生物化学分析：第6章核酸分析

《生物化学分析：第6章核酸分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学分析：第6章核酸分析（78页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、第六章第六章 核酸分析核酸分析 Nucleic Acid Assay核酸（核酸（Nucleic Acid）以以核苷酸核苷酸为为基本组成单位基本组成单位的生物大分子，与蛋白质一样，是一的生物大分子，与蛋白质一样，是一切生物体不可缺少的组成部分（约占细胞干重的切生物体不可缺少的组成部分（约占细胞干重的5 15%）是是生命遗传信息生命遗传信息的的携带者携带者和和传递者传递者，不仅对于生命的延续，生，不仅对于生命的延续，生物物种遗传特性的保持，生长发育，细胞分化等起着重要的作物物种遗传特性的保持，生长发育，细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关用，而且与生物变异，

2、如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关是现代生物化学、分子生物学和医学是现代生物化学、分子生物学和医学的重要研究领域之一的重要研究领域之一核酸的发现和研究工作进展核酸的发现和研究工作进展 1868年年 Fridrich Miescher 从脓细胞中提取从脓细胞中提取“核素核素”1944年年 Avery等人证实等人证实DNA是遗传物质是遗传物质 1953年年 Watson和和Crick发现发现DNA的双螺旋结构的双螺旋结构 1968年年 Nirenberg发现发现遗传密码遗传密码 1975年年 Temin和和Baltimore发现发现逆转录酶逆转录酶 1984年年 Gelbert和和Sanger建立

3、建立DNA测序方法测序方法 1985年年 Mullis发明发明PCR技术技术 1990年年 美国启动美国启动人类基因组计划人类基因组计划（HGP）1994年中国人类基因组计划启动年中国人类基因组计划启动 2001年年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架美、英等国完成人类基因组计划基本框架核酸的分类及分布核酸的分类及分布脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA）90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体、叶绿体和质粒等以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体、叶绿体和质粒等 携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型（携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型（ge

4、notype）核糖核酸核糖核酸(ribonucleic acid,RNA）分布于胞核、胞液分布于胞核、胞液 参与细胞内参与细胞内DNA遗传信息的表达（蛋白质的合成）；有些病毒遗传信息的表达（蛋白质的合成）；有些病毒RNA也可作为遗传信息载体；也可作为遗传信息载体；ribozyme。6-1 核酸的组成和结构（核酸的组成和结构（1）化学组成化学组成 元素组成：元素组成：C、H、O、N、P（910%）分子组成：分子组成：碱基（碱基（base）：嘌呤碱、嘧啶碱）：嘌呤碱、嘧啶碱戊糖（戊糖（ribose）：核糖、脱氧核糖）：核糖、脱氧核糖磷酸（磷酸（phosphate）碱基（碱基（1）嘌呤碱嘌呤碱嘌呤（

5、嘌呤（purine）腺嘌呤腺嘌呤（adenine,A）鸟嘌呤鸟嘌呤（guanine,G）碱基（碱基（2）嘧啶碱嘧啶碱嘧啶（嘧啶（pyrimidine）胞嘧啶（胞嘧啶（cytosine,C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（thymine,T）尿嘧啶（尿嘧啶（uracil,U）戊糖戊糖核糖（核糖（ribose）（构成（构成RNA）脱氧核糖（脱氧核糖（deoxyribose）（构成（构成DNA）6-1 核酸的组成和结构（核酸的组成和结构（2）核苷（核苷（ribonucleoside）的形成）的形成碱基和核糖（脱氧核糖）通过碱基和核糖（脱氧核糖）通过糖苷键糖苷键（戊糖（戊糖C1与嘧啶碱与嘧啶碱N1或嘌呤碱或嘌呤碱

6、N9）连接形成核苷（脱氧核苷）连接形成核苷（脱氧核苷）脱氧核苷：脱氧核苷：dAR、dGR、dTR、dCR 核苷：核苷：AR、GR、UR、CR6-1 核酸的组成和结构（核酸的组成和结构（3）核苷酸（核苷酸（ribonucleotide）的形成）的形成核苷（脱氧核苷）和磷酸以核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键（磷酸酯键（5 位）位）连接形成核连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）苷酸（脱氧核苷酸）脱氧核苷酸：脱氧核苷酸：dAMP、dGMP、dTMP、dCMP 核苷酸：核苷酸：AMP、GMP、UMP、CMPPOOHOHO体内重要的游离核苷酸及其衍生物体内重要的游离核苷酸及其衍生物 多磷酸核苷酸：多磷酸核苷酸：A

7、MP、ADP、ATP 环化核苷酸：环化核苷酸：cAMP、cGMP 含核苷酸的生物活性物质含核苷酸的生物活性物质：NAD+、NADP+、CoA-SH等等 NAD NADPcAMP6-1 核酸的组成和结构（核酸的组成和结构（4）核苷酸的连接核苷酸的连接核苷酸之间以核苷酸之间以磷酸二酯键磷酸二酯键连接连接形成多核苷酸链，即核酸。形成多核苷酸链，即核酸。核苷酸的一级结构核苷酸的一级结构核酸中核苷酸的排列顺序，由于核苷核酸中核苷酸的排列顺序，由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为称为碱基序列碱基序列。核苷酸一级结构的书写方法核苷酸一级结构的书写方法3OHpApCpT

8、pGpT5 3ACTGT5人类基因组计划人类基因组计划2001 年年2月月16日，日，人类基因组计划人类基因组计划（HGP）完成，）完成，测出人类全套基因组的测出人类全套基因组的 DNA 碱基序列（碱基序列（3 109 bp），中国科学家做出了其中），中国科学家做出了其中1%的贡献。的贡献。目前估计，目前估计，3 109 bp中仅中仅 5编码蛋白质；编码蛋白质；95不不编码蛋白质。编码蛋白质。6-1 核酸的组成和结构（核酸的组成和结构（5）DNA的二级结构的二级结构双螺旋结构双螺旋结构1953年，年，J.Watson和和F.Crick 在前人研究工在前人研究工作的基础上，根据作的基础上，根据D

9、NA结晶的结晶的X-衍射图谱和衍射图谱和分子模型，提出了著名的分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。释和预测。双螺旋结构的研究背景双螺旋结构的研究背景碱基组成分析碱基组成分析Chargaff规则：规则：A=T；G=C 碱基的理化数据分析碱基的理化数据分析A-T、G-C以氢键配对较合理以氢键配对较合理DNA钠盐钠盐X-射线衍射图谱分析射线衍射图谱分析X-射线衍射数据说明射线衍射数据说明DNA含有含有2条或条或2条以条以上的具有螺旋结构的多核苷酸链，螺旋直上的具有螺旋结构的多核苷酸链，螺旋直径径2

10、nm，而且沿，而且沿DNA长轴有长轴有0.34 nm和和3.4 nm两个周期性变化。两个周期性变化。DNA双螺旋结构模型的要点（双螺旋结构模型的要点（1）DNA分子由两条相互平行走反相的脱分子由两条相互平行走反相的脱氧多核苷酸链组成，两链以氧多核苷酸链组成，两链以脱氧核脱氧核糖糖磷酸磷酸为骨架，以右手螺旋方式为骨架，以右手螺旋方式绕一公共轴盘。螺旋直径为绕一公共轴盘。螺旋直径为2 nm，形，形成成大沟大沟（majior groove）和小沟）和小沟（manor groove)相间相间 碱基垂直螺旋轴居双螺旋两侧，与对碱基垂直螺旋轴居双螺旋两侧，与对侧碱基形成氢键配对（互补配对形式：侧碱基形成氢

11、键配对（互补配对形式：A=T；G C）相邻碱基平面距离相邻碱基平面距离0.34 nm，螺旋一圈，螺旋一圈螺距螺距3.4 nm，一圈，一圈10对碱基对碱基碱基互补配对碱基互补配对ATGCDNA双螺旋结构模型的要点（双螺旋结构模型的要点（2）氢键氢键（虽然作用力较弱，但数目众（虽然作用力较弱，但数目众多）维持双链多）维持双链横向横向稳定性，稳定性，碱基堆碱基堆积力积力（相邻碱基平面非常接近，芳（相邻碱基平面非常接近，芳杂环上杂环上 电子云交错产生一定吸引电子云交错产生一定吸引力力）维持双链）维持双链纵向纵向稳定性。各种阳稳定性。各种阳离子，如多胺、组蛋白、离子，如多胺、组蛋白、Na+、K+、Mg2

12、+能与能与DNA分子中带负电荷的分子中带负电荷的磷酸基团作用，降低了两条磷酸基团作用，降低了两条DNA链链之间的静电排斥力，也有助于双螺之间的静电排斥力，也有助于双螺旋的稳定。旋的稳定。双螺旋结构的多样性双螺旋结构的多样性 Watson和和Crick提出的提出的DNA双双螺旋构象现在称为螺旋构象现在称为B-DNA，它代表它代表DNA钠盐在相对湿度钠盐在相对湿度92%制得的纤维的结构，比较制得的纤维的结构，比较接近生理条件下细胞内大部分接近生理条件下细胞内大部分DNA的构象。的构象。DNA还有其它双螺旋构象类还有其它双螺旋构象类型：型：A、C、D、E、Z型。另型。另外还有三股螺旋外还有三股螺旋D

13、NADNA双螺旋结构提出的生物学意义双螺旋结构提出的生物学意义DNA 双螺旋模型确认了碱基配对原则，这是双螺旋模型确认了碱基配对原则，这是DNA复复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。表达的分子基础。它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石，被誉为速发展的基石，被誉为20世纪最伟大的发现之一。世纪最伟大的发现之一。1962年，沃森和克里克与莫里斯年，沃森和克里克与莫里斯威尔金斯一起因发威尔金斯一起因发现现DNA双螺旋结构赢得了诺贝尔奖。双螺旋结构赢得了诺贝尔奖

14、。DNA在真核生物细胞核内的组装在真核生物细胞核内的组装真核生物染色体是由真核生物染色体是由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核和蛋白质构成，其基本单位是核小体（小体（nucleosome）l核小体的组成核小体的组成DNA：约：约200 bp组蛋白组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4schromosomeUnravel the chromosome由核小体构成的念珠状结构进一步盘绕折叠，形成外径由核小体构成的念珠状结构进一步盘绕折叠，形成外径30 nm的螺线管，的螺线管，这种结构就是染色质丝。螺线管在经多次折叠，形成高度压缩的染色体，这种结构就是染色质丝。螺线管在经多次折叠，形成高度压缩的染

15、色体，DNA分子被压缩近万倍。分子被压缩近万倍。DNA的功能的功能DNA的基本功能是以的基本功能是以基因基因的形式荷载遗传信息，并作为基的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，越是个因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，越是个体生命活动的信息基础。体生命活动的信息基础。基因从结构上定义基因从结构上定义，是指，是指DNA分子中的特定区段，其中的分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序核苷酸排列顺序决定了基因的功能。决定了基因的功能。6-1 核酸的组成和结构（核酸的组成和结构（6）RNA的结构的结构RNA是单链分子，因此不遵守碱基种类的数量比例关系，即分是单链分

16、子，因此不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。但子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。但RNA分子分子的部分区域也能形成双螺旋结构，不过碱基的配对情况不象的部分区域也能形成双螺旋结构，不过碱基的配对情况不象DNA中严格（中严格（G 除了可以和除了可以和C 配对外，也可以和配对外，也可以和U 配对）配对）RNA的类型与功能的类型与功能6-2 核酸的理化性质（核酸的理化性质（1）核酸的两性性质及等电点核酸的两性性质及等电点 与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基）

17、，因此也具有两性性质；团（氨基），因此也具有两性性质；磷酸是一个中等强度的酸，而嘌呤和嘧啶都是弱碱性，因此核酸的等磷酸是一个中等强度的酸，而嘌呤和嘧啶都是弱碱性，因此核酸的等电点较低：电点较低：DNA为为44.5；RNA为为22.5；RNA分子中核糖基分子中核糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离，而通过氢键促进了磷酸基上质子的解离，而DNA没有这种作用，因此导致没有这种作用，因此导致RNA的等电点比的等电点比DNA低。低。凝胶电泳是核酸研究中最常用的方法凝胶电泳是核酸研究中最常用的方法核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳在中性或偏碱缓冲液中，核酸解离成阴离子，在电场在中性或偏碱缓冲液中，核酸解

18、离成阴离子，在电场中向阳极移动。中向阳极移动。迁移率与核酸的大小和构象有关，可用于核酸的分离、迁移率与核酸的大小和构象有关，可用于核酸的分离、鉴定。鉴定。溴化乙啶染色溴化乙啶染色6-2 核酸的理化性质（核酸的理化性质（2）核酸的沉降特性核酸的沉降特性proteinDNARNAproteinRNA DNAercoiledsupPlasmidDNAlinearlChromosomaionconcentratCsCl gsinIncreal可利用离心技术来纯化可利用离心技术来纯化DNA6-2 核酸的理化性质（核酸的理化性质（3）核酸水解核酸水解 酸或碱水解：酸或碱水解：即核酸分子中的磷酸二酯键在酸或

19、碱性条件下水即核酸分子中的磷酸二酯键在酸或碱性条件下水解切断。解切断。RNA核糖基上核糖基上2-OH的邻基参与作用使得其更易水解，的邻基参与作用使得其更易水解，如：如：0.1 mol/L NaOH溶液中，溶液中，RNA几乎可以完全水解，而几乎可以完全水解，而DNA则不受影响。则不受影响。酶水解：酶水解：生物体内存在多种生物体内存在多种DNA水解酶（水解酶（DNases）和）和RNA水水解酶（解酶（RNases），根据其作用方式可以分为外切酶、内切酶和），根据其作用方式可以分为外切酶、内切酶和限制性内切酶。限制性内切酶。核酸酶（核酸酶（1）依据底物不同分类依据底物不同分类lDNA酶（酶（deox

20、yribonuclease，DNase）专一降解）专一降解DNAlRNA酶（酶（ribonuclease，RNase）专一降解）专一降解RNA依据切割部位不同依据切割部位不同l核酸内切酶：分为限制性和非特异性核酸内切酶：分为限制性和非特异性l核酸外切酶：核酸外切酶：5-3 型或型或3-5 型型指所有可以水解核酸的酶指所有可以水解核酸的酶核酸酶（核酸酶（2）功能功能负责细胞内外催化核酸的降解负责细胞内外催化核酸的降解 参与参与DNA的合成与修复及的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程表达过程 负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，也可清除浸入

21、细胞的外源负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，也可清除浸入细胞的外源性核酸性核酸 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 体外重组体外重组DNA技术中的重要工具酶技术中的重要工具酶镰状红细胞贫血患者基因组的限制性内切酶的分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性内切酶的分析6-2 核酸的理化性质（核酸的理化性质（4）核酸（碱基）的吸收光谱核酸（碱基）的吸收光谱pH7.0时各碱基的吸收光谱时各碱基的吸收光谱nm260 腺嘌呤腺嘌呤6-2 核酸的理化性质（核酸的理化性质（5）DNA的变性（的变性（denaturation）定义：定义：某些理化因素作用下，某些理化因素作用下

22、，DNA双链解开成两条单链的过程双链解开成两条单链的过程 方法：方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、酰胺及某些有机过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、酰胺及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等溶剂如乙醇、丙酮等 变性后其它理化性质变化变性后其它理化性质变化A260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性丧失曲线改变；生物活性丧失DNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂DNA变性引起紫外吸收值的改变变性引起紫外吸收值的改变 增色现象：增色现象：DNA变性时，变性时，260 nm处吸收增大的现象（处吸收增大

23、的现象（2540%）热变性与融解温度热变性与融解温度 解链曲线：解链曲线：如果在连续加热如果在连续加热DNA的的过程中以温度对过程中以温度对A260作图，所得的曲作图，所得的曲线称为解链曲线。线称为解链曲线。Tm：变性是在一个相当窄的温度范变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的吸收值达到最大值的50%时的温度时的温度称为称为DNA的解链温度，又称融解温的解链温度，又称融解温度（度（melting temperature,Tm），其），其大小与大小与G+C含量成正比。含量成正比。44.23.69T%CGm 通常通常Tm在在8295

24、oC之间之间6-2 核酸的理化性质（核酸的理化性质（6）DNA分子的复性分子的复性（renaturation）适当条件下，变性适当条件下，变性DNA的两条互补链恢复天然双螺旋构象的两条互补链恢复天然双螺旋构象的现象。的现象。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火（annealing）减色效应减色效应：DNA复性时，复性时，A260降低降低6-3 核酸的定量及结构分析核酸的定量及结构分析光谱分析光谱分析电泳及色谱分析电泳及色谱分析免疫分析免疫分析光谱法光谱法电子光谱法：电子光谱法：UV-Vis、MFS、园二色光谱（、园二色光谱（CD）等

25、）等振动光谱法：振动光谱法：IR、拉曼、振动园二色光谱（、拉曼、振动园二色光谱（VCD）等）等核磁共振光谱核磁共振光谱l电子光谱法具有较高的灵敏度，但是特征性不强，因此常电子光谱法具有较高的灵敏度，但是特征性不强，因此常用于定量，不能提供太多与结构相关的信息；振动及核磁用于定量，不能提供太多与结构相关的信息；振动及核磁可提供更多有关核酸分子状态及其不同部位变化的信息。可提供更多有关核酸分子状态及其不同部位变化的信息。紫外可见吸收光谱（紫外可见吸收光谱（1）lDNA或或RNA的定量的定量OD260（A260）=1.0相当于相当于50 g/mL 双链双链DNA 40 g/mL 单链单链DNA（或（

26、或RNA）20 g/mL 寡核苷酸寡核苷酸l判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度（主要是蛋白质的干扰）（主要是蛋白质的干扰）DNA纯品：纯品：RNA纯品：纯品：8.1OD/OD280260 2OD/OD280260 紫外可见吸收光谱（紫外可见吸收光谱（2）显色法显色法 定磷法定磷法 DNA含量含量=（总磷量（总磷量无机磷量）无机磷量）/0.099 RNA含量含量=（总磷量（总磷量无机磷量）无机磷量）/0.095）磷钼蓝（磷钼蓝（还原剂还原剂660nm-650)MoO(PHMoOHPOHmax41034243 紫外可见吸收光谱（紫外可见吸收光谱（3）显色法显色法 二苯胺显色法测定二苯胺显色法测定

27、DNA2-脱氧核糖与二苯胺酸性环境下可形成蓝色物质（脱氧核糖与二苯胺酸性环境下可形成蓝色物质（max=595 nm），），脱氧木糖、阿拉伯糖有干扰，核糖等无此反应。脱氧木糖、阿拉伯糖有干扰，核糖等无此反应。地衣酚显色法测定地衣酚显色法测定RNARNA与浓与浓HCl共热后降解为糠醛，能与共热后降解为糠醛，能与3,5-二羟基甲苯（地衣酚）形二羟基甲苯（地衣酚）形成鲜绿色物质（成鲜绿色物质（max=670 nm）。该反应特异性差，）。该反应特异性差，DNA等也有干扰，等也有干扰，测定时需进行扣除。测定时需进行扣除。荧光法（荧光探针法）荧光法（荧光探针法）核酸及其碱基常温下荧光量子产率极低，可以利用具

28、有荧光的核酸及其碱基常温下荧光量子产率极低，可以利用具有荧光的有机染料与其结合后荧光性质的变化进行定量测定，也可实现有机染料与其结合后荧光性质的变化进行定量测定，也可实现DNA某些相关结构的信息。某些相关结构的信息。常用荧光染料：溴乙啶（常用荧光染料：溴乙啶（EB）、碘丙啶、吖啶橙等）、碘丙啶、吖啶橙等结合物的结合物的 ex=530 nm；em=620 nm电泳及色谱分析电泳及色谱分析电泳技术是目前核酸研究中最常用的技术。其与限制电泳技术是目前核酸研究中最常用的技术。其与限制性内切酶技术的结合在性内切酶技术的结合在DNA和和RNA的结构、序列及的结构、序列及功能分析中起着非常重要的作用。功能分

29、析中起着非常重要的作用。免疫分析免疫分析DNA和和RNA的免疫应答非常低的免疫应答非常低（why?），但是有些构型，但是有些构型的的DNA经化学修饰后可诱导产生高特异性的抗体以用于相经化学修饰后可诱导产生高特异性的抗体以用于相应应DNA的分析。的分析。免疫分析法对于高特异性地确定各种碱基及构型，检测不免疫分析法对于高特异性地确定各种碱基及构型，检测不同构型同构型DNA间的转化及在复杂细胞环境中间的转化及在复杂细胞环境中DNA的修饰都的修饰都是非常有用的。是非常有用的。6-4 聚合酶链反应（聚合酶链反应（1）PCR（Polymerase Chain Reaction）First put forw

30、ard by Kary Mullis in 19851993 Nobel Prize in Chemistry6-4 聚合酶链反应（聚合酶链反应（2）PrinciplelMulliss idea was to develop a process by which DNA could be artificially multiplied through repeated cycles of duplication driven by an enzyme called DNA polymerase.lA methed for amplifying(creating multiple copies

31、of)DNA without using a living organism.lThe PCR is a temperature controlled and enzyme catalyzed process which consists of the periodical repetition of three reactions at different temperature.6-4 聚合酶链反应（聚合酶链反应（3）意义意义l是一种特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动是一种特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化的体外核酸扩增技术，能在一个试管内将所要研究的目的基化

32、的体外核酸扩增技术，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断（能直接观察和判断（可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定）供分析研究和检测鉴定）。l生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。6-4 聚合酶链反应（聚合酶链反应（4）PCR反应反应5要素要素 模板（经适当方法提纯）模板（经适当方法提纯）引物（引物（20bp左右）左右）DNA聚合酶（由嗜温细菌提取，聚合

33、酶（由嗜温细菌提取，Taq polymerase+Mg2+）DNTP（脱氧核糖三磷酸）（脱氧核糖三磷酸）缓冲溶液缓冲溶液PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 PCR技术的特点技术的特点高度的特异性高度的特异性：引物的限定，高温扩增。：引物的限定，高温扩增。高度的敏感性高度的敏感性：微量样品（单拷贝基因、单个细胞、：微量样品（单拷贝基因、单个细胞、一根头发等），高效

34、性（一根头发等），高效性（106）。）。操作简便快速操作简便快速，易于自动化、程序化，方法稳定。，易于自动化、程序化，方法稳定。对标本的纯度要求底对标本的纯度要求底：纯化或粗制的，新鲜或陈旧：纯化或粗制的，新鲜或陈旧的，各种细胞，体液，完整的或降解的的，各种细胞，体液，完整的或降解的DNA。PCR技术类型技术类型反向反向PCR不对称不对称PCRRT-PCR差异显示差异显示PCR 实时定量实时定量PCR 锚定锚定PCR原位原位PCR 重组重组PCR免疫免疫PCR多重多重PCRPCR检测病原体检测病原体 临床上检测病原体通常有三类方法：临床上检测病原体通常有三类方法：病原菌和病毒的生病原菌和病毒的

35、生物培养富集；物培养富集；病原菌和病毒的抗原免疫检测；病原菌和病毒的抗原免疫检测；病原菌病原菌和病毒核酸特征序列的和病毒核酸特征序列的PCR检测。检测。相比较而言，相比较而言，PCR检测法在很多情况下不需要培养。这不检测法在很多情况下不需要培养。这不仅省时，更重要的是很多病原微生物难以培养，如某些病仅省时，更重要的是很多病原微生物难以培养，如某些病毒、真菌厌氧菌、支原体等；毒、真菌厌氧菌、支原体等；PCR检测法比免疫分析法更检测法比免疫分析法更廉价；廉价；PCR检测法可以使用多重引物同时检测若干种病原检测法可以使用多重引物同时检测若干种病原微生物；微生物；PCR检测程序已自动化。检测程序已自动

36、化。PCR临床诊断术临床诊断术 检测病变基因的缺失或缺损检测病变基因的缺失或缺损（扩增产物变小或无扩增）（扩增产物变小或无扩增）检测病变基因的点突变检测病变基因的点突变（扩增产物电泳迁移率改变）（扩增产物电泳迁移率改变）检测病变基因的重排检测病变基因的重排（扩增产物大小改变）（扩增产物大小改变）检测病变检测病变mRNA的结构的结构（扩增产物大小改变）（扩增产物大小改变）检测染色体易位检测染色体易位（扩增产物大小改变）（扩增产物大小改变）骨髓移植的骨髓移植的PCR指纹图谱快速配型指纹图谱快速配型（随机引物扩增）（随机引物扩增）6-5 DNA序列测定序列测定特异性化学裂解法特异性化学裂解法Sang

37、er链终止链终止DNA测序法测序法DNA测序仪测序仪特异性化学裂解法（特异性化学裂解法（1）将待测将待测DNA用限制性核酸内切酶处理成可操作长度的用限制性核酸内切酶处理成可操作长度的DNA片段片段 变性和电泳分离后获得单链变性和电泳分离后获得单链DNA片段片段 酶法对酶法对5 末端进行标记末端进行标记碱性磷酸酯酶水解碱性磷酸酯酶水解HO多核苷酸激酶多核苷酸激酶ATPP32 ADPP32四种特异性化学切割反应四种特异性化学切割反应硫酸二甲酯硫酸二甲酯甲基化嘌呤，然后糖苷键断裂，进一步甲基化嘌呤，然后糖苷键断裂，进一步糖环被消除（糖环被消除（G的甲基消除比的甲基消除比A快，酸快，酸处理后处理后A的

38、速加快）的速加快）肼肼与嘧啶特异性反应，并使其消除，与嘧啶特异性反应，并使其消除，2 M NaCl存在下可抑制存在下可抑制T的反应。的反应。特异性化学裂解法（特异性化学裂解法（2）特异性反应后进行凝胶电泳特异性反应后进行凝胶电泳 需要需要DNA量大量大nA+GGCC+T876543213CTAGTAC5Sanger链终止链终止DNA测序法（测序法（1）CGTADNTPDNA、聚合酶聚合酶Sanger链终止链终止DNA测序法（测序法（2）测序方法的改进测序方法的改进基于凝胶基础上的改进基于凝胶基础上的改进 高效毛细管凝胶电泳法高效毛细管凝胶电泳法 集成芯片毛细管电泳集成芯片毛细管电泳 超薄层板凝

39、胶电泳超薄层板凝胶电泳非凝胶非凝胶DNA测序研究进展测序研究进展 质谱法质谱法 杂交测序法杂交测序法 原子探针显微镜法原子探针显微镜法 流动式分子荧光检测法流动式分子荧光检测法DNA测序仪测序仪采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用用四色专利荧光染料标记的四色专利荧光染料标记的ddNTP（终止反应物），通过（终止反应物），通过单引物单引物PCR反应，生成的反应，生成的PCR产物则是相差产物则是相差1个碱基的个碱基的3 末端为末端为4种不同荧光染料的单链种不同荧光染料的单链DNA混合物，在同一根毛混合物，在同一根毛细管柱上进行电泳，

40、当不同标记染料片段经过检测器时可细管柱上进行电泳，当不同标记染料片段经过检测器时可被自动检测，本根据其所发射的荧光波长自动确定所标记被自动检测，本根据其所发射的荧光波长自动确定所标记碱基类型，并自动转化为碱基类型，并自动转化为DNA序列。该仪器自动化程度极序列。该仪器自动化程度极高，高，2.5 h左右可完成测序工作，适用于多种与左右可完成测序工作，适用于多种与DNA序列序列相关的测定工作。相关的测定工作。DNA测序仪结构示意图测序仪结构示意图DNA测序仪实物图测序仪实物图Fluorescent DNA Sequencing Data（ABI 377）lanes 486-6 核酸分子杂交分析（核

41、酸分子杂交分析（1）核酸分析杂交（核酸分析杂交（hybridization）在在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链（的分子间形成杂化双链（heteroduplex）。）。这种杂化双链可以在不同的这种杂化双链可以在不同的DNA和和DNA间形成，也可以在间形成，也可以在DNA

42、和和RNA间形成，这种现象称为核酸分子杂交。间形成，这种现象称为核酸分子杂交。DNA的变性、复性与分子杂交的变性、复性与分子杂交DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子不同来源的不同来源的DNA分子分子DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子DNA-RNA杂交双链分子杂交双链分子6-6 核酸分子杂交分析（核酸分子杂交分析（2）核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用 研究研究DNA分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置 确定两种核酸分子间的序列相似性确定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否检测某些专一序列在待检样品中存在与否 基因芯片技术的基础基因芯片技术的基础核酸探

43、针的标记核酸探针的标记放射性同位素标记放射性同位素标记非同位素标记非同位素标记 生物素标记生物素标记 酶标记酶标记 半抗原标记半抗原标记 荧光或化学发光试剂标记荧光或化学发光试剂标记Souther印迹法图解印迹法图解考试及实验安排考试及实验安排 考试时间：考试时间：2015年年5月月26号号第第13周周二晚上周周二晚上19:00-21:00 考试地点：考试地点：33603 考试题型：考试题型：单选单选20题，共题，共30分分 填空填空20题，共题，共30分分 计算题，约计算题，约10分分 简答题，约简答题，约30分分 考试资料：考试资料：课件课件+随意准备随意准备 实验安排实验安排实验时间实验时间11-14周上午或下午，周上午或下午，实验内容及安排见所发资料。实验内容及安排见所发资料。讲义直接打印后可作为实验报讲义直接打印后可作为实验报告，但实验前请做好预习。告，但实验前请做好预习。祝祝 大大 家家 考考 试试 顺顺 利！利！