育时期 的 mRNA 单链 DNA 双链 cDNA片段 重组 DNA 与载体连接 cDNA文库 反转录酶 DNA聚合酶 导入受体菌中储存 cDNA文库的构建 -逆转录法： 目的基因所在片段 运载体 PSt DNA连接酶 重组 DNA 运载体自连 目的基因 自连 CTTAA G CTTAA G CTTAA CTTAA G G PSt 运载体的特点 3： 有标记基因 导入 接种培养 接种 培养 接种 培养 接种培养 含有四环素的 完全培养基 完全培养基 大 肠 杆 菌 不 含 抗 四 环 素 基 因 证明： 不存活

12、含有四环素的 完全培养基 证明： 大 肠 杆 菌 含 抗 四 环 素 基 因 证明： 大肠杆菌 的受体细胞含 有目的基因 四环素抗性基因 四环素 抗性基因 完全培养基 存 活 如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？ 导入 接种培养 接种 培养 接种 培养 接种培养 含有四环素的 完全培养基 完全培养基 大 肠 杆 菌 不 含 抗 四 环 素 基 因 证明： 不存活 含有四环素的 完全培养基 证明： 大 肠 杆 菌 含 抗 四 环 素 基 因 证明： 大肠杆菌 的受体细胞含 有目的基因 四环素抗性基因 四环素 抗性基因 完全培养基 存 活 如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？ 基因文库 将

13、含有某种生物 不同基因 的许多 DNA片断 ，导入到 受体菌 的群体中， 各个受体菌分别含 有这种生物的不同基因 ，称为基因文库。 （便于在 不知道目的基因核苷酸序列 的情况下，获得所需的目的基因。） 某种生物的 全部 DNA 限制酶 DNA片段 DNA片段与载体连接 重组 DNA 基因组文库 导入受体菌中储存 基因组文库的构建 导入 接种培养 含有四环素的 完全培养基 死 亡 如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？ 接种 培养 含有氨苄青霉素 的完全培养基 死 亡 目的基因 导入 接种培养 含有四环素的 完全培养基 存 活 如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？ 接种 培养 含有氨苄青霉素 的完全培养基 存 活 运载体自连 导入 接种培养 含有四环素的 完全培养基 死 亡 如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？ 接种 培养 含有氨苄青霉素 的完全培养基 存 活