蛋白质电泳操作步骤

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1、SDS-PAGE电泳操作步骤:试剂配制 ：（实验中采用均为分析纯）（1） 丙烯酰胺贮液（4C下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久） 丙烯酰胺贮液（ T=30%，C=3%）称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml, 过滤备用。（试剂有毒，操作中注意防护）（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl, pH 6.8） （4C下棕色瓶中储存，试剂尽 量勿存储过久）6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至 50 ml。（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl, pH 8.8） （4C下棕

2、色瓶中储存，试剂尽 量勿存储过久）18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8,再用双蒸水定容至 100 ml。（ 4） 10% SDS（5） 10%过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS 般当天用当天配 制，勿过夜使用。（ 6）尿素（7）TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺）（8）电极缓冲液（1x）（棕色瓶中4C储存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris, 0.192 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（9）电极缓冲液（2x）（棕色瓶中4C储存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris, 0.384 mol/

3、L 甘氨酸，0.1% SDS, pH 8.3（10）样品缓冲液（pH 6.8） （4C下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6 ml 浓缩胶缓冲液（pH 6.8 ） + 4 ml 10% SDS + 0.6 g 二硫苏糖醇（DTT） + 2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.（ 11）考玛斯亮蓝 R-250 染色方法：a. 固定液20%三氯乙酸b. 脱色液250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。c. 染色液称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中样品处理 ：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20C下。Q .Cy

4、tC酶解样每管分别加入 8 pl 细胞色素 C (20 mg/ml), 10 ul 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) ,1 pl胰蛋白酶(细胞色素C：胰蛋白酶=50： 1)。37C水浴，2 h。立即放入-20 C冰箱冷冻保存备用。上样前加15ul上样BUFFER, 75C水浴5-10minQ2. 大肠杆菌蛋白取10UI工程菌种接入10nml LB液体培养基里，过夜培养12h,取出1ml菌液离心 10000g/r，5min。弃上清，用 1ml Tris-Hcl (pH 8.0 50mM)洗涤 1-2 次，后分别加入20ul (pH8.0 5mM)、10UIEDTA，-20C保存。上

5、样前加入2山5%X， 再加入50ul上样BUFFER，75C水浴5-10minQ3 .CytC15I CytC 加入 15I上样 BUFFER，75C水浴 5-10minQ4 .低分子量肽标准取 8-10I Maker (2mg/ml)，加入 10I 上样 buffer，再加入 5I ddH2O, 75 C 水浴 5-10minQ5 .SPI 多肽的制备I材料及试剂(试剂均为分析纯)纯大豆粉木瓜蛋白酶( sigma P3250 500-2000AU/g)正己烷巯基乙醇TrisHCl缓冲液（0.03 M、pH 8.0）0.2 M HCl叠氮钠考马斯亮蓝G250标准牛血蛋白II制备方法i .SP制

6、备：大豆分离蛋白的制备参照Iwabuchi和丫amauchi 9的方法，具 体步骤如下：全脂豆粉加正己烷（1/5）室温下搅拌1 h脱脂，于3 000 g离心5 min, 取沉淀反复脱脂两次，于沉淀中加入1520倍含10 mM巯基乙醇0.03 M、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，室温搅拌12 h,于20 C 6 000 g离心25 min,取 上清液，用0.2 M HCl调节pH至4.8,置于冰箱下层冷沉过夜，再于4 C 9 000 g离心20 min,取沉淀分散于少量水中，调节pH至7.0,搅拌1 h充分溶 解后于4 C下用含0.05 %叠氮钠的蒸馏水透析2 d,再用蒸馏水透析两次去叠

7、氮钠, 冷冻干燥即得大豆分离蛋白（ S P I ） 。（可能透析会损失掉一定量的多肽。） ii.SPI蛋白含量测定：利用考马斯亮蓝蛋白含量测定法，根据牛血蛋白作出的标 准蛋白曲线，测定SPI的蛋白浓度：（具体方法参见生物化学实验原理和方法P174)标准蛋白曲线蛋白浓度测得1% (1mg/ml)的SPI吸光度为0.779，求得即在SPI质量分数为1%的情况 下，其蛋白浓度约为3mg/ml.iii.SPI多肽制备：本实验采用木瓜蛋白酶水解SPI,制取SPI多肽。标准的酶解体 系为溶于0.05 mol/L, pH8.0Tris-HCl缓冲溶液的SPI溶液(质量分数为2%), 含质量分数为0.05%的

8、叠氮钠，先于38C下预热5 min,分别添加蛋白酶至750 AU/mL,然后继续于反应温度下反应，反应时间也很影响SPI多肽的产率，木瓜 蛋白酶持续低温水解16小时也可以产生较多小肽。反应混合物可定期取样并分 别加入X- PAGE样品缓冲液终止反应(1： 1, v/v)。实验上样一般采用过夜酶解透 析样(2%*5%)。上样前应将酶解样与样品缓冲液混合物水浴。操作方法：所制均为 1.0mm 小板所需体积(1) 配制分离胶(16.5%T, 3%C)：丙烯酰胺贮液一3ml分离胶缓冲液一1.5ml 尿素一2.16g 10%SDS72山(2) 配制浓缩胶(4%T, 3%C)丙烯酰胺贮液一0.34ml浓缩

9、胶缓冲液一0.24ml ddH2O1.4ml 10% SDS24山(3) 将上两步配制的分离、浓缩胶真空抽气15min,同时配制10%过硫酸铵： 准确称量O.lg过硫酸铵固体(因其易氧化，操作尽量快，且尽量从底部取样)， 溶于 1ml 双蒸水中，即配即用，低浓度 APS 只限当天使用。(4) 吸取22pl过硫酸铵及5plTEMED于分离胶中，轻轻混匀，灌胶，小心的 在分离胶的表面加封一层水，封住胶面。注意分离胶与浓缩胶的比例。(5) 大约40min,待分离胶聚合形成界面后，吸掉水，加 llpl过硫酸铵及 4plTEMED于浓缩胶中，轻轻混匀，灌注浓缩胶，慢慢斜插入梳子(以免产生气 泡)。胶配制

10、完成之后可直接放置于室温下，而且切忌即配即用及4C下冷藏，应使其 充分凝固，这样可以在一定程度上提高分辨率。( 6 )样品处理【此省略】(7) 上样：将处理好的样品依据其蛋白浓度加入上样buffer，水浴后离心，去 适量体积加入上样孔内，切忌样品直接互相污染(上样量一般8-1如g，视样品 不同而异)(8) 电泳:将电极缓冲液注入电泳槽中。恒流情况下，电压一般设为最大值(300V), 在分离胶内电流一般为 l0mA 左右，大约 30min 左右，样品前沿跑过分、浓界面 后，电流加大为20-25mA，整体电泳时间约2 h；恒压条件下，浓缩胶内电压取 60V，电流一般设最大值，样品跑至分、浓界面后电压加大到120V，整体电泳 时间约 2.5h。(9) 染色：利用考玛斯亮蓝 R-250 染色系统固定、染色和脱色：电泳完毕后， 将胶置于固定液中固定1 h，然后放置于染色液中染色过夜，转置脱色液中脱色， 并多次更换脱色液，直至背景清晰。(10) 观察分析电泳结果