第三章分子克隆工具酶13级

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1、第三章第三章 分子克隆工具酶分子克隆工具酶第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶第二节第二节 甲基化酶甲基化酶第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶第四节第四节 其他分子克隆工具酶其他分子克隆工具酶第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶一、限制与修饰一、限制与修饰二、限制酶识别的序列二、限制酶识别的序列三、限制酶产生的末端三、限制酶产生的末端四、线性四、线性DNA末端对酶切的影响末端对酶切的影响五、酶切反应条件五、酶切反应条件六、酶切位点的引入六、酶切位点的引入一、限制与修饰一、限制与修饰 细菌的限制与修饰系统细菌的限制与修饰系统(R/M系统系统)由限制酶（由限制酶（限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶

2、）和修饰酶（）和修饰酶（甲基甲基化酶化酶）组成。）组成。R/M系统的作用：系统的作用：保护自身的保护自身的DNA不受切割；不受切割；破坏外源破坏外源DNA使之迅速降解。使之迅速降解。噬菌体在不同宿主中的转染频率。噬菌体在不同宿主中的转染频率。（见（见p17）实验说明：实验说明：K菌株和菌株和B菌株中存在一种限制作菌株中存在一种限制作 用，可排除外来的用，可排除外来的DNA.限制酶降解外源限制酶降解外源DNA，维护宿主遗，维护宿主遗传稳定的保护机制传稳定的保护机制识别自身遗识别自身遗传物质和外传物质和外来遗传物质来遗传物质AN6-MeAC5-MeC限制酶的发现限制酶的发现 美国约翰美国约翰.霍布

3、金斯大学的霍布金斯大学的H.Smith于于1970年偶然发现，流感年偶然发现，流感嗜血杆菌嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)能迅速降解外源的噬菌体能迅速降解外源的噬菌体DNA，其细胞提取液可降解，其细胞提取液可降解E.coli DNA，但不能降解自身，但不能降解自身DNA，从而找到，从而找到Hind II限制性内切酶。限制性内切酶。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是一是一类能类能识别双链识别双链DNA中特殊核苷酸序列中特殊核苷酸序列，并使每条，并使每条链的一个链的一个磷酸二酯键断开磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸内切酶。的脱

4、氧核糖核酸内切酶。限制酶的限制酶的生物学功能生物学功能用来保护宿主不受外来用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的的感染，可降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。，从而阻止其复制和整合到细胞中。限制酶的种类限制酶的种类型酶型酶(种类很少，只占种类很少，只占1%)三亚基双功能酶，分子量较大，反应需三亚基双功能酶，分子量较大，反应需Mg2+、ATP有特异识别位点但没有特异切割位点有特异识别位点但没有特异切割位点型酶型酶(占占90%以上以上)分子量较小，反应只需分子量较小，反应只需Mg2+；识别位点是一个回文对称结构，切割位点在识别位点是一个回文对称结构，切割位点在回文对回文对称结构

5、称结构上；上；多数多数型酶切割型酶切割DNA后形成粘性末端后形成粘性末端 型酶型酶(种类更少，不到种类更少，不到1%)二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的3端端2426 bp处切开处切开DNA，切割位点没有特异性。，切割位点没有特异性。限制酶的命名原则限制酶的命名原则第第1个字母：大写，来自微生物属名第个字母：大写，来自微生物属名第1个字母个字母第第2和和3字母：小写，来自微生物种名前两个字母字母：小写，来自微生物种名前两个字母其它字母：大写或小写，来自微生物菌株号其它字母：大写或小写，来自微生物菌株号 罗马数字：该菌罗马数字：该菌株发现的限制酶

6、的编号株发现的限制酶的编号例：例：EcoR I 来源于来源于Escheria coli RY13的第一个限制的第一个限制酶，其识别序列为：酶，其识别序列为：GAATTC；二、限制酶识别的序列二、限制酶识别的序列识别序列的长度识别序列的长度一般为一般为48个碱基，最常见的为个碱基，最常见的为6个碱基个碱基.4 bp识别序列：识别序列：Sau3AI GATC5 bp识别序列：识别序列：EcoR CCWGG(W=A/T)6 bp识别序列：识别序列：EcoR GAATTC7 bp识别序列：识别序列：BbvCI CCTCAGC8 bp识别序列：识别序列：NotI GCGGCCGC当当DNA中可识别的序列

7、在完全随机的情况下：中可识别的序列在完全随机的情况下：识别序列为识别序列为4个碱基时，平均每个碱基时，平均每256个个(44)碱基中会出碱基中会出现一个识别位点；现一个识别位点；识别序列为识别序列为6个碱基时，平均每个碱基时，平均每4096个个(46)碱基中会出碱基中会出现一个识别位点。现一个识别位点。识别序列的结构识别序列的结构大多数为大多数为回文对称结构回文对称结构，切割位点在，切割位点在DNA两条链两条链相对称的位置。相对称的位置。限制酶切割的位置限制酶切割的位置大多数在识别序列的内部，如大多数在识别序列的内部，如EcoRI、SmaI等；等；但也有在外部的：有两端、两侧和单侧之分，如但也

8、有在外部的：有两端、两侧和单侧之分，如Sau3AI(GATC)。三、限制酶产生的末端三、限制酶产生的末端限制酶产生黏性末端限制酶产生黏性末端在对称轴在对称轴5 侧切割底物，侧切割底物，DNA双链交错断开产生双链交错断开产生5 突出黏性末端突出黏性末端，如，如 EcoR I；在在3 3 侧切割，则产生侧切割，则产生3 3 突出黏性末端突出黏性末端，如，如Pst Pst I；限制酶产生平末端限制酶产生平末端在回文对称轴上同时切割在回文对称轴上同时切割DNA两条链，产生平末两条链，产生平末端，如端，如Hpa。限制酶产生非对称突出末端限制酶产生非对称突出末端当识别序列为非对称序列时，切割的当识别序列为

9、非对称序列时，切割的DNA产物的产物的末端是不同的，如末端是不同的，如BbvC的识别切割位点如下：的识别切割位点如下：CCTCAGC GGAGTCG同裂酶同裂酶：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。识别相同序列的限制酶称为同裂酶。同序同切酶：识别序列和切割位置都相同同序同切酶：识别序列和切割位置都相同Hpa与与Msp识别切割位点为识别切割位点为CCGGMob与与Sau3A识别切割位点为识别切割位点为GATC同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同Kpn：GGTACCAcc65：G GTACC“同工多位同工多位”酶：识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶：识别

10、简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。酶的功能。EcoR I：GAATTCApo I:RAATTY (R=A/G Y=C/T)同尾酶同尾酶可产生相同的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。可产生相同的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。同尾酶切割同尾酶切割DNADNA得到的产物可进行互补连接。得到的产物可进行互补连接。EcoR：GAATTCApo I:RAATTYMfe I:CAATTC稀切酶稀切酶有较长的识别序列有较长的识别序列和富含和富含GC或或AT的的识别序列的限制酶称识别序列的限制酶称为稀切酶。为稀切酶。在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。四、线性四、

11、线性DNA末端对酶切的影响DNA末端长度的影响末端长度的影响限制酶切割限制酶切割DNA时，识别序列两端必须时，识别序列两端必须有一定数有一定数量的核苷酸量的核苷酸，否则难以发挥切割活性。，否则难以发挥切割活性。一般在识别序列末端有一般在识别序列末端有3 4个碱基对时能满足常个碱基对时能满足常规的酶切需要。规的酶切需要。位点偏爱位点偏爱(site preference)某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不同的切割效率，这种现象称作位点偏爱。同的切割效率，这种现象称作位点偏爱。pBR322质粒上有质粒上有4个个Nar位点，在标准条件下位点，在标准条件

12、下1单单位位Nar可在可在1h内将内将2个位点完全切割，但另外个位点完全切割，但另外2个位个位点在点在50单位单位16h内也不能切割完全。内也不能切割完全。造成位点偏爱的原因造成位点偏爱的原因在切割在切割DNA之前需要同时与之前需要同时与2个识别位点作用；个识别位点作用；在要切割的在要切割的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是为其中一个是为DNA切割时激活另一个的变构位点。切割时激活另一个的变构位点。五、酶切反应条件缓冲液缓冲液包括包括Tris-HCl、Mg2+、DTT、BSA(小牛血清蛋白小牛血清蛋白)限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低限制

13、酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低3种类型种类型H Buffer(100 mM NaCl)；M Buffer(50 mM)；L Buffer(0 mM)反应温度：大多数为反应温度：大多数为37 反应时间：通常为反应时间：通常为1h1h或更多或更多终止酶切的方法：终止酶切的方法：10 mM EDTA；加热失活；加热失活；苯酚抽提除去蛋白质苯酚抽提除去蛋白质 星星活性星星活性在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。引起星星活性的原因引起星星活性的原因甘油浓度高（甘油浓度高

14、（5%5%）酶过量（酶过量（100 U/100 U/l l）离子强度低（离子强度低（25 mM25 mM）pHpH值过高（值过高（8.0 8.0）加了有机溶剂，如乙醇等加了有机溶剂，如乙醇等降低降低星星活性的措施星星活性的措施减少甘油浓度；减少酶用量；中性减少甘油浓度；减少酶用量；中性pH；提高盐浓度；反；提高盐浓度；反应体系中无有机溶剂；保证使用应体系中无有机溶剂；保证使用Mg2+作为作为2价阳离子价阳离子六、酶切位点的引入将产生的将产生的5 5 突出末端补平后，再连接可产生新的酶突出末端补平后，再连接可产生新的酶切位点切位点同尾末端的连接同尾末端的连接平末端连接平末端连接 第二节第二节 甲

15、基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶 (methylase)的概念的概念甲基化酶是作为甲基化酶是作为限制与修饰系统限制与修饰系统中的一员，用于中的一员，用于保护宿主保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。不被相应的限制酶所切割。甲基化酶与对应的限制酶甲基化酶与对应的限制酶识别相同的序列识别相同的序列，在两，在两条链上对某个碱基进行甲基化。条链上对某个碱基进行甲基化。甲基化酶的种类甲基化酶的种类 在在E.coli中，大多数都有中，大多数都有3个位点特异性的个位点特异性的DNA甲基化酶甲基化酶Dam甲基化酶甲基化酶可在可在GATC序列中腺嘌呤序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基位置上引入甲基当需要在敏感位点上完

16、全切割当需要在敏感位点上完全切割DNA时，可利用时，可利用dam-E.coli扩增并提取扩增并提取DNADcm甲基化酶甲基化酶识别识别CCAGG或或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶序列，在第二个胞嘧啶C 的的C5位置上引入甲基位置上引入甲基EcoK甲基化酶甲基化酶 识别识别AAC(N)6GTGC 和和 GCAC(N)6GTT 序列中序列中A的的N6位置位置 甲基化对限制酶切的影响甲基化对限制酶切的影响修饰酶切位点修饰酶切位点Hinc可识别序列可识别序列GTCGAC，甲基化酶，甲基化酶 M.Taq可可甲基化甲基化 TCGA中的中的A，M.Taq处理处理DNA后，后，GTCGAC 将不受将不受 Hi

17、nc切割切割产生新的酶切位点产生新的酶切位点Dpn是依赖甲基化的限制酶，是依赖甲基化的限制酶，TCGATCGA 受受 M.Taq处理后形成甲基化处理后形成甲基化(A)产物产物 TCG*ATCG*A，其中其中 G*ATC 即为即为 Dpn位点。位点。对基因组作图的影响对基因组作图的影响第三节第三节 DNADNA聚合酶聚合酶一、大肠杆菌一、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶二、二、Klenow DNA聚合酶聚合酶三、三、T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶四、四、T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶五、耐热五、耐热DNA聚合酶聚合酶六、反转录酶六、反转录酶七、末端转移酶七、末端转移酶DNA聚合酶聚合酶(DNA

18、 polymerase)的概念的概念催化催化DNA的合成（在具备模板、引物、的合成（在具备模板、引物、dNTP等的等的情况下情况下)及其相辅的活性。及其相辅的活性。原核细胞有原核细胞有3种种DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶：催化单链或双链：催化单链或双链DNA的延长的延长DNA聚合酶聚合酶：与低分子：与低分子DNA链的延长有关链的延长有关DNA聚合酶聚合酶：促进：促进DNA链延长的主要酶链延长的主要酶大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶功能功能53DNA聚合酶活性聚合酶活性53外切核酸酶活性外切核酸酶活性35外切核酸酶活性外切核酸酶活性用途用途在没有在没有dNTP的情况下，外切活性占主导地位

19、；的情况下，外切活性占主导地位；当存在足够的当存在足够的dNTP时，外切活性和合成活性处在动时，外切活性和合成活性处在动态平衡中，结果使得双链态平衡中，结果使得双链DNA成为平末端。成为平末端。利用利用53外切核酸酶活性外切核酸酶活性,可用可用标记标记DNA。切口平移法标记切口平移法标记DNA，制备分子杂交探针，制备分子杂交探针KlenowDNA聚合酶聚合酶由由E.coli DNA聚合酶聚合酶经蛋白酶裂解后，除去经蛋白酶裂解后，除去5 3 外切核酸酶活性的肽段后的大片段酶。外切核酸酶活性的肽段后的大片段酶。功能功能53DNA聚合酶活性聚合酶活性35外切核酸酶活性外切核酸酶活性用途用途 补平补平

20、DNA的的3凹端凹端 抹平抹平DNA的的3凸端凸端 通过置换反应对通过置换反应对DNA进行末端标记进行末端标记 随机引物标记随机引物标记T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶从从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的一种特殊的DNA聚合酶。聚合酶。功能功能53DNA聚合酶活性聚合酶活性35外切核酸酶活性（外切核酸酶活性（200倍）倍）用途用途35外切核酸酶活性强，且不从单链外切核酸酶活性强，且不从单链DNA模板上替模板上替换引物。在诱变反应中可提高诱变率近一倍。换引物。在诱变反应中可提高诱变率近一倍。T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶来源于来源于

21、T7噬菌体感染的大肠杆菌，是由两种紧密噬菌体感染的大肠杆菌，是由两种紧密结合的蛋白质形成的复合体。结合的蛋白质形成的复合体。功能功能53DNA聚合酶活性聚合酶活性35外切核酸酶活性（外切核酸酶活性（1000倍）倍）应用应用DNA聚合能力强，可用于长模板的引物延伸，在聚合能力强，可用于长模板的引物延伸，在DNA测序中有优势测序中有优势。耐热耐热DNA聚合酶聚合酶指在高温下具有活性的指在高温下具有活性的DNA聚合酶，来自嗜高温聚合酶，来自嗜高温的细菌，主要用于的细菌，主要用于PCR反应。反应。Taq DNA聚合酶聚合酶Vent DNA聚合酶聚合酶PfuDNA聚合酶聚合酶PwoDNA聚合酶聚合酶反转

22、录酶反转录酶(reverse transcriptase)即依赖于即依赖于RNA的的DNA聚合酶，有聚合酶，有53合成合成DNA活性，但是无活性，但是无 35外切核酸酶活性。外切核酸酶活性。禽成髓细胞瘤病毒（禽成髓细胞瘤病毒（AMV）包含两条多肽链，具包含两条多肽链，具 53DNA聚合酶活性和很强聚合酶活性和很强的的RNaseH活性，在活性，在42能有效发挥作用。能有效发挥作用。Moloney鼠白血病病毒（鼠白血病病毒（M-MuLV）单链多肽，其单链多肽，其RNaseH活性弱，有利于合成较长的活性弱，有利于合成较长的cDNA用途：以用途：以mRNA为模板合成为模板合成cDNA；5突出突出DNA

23、的补的补平和标记；平和标记；DNA测序等。测序等。末端转移酶末端转移酶(terminal transferase)来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚聚合酶。合酶。在在Co2+/Mg2+存在下，末端转移酶催化存在下，末端转移酶催化dNTP加于加于DNA分子的分子的3-OH端。端。作用作用标记标记DNA的的3末端末端在在cDNA或载体或载体3末端加同聚尾，便于克隆。末端加同聚尾，便于克隆。第四节第四节 其他分子克隆工具酶其他分子克隆工具酶 一、依赖于一、依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶二、连接酶二、连接酶三、三、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶四、碱性磷

24、酸酶四、碱性磷酸酶五、核酸酶五、核酸酶一、一、依赖于依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶活性活性即转录中的即转录中的RNA合成酶，识别合成酶，识别DNA中各自特异的中各自特异的启动子序列，并沿此启动子序列，并沿此DNA模板起始模板起始RNA的合成。的合成。聚合反应时，无需引物，但需识别特异性位点。聚合反应时，无需引物，但需识别特异性位点。类型类型SP6噬菌体噬菌体RNA聚合酶聚合酶 (来源于感染鼠伤寒沙门氏菌来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株菌株)T4噬菌体噬菌体RNA聚合酶聚合酶T7噬菌体噬菌体RNA聚合酶聚合酶 (来源于噬菌体感染的大肠杆菌来源于噬菌体感染的大肠杆菌)应用：应用：体外合成体外

25、合成RNA分子、表达外源基因。分子、表达外源基因。二、连接酶二、连接酶(ligase)(ligase)连接酶连接酶就是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因就是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的工程中的“糨糊糨糊”。连接酶的种类连接酶的种类T4 DNA连接酶连接酶 (16反应反应)活性：催化活性：催化DNA 5-P与与3-OH之间形成磷酸二酯键。之间形成磷酸二酯键。反应底物：黏端、切口、平末端的反应底物：黏端、切口、平末端的RNA(效率低效率低)或或DNA连接连接大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶：平末端连接效率低。连接酶：平末端连接效率低。Taq DNA连接酶连接酶(4565反应反应)连接双链

26、连接双链DNA中的缺口，不能代替中的缺口，不能代替T4 DNA连接酶。连接酶。T4 RNA连接酶连接酶黏性末端黏性末端DNA片段的连接片段的连接三、三、T4 T4 多核苷酸激酶多核苷酸激酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶是一种磷酸化酶，可将是一种磷酸化酶，可将ATP的的-磷磷酸基团转移到酸基团转移到DNA或或RNA的的5末端。末端。分子克隆中呈现分子克隆中呈现2种反应种反应将将ATP的的-磷酸基团转移到无磷酸的磷酸基团转移到无磷酸的DNA5末端末端在过量在过量ATP存在的情况下，可将存在的情况下，可将DNA的的5-P转移给转移给ADP，然，然后后DNA从从ATP中获得中获得-磷酸而重新磷酸化。磷酸

27、而重新磷酸化。应用应用对缺乏对缺乏5-P的的DNA进行磷酸化进行磷酸化对对DNA末端进行放射性标记（末端进行放射性标记（-32P-ATP）。）。四、碱性磷酸酶四、碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶是一类能催化除去是一类能催化除去DNA或或RNA分子的分子的5 磷酸，使末端转换成磷酸，使末端转换成5-OH的酶的酶。类型类型牛小肠碱性磷酸酶（牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶(BAP)虾碱性磷酸酶虾碱性磷酸酶(SAP)用途用途去除去除5-P，防止，防止DNA片段自身连接片段自身连接标记标记(5端端)前去除前去除DNA或或RNA的的5-P如何解如何解决质粒决质粒自身连自身连接？接？

28、五、核酸酶五、核酸酶 BAL31核酸酶核酸酶具有具有3外切核酸酶活性，可从线性外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的两条链的3端迅速去除单核苷酸。端迅速去除单核苷酸。用途用途从两头缩短从两头缩短DNA，用于构建嵌套缺失体；制作，用于构建嵌套缺失体；制作DNA限限制酶切图。制酶切图。S1核酸酶核酸酶一种单链核酸酶，降解单链一种单链核酸酶，降解单链DNA或或RNA，产生带，产生带 5-P的单核苷酸或寡核苷酸双链。的单核苷酸或寡核苷酸双链。用途用途DNA黏性末端变为平末端，打开双链黏性末端变为平末端，打开双链cDNA合成中产合成中产生的发夹环。生的发夹环。核糖核酸酶核糖核酸酶A(RNase A)内切

29、核酸酶，特异攻击内切核酸酶，特异攻击RNA上嘧啶残基的上嘧啶残基的3端。端。用途用途去除去除DNA样品中的样品中的RNA 核糖核酸酶核糖核酸酶H(RNaseH)内切核酸酶，特异性水解与内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的杂交的RNA上的上的磷酸二酯键，产生带有磷酸二酯键，产生带有3-OH和和5-P末端的产物，末端的产物，不降解单链核酸、不降解单链核酸、dsDNA或或dsRNA.用途用途在在cDNA克隆合成第二链之前去除克隆合成第二链之前去除RNA脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶(DNase)来源于牛胰，为内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷来源于牛胰，为内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链酸

30、的位置水解双链或单链DNA.用途用途去除去除RNA样品中的样品中的DNA切口平移标记时在切口平移标记时在dsDNA上产生随机切口上产生随机切口外切核酸酶外切核酸酶(exonuclease)催化从催化从dsDNA 3-OH端逐一去除单核苷酸的反应。端逐一去除单核苷酸的反应。底物为线状底物为线状dsDNA和带切口或缺口的环状和带切口或缺口的环状DNA.用途用途制备部分截短的制备部分截短的DNA，用作探针，用作探针制备单向缺失的制备单向缺失的DNA等。等。本章涉及基因工程操作中大多数工本章涉及基因工程操作中大多数工具酶的特性及其用途，知识点多，具酶的特性及其用途，知识点多，内容分散，涉及面广，需要花

31、多点内容分散，涉及面广，需要花多点时间复习才能掌握！时间复习才能掌握！本章复习要点1 1、限制性内切酶：分类、命名原则、识别序列、限制性内切酶：分类、命名原则、识别序列、黏性末端、平末端、同裂酶、同尾酶、稀切酶、黏性末端、平末端、同裂酶、同尾酶、稀切酶、酶切反应条件、星星活性等酶切反应条件、星星活性等2、DNA聚合酶：各种酶的活性特点、切口平移聚合酶：各种酶的活性特点、切口平移法标记法标记DNA的原理、各种酶的用途等的原理、各种酶的用途等3、RNA聚合酶的活性与用途聚合酶的活性与用途4、连接酶的类型与用途、连接酶的类型与用途5、T4多核苷酸激酶与碱性磷酸酶区别与用途多核苷酸激酶与碱性磷酸酶区别与用途6、几种核酸酶特点及用途、几种核酸酶特点及用途