层析分离技术导论课件

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1、层析分离技术导论课件1柱层析分离技术柱层析分离技术 层析分离技术导论课件2n柱层析分离的基本概念及其特点柱层析分离的基本概念及其特点n柱层析分离的分类和基本原理柱层析分离的分类和基本原理n硅胶柱层析的应用硅胶柱层析的应用目录目录层析分离技术导论课件3n柱层析分离是一种物理的分离过程，利用多组柱层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分混合物中各组分的分混合物中各组分的物理化学性质的差异物理化学性质的差异，使，使各组分各组分以不同程度分布在两个相以不同程度分布在两个相（固定相固定相和和流流动相动相）中。）中。n当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学

2、性质的差异，在固定相和流动相之间物理化学性质的差异，在固定相和流动相之间经过经过多次分配多次分配（吸附（吸附-解吸解吸-再吸附再吸附-再解吸再解吸）以以不同的速率移动不同的速率移动，从而达到分离的目的。，从而达到分离的目的。1.柱层析分离的基本概念柱层析分离的基本概念:层析分离技术导论课件4层析分离技术导论课件5n分离效率高分离效率高n应用范围广应用范围广n高灵敏度的在线检测高灵敏度的在线检测n快速分离快速分离n过程自动化操作过程自动化操作2.柱层析分离的特点柱层析分离的特点层析分离技术导论课件6n1.1.按按分离机理分离机理不同分类不同分类n吸附柱层析吸附柱层析n分配柱层析分配柱层析n凝胶过

3、滤柱层析凝胶过滤柱层析n2.2.根据根据流动相的物理形态流动相的物理形态不同分类不同分类n气相柱层析气相柱层析n液相柱层析液相柱层析n超临界柱层析超临界柱层析柱层析的分类柱层析的分类层析分离技术导论课件7柱层析的分类柱层析的分类n3.3.根据根据操作压力操作压力不同分类不同分类n低压低压层析层析分离（分离（0.5MPa）n中压中压层析层析分离（分离（0.55MPa）n高压高压层析层析分离（分离（550MPa）n4.4.根据层析根据层析分离的规模大小分离的规模大小分类分类n分析型（一次进样量分析型（一次进样量10 mg 20 g/d 20 g/d）层析分离技术导论课件8柱层析的基本原理柱层析的基

4、本原理利用待分离物质中各组分与固定相和流动利用待分离物质中各组分与固定相和流动相的相互作用不同，通过多次相互作用将相的相互作用不同，通过多次相互作用将不同组分逐渐分离。不同组分逐渐分离。层析分离技术导论课件9柱层析的基本原理柱层析的基本原理1.吸附层析吸附层析n原理：原理：混合物随流动相通过固定相（吸附剂）混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的时，由于固定相对不同物质的吸附力不同吸附力不同而使而使混合物得到分离。混合物得到分离。n传统吸附剂：传统吸附剂：氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙等。等。n特点：特点：应用最早，价格较低；选择性低。应用最早，价

5、格较低；选择性低。n新型吸附层析技术：新型吸附层析技术：离子交换层析、亲和层析、离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、金属鳌合层析等。疏水作用层析、金属鳌合层析等。层析分离技术导论课件10柱层析的基本原理柱层析的基本原理2.分配层析分配层析n原理：原理：其固定相和流动相都是液体，其原理类其固定相和流动相都是液体，其原理类似于液液萃取，利用混合物中各物质在两液相似于液液萃取，利用混合物中各物质在两液相中的中的分配系数不同分配系数不同而分离。其中，而分离。其中，固定相固定相是由是由固定液与载体结合后固定液与载体结合后形成的。形成的。n正相层析正相层析：固定相为极性，流动相为非极性；固定相为极性，流

6、动相为非极性；n反相层析反相层析：固定相为非极性，流动相为极性。固定相为非极性，流动相为极性。层析分离技术导论课件11柱层析的基本原理柱层析的基本原理3.凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析原理：原理：根据物质分子大小不同而进行分离的色谱根据物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称技术，又称分子筛色谱分子筛色谱。由于大分子和小分子。由于大分子和小分子在通过色谱柱时，所通过得在通过色谱柱时，所通过得路径不同路径不同（大分子（大分子进入空隙，小分子进入孔内），流出色谱柱的进入空隙，小分子进入孔内），流出色谱柱的时间不同时间不同，从而得到分离。其固定相为凝胶，从而得到分离。其固定相为凝胶，流动相可根据实验

7、需要选择不同的缓冲溶液。流动相可根据实验需要选择不同的缓冲溶液。n主要用于主要用于脱盐脱盐、分级分离和分子量测定等。、分级分离和分子量测定等。层析分离技术导论课件12图图9-10 9-10 凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析原理层析分离技术导论课件13层析分离技术导论课件14本章教学要求本章教学要求n基本要求：基本要求：掌握掌握色谱（层析）色谱（层析）分离法的分离法的基本概念和分类，了解常用层析分离基本概念和分类，了解常用层析分离方法的基本原理及应用。方法的基本原理及应用。n重点：重点：凝胶过滤凝胶过滤层析、层析、离子交换离子交换层析层析、亲和亲和层析层析、固定金属离子亲和固定金属离子亲和层析。层析

8、。n难点：难点：常用层析法的分类及其合理选常用层析法的分类及其合理选用。用。层析分离技术导论课件157.1 层析技术导论层析技术导论 n一、层析分离的基本概念及其特点一、层析分离的基本概念及其特点n二、层析分离的分类二、层析分离的分类n三、层析分离的基本原理三、层析分离的基本原理n四、层析四、层析理论理论n五、层析过程和仪器设备五、层析过程和仪器设备层析分离技术导论课件16一、层析分离的基本概念及其特点一、层析分离的基本概念及其特点n层析分离技术早在二十世纪初就已在生产实践中使用。层析分离技术早在二十世纪初就已在生产实践中使用。n19031903年，俄国植物学家年，俄国植物学家茨维特茨维特(T

9、swett)(Tswett)在研究植物叶在研究植物叶子的组成时，用子的组成时，用碳酸钙碳酸钙作吸附剂，用作吸附剂，用石油醚石油醚作为洗脱作为洗脱剂，他把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，剂，他把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒入管中的碳酸钙上，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒入管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内形成了纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内形成了数条相互分离的色带数条相互分离的色带，当时茨维特把这种色带叫作，当时茨维特把这种

10、色带叫作“色谱色谱”（ChromatographieChromatographie）。）。n在这一方法中把玻璃管称为在这一方法中把玻璃管称为“色谱柱色谱柱”，碳酸钙称为，碳酸钙称为“固定相固定相”，纯净的石油醚称为，纯净的石油醚称为“流动相流动相”。因此，。因此，层析分离又称色谱分离（层析分离又称色谱分离（Chromatographic Chromatographic Resolution,CRResolution,CR）或色层分离，）或色层分离，本章统一使用层析分本章统一使用层析分离这一名称。离这一名称。层析分离技术导论课件17 7.1 色谱技术导论色谱技术导论 一、一、层析层析分离的基本概

11、念及其特分离的基本概念及其特点点n层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分混合物中各组分的混合物中各组分的物理化学性质的差异物理化学性质的差异，使各，使各组分组分以不同程度分布在两个相以不同程度分布在两个相（固定相固定相和和流动流动相相）中。）中。n当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差异，在固定相和流动相之间物理化学性质的差异，在固定相和流动相之间经过经过多次分配多次分配（吸附（吸附-解吸解吸-再吸附再吸附-再解吸再解吸）以以不同的速率移动不同的速率移动，从而达到分离的目的。，从而达到分离的目的

12、。1.层析分离的基本概念层析分离的基本概念:层析分离技术导论课件18层析分离技术导论课件19n分离效率高分离效率高n应用范围广应用范围广n高灵敏度的在线检测高灵敏度的在线检测n快速分离快速分离n过程自动化操作过程自动化操作2.柱层析分离的特点柱层析分离的特点层析分离技术导论课件207.1 色谱技术导论色谱技术导论 二、层析分离的分类二、层析分离的分类n1.1.按按分离机理分离机理不同分类不同分类n吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析n2.2.按按固定相形状固定相形状不同分类不同分类n柱层析柱层析、纸层析、薄层层析、纸层析、薄层层析n3.3.根据根据流动相的物理形态流

13、动相的物理形态不同分类不同分类n气相层析、气相层析、液相液相层析、超临界层析层析、超临界层析n4.4.根据根据操作压力操作压力不同分类不同分类n低压低压层析层析分离（分离（0.5MPa）n中压中压层析层析分离（分离（0.55MPa）n高压高压层析层析分离（分离（550MPa）n5.5.根据层析根据层析分离的规模大小分离的规模大小分类分类n分析型（一次进样量分析型（一次进样量10 mg 20 g/d 20 g/d）层析分离技术导论课件217.1 色谱技术导论色谱技术导论三、层析分离的基本原理三、层析分离的基本原理n原理：原理：混合物随流动相通过固定相（吸附混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由

14、于固定相对不同物质的剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不吸附力不同同而使混合物得到分离。而使混合物得到分离。n传统吸附剂：传统吸附剂：氧化铝、硅胶、活性炭、磷氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙等。酸钙等。n特点：特点：应用最早，价格较低；选择性低。应用最早，价格较低；选择性低。n新型吸附层析技术：新型吸附层析技术：离子交换层析、亲离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、金属鳌合层析等。和层析、疏水作用层析、金属鳌合层析等。1.吸附层析吸附层析层析分离技术导论课件227.1 色谱技术导论色谱技术导论三、层析分离的基本原理三、层析分离的基本原理n原理：原理：其固定相和流动相都是液体，其原其固定相和流动相

15、都是液体，其原理类似于液液萃取，利用混合物中各物质在理类似于液液萃取，利用混合物中各物质在两液相中的两液相中的分配系数不同分配系数不同而分离。其中，而分离。其中，固固定相定相是由是由固定液与载体结合后固定液与载体结合后形成的。形成的。n正相层析正相层析：固定相为极性，流动相为非极性；固定相为极性，流动相为非极性；n反相层析反相层析：固定相为非极性，流动相为极固定相为非极性，流动相为极性。性。2.分配层析分配层析层析分离技术导论课件237.1 色谱技术导论色谱技术导论三、层析分离的基本原理三、层析分离的基本原理n原理：原理：根据物质分子大小不同而进行分离的色根据物质分子大小不同而进行分离的色谱技

16、术，又称谱技术，又称分子筛色谱分子筛色谱。由于大分子和小分子。由于大分子和小分子在通过色谱柱时，所通过得在通过色谱柱时，所通过得路径不同路径不同（大分子进（大分子进入空隙，小分子进入孔内），流出色谱柱的入空隙，小分子进入孔内），流出色谱柱的时间时间不同不同，从而得到分离。其固定相为凝胶，流动相，从而得到分离。其固定相为凝胶，流动相可根据实验需要选择不同的缓冲溶液。可根据实验需要选择不同的缓冲溶液。n主要用于主要用于脱盐脱盐、分级分离和分子量测定等。、分级分离和分子量测定等。3.凝胶过滤层析凝胶过滤层析层析分离技术导论课件24图图9-10 9-10 凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析原理层析分离技术导

17、论课件257.1 色谱技术导论色谱技术导论四、四、层析理论层析理论n1分配系数分配系数n2层析曲线层析曲线n3理论塔板数理论塔板数n4分离度分离度层析分离技术导论课件261分配系数分配系数n在层析过程的某一时刻，如果流动相中在层析过程的某一时刻，如果流动相中样品的浓度为样品的浓度为C Cm m，固定相中样品的浓度，固定相中样品的浓度为为C Cs s，n则分配系数则分配系数K K定义为：定义为：K=K=C Cs s/C Cm m。n如果在整个层析过程中，如果在整个层析过程中，C Cm m与与 C Cs s之间呈线之间呈线性关系，即分配系数性关系，即分配系数K K为常数，那么该层析为常数，那么该层

18、析过程称为过程称为线性层析线性层析；n如果如果C Cm m与与 C Cs s之间不存在线性关系，而是出之间不存在线性关系，而是出现其他的函数关系，那么相应的层析分离过现其他的函数关系，那么相应的层析分离过程就称为程就称为非线性层析非线性层析。层析分离技术导论课件271分配系数分配系数n为了更好地描述层析过程中为了更好地描述层析过程中C Cm m与与 C Cs s之间之间的关系的关系n在分配层析中直接用在分配层析中直接用分配系数分配系数K K表示表示n在吸附层析中衍生出在吸附层析中衍生出分离因数分离因数n在凝胶层析中衍生出在凝胶层析中衍生出分配常数分配常数K Kd d层析分离技术导论课件281分

19、配系数分配系数分配系数分配系数K Kn在在分配层析分配层析中中 ，分配系数：分配系数：类似于溶剂类似于溶剂萃取中的分配系数萃取中的分配系数 K=cs/cmncs、cm分别为溶质在固定相和流动相中的浓度，分别为溶质在固定相和流动相中的浓度，nK为分配系数。为分配系数。n在一定温度下，当溶质的浓度较低时，在一定温度下，当溶质的浓度较低时，K为常数为常数线性线性色谱；色谱；n当溶质的浓度较高时，当溶质的浓度较高时，K为溶质浓度的函数为溶质浓度的函数非线性色非线性色谱。谱。n在层析过程中，分配系数较大的组分，迁移速度较在层析过程中，分配系数较大的组分，迁移速度较慢；而分配系数较小的组分，迁移速度较快。

20、因此，慢；而分配系数较小的组分，迁移速度较快。因此，分配系数相差较大的两种物质很容易通过层析过程分配系数相差较大的两种物质很容易通过层析过程进行分离。进行分离。层析分离技术导论课件291分配系数分配系数分离因数分离因数n在在吸附层析吸附层析过程中，为了更好地描述被分离物质在液过程中，为了更好地描述被分离物质在液相和固相中的浓度关系，常采用相和固相中的浓度关系，常采用吸附等温曲线吸附等温曲线来表示。来表示。Cs0CmbCs0CmacCmCs0图图9-2 几种典型的吸附等温线几种典型的吸附等温线a-a-凸凸形形 b-b-凹形凹形 c-Sc-S形形a a单分子层吸附；单分子层吸附；b b多分子层吸附

21、；多分子层吸附；c c单分子层和多分子层混合吸附。单分子层和多分子层混合吸附。层析分离技术导论课件301分配系数分配系数分离因数分离因数n分离因数：分离因数：某一瞬间被吸附的溶质量占总量的分数某一瞬间被吸附的溶质量占总量的分数（表示表示）：）：n=cs/ct=cs/(cs+cm)n0 1：n当当=0时，此种溶质不与固定相产生吸附作用，或固时，此种溶质不与固定相产生吸附作用，或固定相已无空余的结合位点，此时溶随流动相以同样的定相已无空余的结合位点，此时溶随流动相以同样的速度移动；速度移动；n当当=1时，溶质全部被吸附在固定相上，且不随流动时，溶质全部被吸附在固定相上，且不随流动相移动。相移动。n

22、在柱色谱分离中，有效的分离通常要求在柱色谱分离中，有效的分离通常要求 值至少为值至少为0.8。层析分离技术导论课件311分配系数分配系数分配常数分配常数K Kd dn在在凝胶层析凝胶层析中，引入一个中，引入一个分配常数分配常数K Kd d ，它表示某溶质，它表示某溶质分子可以进入凝胶颗粒内部空隙的分数。分子可以进入凝胶颗粒内部空隙的分数。n凝胶色谱柱的总体积凝胶色谱柱的总体积Vt分为三部分：分为三部分：Vt=V0+Vi+VmnV0凝胶颗粒之间空隙的总体积凝胶颗粒之间空隙的总体积（即外水体积）（即外水体积）；nVi凝胶颗粒内部空隙的总体积凝胶颗粒内部空隙的总体积（即内水体积）（即内水体积）；nV

23、m凝胶颗粒基质本身所占体积。凝胶颗粒基质本身所占体积。n某溶质分子充满层析柱的体积（即洗脱容积某溶质分子充满层析柱的体积（即洗脱容积VeVe）为：）为：Ve=V0+Kd Vi Kd=(Ve-V0)/VinVeVe被测分子的保留体积（见层析曲线）被测分子的保留体积（见层析曲线）nV0可采用一个分子量远超过凝胶排阻极限的有色分子来测定，此时可采用一个分子量远超过凝胶排阻极限的有色分子来测定，此时的保留体积的保留体积V1即为层析柱的即为层析柱的V0=V1；nVi可以选用一个可自由扩散的小分子（如中性盐）溶液来测定，此可以选用一个可自由扩散的小分子（如中性盐）溶液来测定，此时的保留体积时的保留体积V2

24、=V0+Vi层析分离技术导论课件321分配系数分配系数分配常数分配常数K Kd dn0 0K Kd d11n当当K Kd d=0=0时，意味着溶质分子完全被排阻于时，意味着溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外，而最先被洗脱；凝胶颗粒的微孔之外，而最先被洗脱；n当当K Kd d=1=1时，意味着溶质分子完全不被排阻，时，意味着溶质分子完全不被排阻，可以自由进入所有凝胶颗粒的微孔中，可以自由进入所有凝胶颗粒的微孔中，而最后被洗脱。而最后被洗脱。n在实际操作时，有时会出现在实际操作时，有时会出现K Kd d11的情况，的情况，表明除了凝胶的分子筛作用外，还存在表明除了凝胶的分子筛作用外，还存在着吸

25、附作用。着吸附作用。层析分离技术导论课件332 2层析曲线层析曲线n在柱层析中，常用层析曲线（又称色谱流出曲线即色在柱层析中，常用层析曲线（又称色谱流出曲线即色谱图）来表示层析效果。谱图）来表示层析效果。图图9-3 9-3 层析曲线示意图层析曲线示意图层析分离技术导论课件342 2层析曲线层析曲线n（1）基线）基线n（2）保留值）保留值n（3）相对保留值）相对保留值n（4）区域宽度）区域宽度层析分离技术导论课件352 2层析曲线层析曲线n无试样通过检测器时，检测到的信号即无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线，在条件稳定时为一直线（如图为基线，在条件稳定时为一直线（如图9-39-3中的中的o

26、tot）。）。（1）基线）基线层析分离技术导论课件362 2层析曲线层析曲线n表示试样中各组分在层析柱内停留的时表示试样中各组分在层析柱内停留的时间数值。通常用时间或相应的流动相体间数值。通常用时间或相应的流动相体积来表示。积来表示。n1 1）时间表示的保留值）时间表示的保留值n2 2）用体积表示的保留值）用体积表示的保留值（2）保留值）保留值层析分离技术导论课件372 2层析曲线层析曲线n保留时间（保留时间（t tR R）：）：组分从进样到柱后出现浓度极组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间（如图大值时所需的时间（如图9-39-3中的中的O OB B）；）；n死时间（死时间（t tM M

27、）：）：不与固定相作用的流动相的保留不与固定相作用的流动相的保留时间（如图时间（如图9-39-3中中O OA A所示）。所示）。n调整保留时间（调整保留时间（t tR R ）：）：指扣除了死时间的保留指扣除了死时间的保留时间（如图时间（如图9-39-3中的中的ABAB），），n t tR R =t tR R-t-tM Mn 注意：当固定相一定，在确定的实验条件下，注意：当固定相一定，在确定的实验条件下，任何物质都有一定的保留时间，它是色谱分析法的任何物质都有一定的保留时间，它是色谱分析法的基本参数。基本参数。（2）保留值）保留值1）时间表示的保留值）时间表示的保留值Rt层析分离技术导论课件38

28、2 2层析曲线层析曲线n保留体积（保留体积（V VR R）：）：指从进样到柱后出现待测指从进样到柱后出现待测组分浓度极大值时所通过的流动相体积。组分浓度极大值时所通过的流动相体积。V VR R =F=F0 0t tR R（F F0 0为层析柱出口处的流动相流量，为层析柱出口处的流动相流量，即体积流动率，单位：即体积流动率，单位：ml/minml/min。）。）n死体积（死体积（V VM M）：）：指层析柱内除了填充物固定指层析柱内除了填充物固定相以外的空隙体积、色谱仪中管路和连接头间相以外的空隙体积、色谱仪中管路和连接头间的空间及检测器空间的总和。的空间及检测器空间的总和。V VM M=F=F

29、0 0t tM Mn调整保留体积（调整保留体积（V VR R）：）：指扣除了死体积后指扣除了死体积后的保留体积。的保留体积。V VR R=V=VR R V VM M 。（2）保留值）保留值2）用体积表示的保留值）用体积表示的保留值层析分离技术导论课件392 2层析曲线层析曲线n指组分指组分2 2和组分和组分1 1调整保留值之比，是一个无因调整保留值之比，是一个无因次量，即：次量，即：r21=tR2 /tR1 =VR2/VR1n注意：相对保留值只与柱温及固定相性质有关，注意：相对保留值只与柱温及固定相性质有关，与其他层析操作条件无关，它表示了层析柱对与其他层析操作条件无关，它表示了层析柱对这两种

30、组分的选择性。这两种组分的选择性。（3）相对保留值）相对保留值r21层析分离技术导论课件402 2层析曲线层析曲线n用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：n1 1）标准偏差）标准偏差：当层析曲线（色谱峰）呈高斯分布时，当层析曲线（色谱峰）呈高斯分布时，曲线两侧拐点之间距离的一半，即峰高曲线两侧拐点之间距离的一半，即峰高0.6070.607倍处峰宽倍处峰宽的一半（如图的一半（如图9-39-3所示）。所示）。n2 2）半峰宽：）半峰宽：峰高一半处色谱峰的宽度。如图峰高一半处色谱峰的宽度。如图9-39-3中的中的GHGH。Z注意：由于半峰宽容易测量，使用

31、方便，所以一般用它来表注意：由于半峰宽容易测量，使用方便，所以一般用它来表示区域宽度。示区域宽度。n 3 3）峰基宽度）峰基宽度WbWb：即通过流出曲线的拐点所作的切线即通过流出曲线的拐点所作的切线在基线的截距，如图在基线的截距，如图9-39-3中中IJIJ所示。所示。WbWb与与的关系：的关系：Wb Wb 44。（4）区域宽度）区域宽度层析分离技术导论课件413理论塔板数理论塔板数n在二十世纪在二十世纪5050年代，层析技术发展的初期，年代，层析技术发展的初期，MartinMartin等等把层析分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验把层析分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论塔板理论

32、用于层析分析法。理论塔板理论用于层析分析法。n反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系高之间的关系n理论塔板数的计算方法：理论塔板数的计算方法：nN=5.54(tR/W1/2)2；N=16(tR/Wb)2nN-理论塔板数理论塔板数 tR-保留时间保留时间nW1/2-半峰宽半峰宽 Wb-峰底宽度峰底宽度n理论塔板高度：理论塔板高度：H=L/NnL-柱长柱长层析分离技术导论课件423理论塔板数理论塔板数n理论塔板高度越低，在单位长度层析柱中就有理论塔板高度越低，在单位长度层析柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。越高的塔板数，则分离

33、效果就越好。n决定理论塔板高度的因素有：决定理论塔板高度的因素有：n固定相的材质、固定相的材质、n层析柱的均匀程度、层析柱的均匀程度、n流动相的理化性质流动相的理化性质n流动相的流速等。流动相的流速等。n由于同一层析柱对不同物质的柱效能不同，故由于同一层析柱对不同物质的柱效能不同，故用用理论塔板数（理论塔板数（n n）和和理论塔板高度（理论塔板高度（H H）表示表示柱效能时应注明被测物质和层析条件。柱效能时应注明被测物质和层析条件。层析分离技术导论课件434 4分离度分离度nRs=（两峰之间的距离）（两峰之间的距离）/（平均（平均峰宽）峰宽）nRs表示色谱峰的分离度表示色谱峰的分离度nRs1，

34、两个峰被完全分开，两个峰被完全分开，即为最佳的分离条件。即为最佳的分离条件。Rs=4Rs=0.6Rs=1层析分离技术导论课件444 4分离度分离度n分离度取决于分离效率和选择性：分离度取决于分离效率和选择性：n分离效率取决于峰宽；分离效率取决于峰宽；n选择性取决于两峰之间的距离。选择性取决于两峰之间的距离。high efficiencylow efficiencyhigh selectivitylow selectivity层析分离技术导论课件457.1 色谱技术导论色谱技术导论五、层析五、层析过程和仪器设备过程和仪器设备n（1 1）装柱）装柱n（2 2）平衡（）平衡（equilibrium)

35、equilibrium)n（3 3）上样）上样(loading)(loading)n（4 4）洗涤）洗涤(washing)(washing)n（5 5）洗脱）洗脱(elution)(elution)n（6 6）清洗与再生）清洗与再生1.色谱过程色谱过程层析分离技术导论课件467.1 色谱技术导论色谱技术导论五、层析五、层析过程和仪器设备过程和仪器设备n调糊：调糊：50%50%n一次连续加入悬浮液一次连续加入悬浮液n打开出口阀：层析剂沉降打开出口阀：层析剂沉降n排除空气排除空气n检查均匀度检查均匀度1.装柱装柱层析分离技术导论课件477.1 色谱技术导论色谱技术导论五、层析五、层析过程和仪器设备

36、过程和仪器设备n用与样品相同的缓冲液对色谱柱进行平用与样品相同的缓冲液对色谱柱进行平衡，直到衡，直到电导率电导率稳定为止。稳定为止。n缓冲液体系包括：缓冲液种类和浓度、缓冲液体系包括：缓冲液种类和浓度、pHpH及盐浓度。及盐浓度。2.平衡（平衡（equilibrium)层析分离技术导论课件487.1 色谱技术导论色谱技术导论五、层析五、层析过程和仪器设备过程和仪器设备n样品处理：样品处理：n溶解溶解n选择合适的缓冲液种类选择合适的缓冲液种类npH pH n盐浓度盐浓度n调整样品浓度调整样品浓度n过滤：除去不溶物过滤：除去不溶物n流速：流速：根据样品浓度与吸附速度而定根据样品浓度与吸附速度而定n

37、上样量：上样量：80%80%交换容量交换容量3.上样上样(loading)层析分离技术导论课件497.1 色谱技术导论色谱技术导论五、层析五、层析过程和仪器设备过程和仪器设备n采用与上样缓冲液相同的缓冲液体系进行洗采用与上样缓冲液相同的缓冲液体系进行洗涤涤除去吸附在树脂表面的蛋白。除去吸附在树脂表面的蛋白。n有时可加入适量表面活性剂（有时可加入适量表面活性剂（0.1-0.5%)0.1-0.5%)；n洗涤体积：根据流出液蛋白浓度而定洗涤体积：根据流出液蛋白浓度而定（A A2802800.050.05）4.洗涤洗涤(washing)层析分离技术导论课件507.1 色谱技术导论色谱技术导论五、层析五

38、、层析过程和仪器设备过程和仪器设备n按操作方式按操作方式nA.恒定洗脱恒定洗脱(isocratic elution)nB.分步洗脱分步洗脱(stage elution)nC.梯度洗脱梯度洗脱(gradient elution)n按洗脱机理按洗脱机理n改变缓冲液盐浓度改变缓冲液盐浓度n改变缓冲液改变缓冲液pHn改变缓冲液盐浓度和缓冲液改变缓冲液盐浓度和缓冲液pHn添加剂：添加剂：表面活性剂、尿素、盐酸胍表面活性剂、尿素、盐酸胍 n洗脱体积：洗脱体积：5倍床体积以上倍床体积以上5.洗脱洗脱(elution)层析分离技术导论课件51A.A.恒定洗脱恒定洗脱Elution(ml)Protein(mg/

39、ml)NaCl(mol/L)00.20.40.60.800.20.40.60.8104080120160200240Na ClProtein层析分离技术导论课件52B.B.分步洗脱分步洗脱Volume(ml)Protein(mg/ml)NaCl(mol/L)00.10.20.30.400.20.40.60.804080120160200240NaClProtein层析分离技术导论课件53C.C.梯度洗脱梯度洗脱Volume(ml)Protein（mg/ml)NaCl(mol/L)00.10.20.30.40.50.600.10.20.30.40.50.60.704080120160200240

40、ProteinNaCl层析分离技术导论课件547.1 色谱技术导论色谱技术导论五、层析五、层析过程和仪器设备过程和仪器设备n2mol/L2mol/L的的盐离子强度盐离子强度n酸：醋酸，酸：醋酸，盐酸盐酸n碱：氨水，碱：氨水，氢氧化钠氢氧化钠n促溶剂：促溶剂：6-8 M 6-8 M 尿素，尿素，6 M6 M盐酸胍盐酸胍n极性溶剂：极性溶剂：20%20%乙醇乙醇n表面活性剂：吐温表面活性剂：吐温-80-80n缓冲液平衡缓冲液平衡6.清洗与再生清洗与再生层析分离技术导论课件557.1 色谱技术导论色谱技术导论五、五、层析过程和仪器设备层析过程和仪器设备2.仪器设备仪器设备（1）普通）普通（2）高级）

41、高级层析分离技术导论课件567.1 色谱技术导论色谱技术导论五、五、层析过程和仪器设备层析过程和仪器设备n（1）泵）泵n（2）色谱柱）色谱柱n（3）检测器）检测器n 紫外吸收检测紫外吸收检测（260nm/280nm/230nm）n 电导检测电导检测n pH检测检测n（4）阀门）阀门n（5）组分收集器）组分收集器n（6）记录仪）记录仪2.仪器设备仪器设备层析分离技术导论课件577.1 层析技术导论层析技术导论小结小结色色谱谱技技术术基本概念基本概念特点特点分离效率高；应用范围广；高灵敏度的在线检测；分离效率高；应用范围广；高灵敏度的在线检测；快速分离；过程自动化操作。快速分离；过程自动化操作。分类分类按按分离机理分离机理不同分类不同分类按按固定相形状固定相形状不同分类不同分类按按流动相的物理形态流动相的物理形态不同分类不同分类按按操作压力操作压力不同分类不同分类按按分离规模大小分离规模大小分类分类基本原理基本原理吸附层析吸附层析分配层析分配层析凝胶层析凝胶层析色谱过程和仪器设备色谱过程和仪器设备层析理论层析理论分配系数分配系数层析曲线层析曲线理论塔板数理论塔板数分离度分离度