温自家抗体的血清学检测.ppt

《温自家抗体的血清学检测.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《温自家抗体的血清学检测.ppt（50页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、 温自家抗体的血清学检测 北京市红十字血液中心 范道旺 溶血性贫血的分类 自家免疫性溶血性贫血 药物诱导免疫性溶血性贫血 同种免疫引起的免疫性溶血性贫血 新生儿溶血 溶血性输血反应 自家免疫性溶血性贫血 溶血类型： 所占比例（ %） 温自家溶血性贫血（ WAIHA） 4870 冷凝集素病（ CHD) 1632 混合型（即温型和冷型并发） 78 突发性冷型血红蛋白尿症（ PCH) 2，主要见于 儿童 DAT-阴性溶血性贫血 1218 免疫性溶血性贫血血清学特征 WAIHA CHD 混合 AIHA PCH 药物诱导 占有率 4870% 1632% 78% 2%，主要儿童 1218% DAT IgG

2、: 单纯 C3 IgG+C3 单纯 C3 IgG 2060% 9198% 71100% 94100% 94% IgG+C3 IgG+C3 2463% 6% C3:714% 抗体类型 主要 IgG IgM IgG, IgM IgG IgG 放散液 IgG 无 IgG 无 IgG 特异性 主要是 Rh 主要抗 -I 抗 -P 系统抗体 不同 AIHA患者 DAT反应特征 DAT IgG C3 血清特征 放散液特征 WAIHA + + 57%有 IgG自家抗体 有 IgG,与正常 细胞反应 + 0 0 + CHD 0 + 存在 IgM自家抗体 无反应活性 检测温自身抗体的目的 用于确定： 是否有温自

3、身抗体致敏在患者自身红细 胞上 患者血清中是否存在温自身抗体 患者血清中是否同时存在同种抗体 据报道： 1540%的有免疫史的 WAIHA 患者血清中伴随有同种抗体。 温自身抗体引发的血清学问题 ABO定型 Rh定型 DAT试验 抗体筛查及抗体鉴定 自身抗体的评价 同种抗体的筛查和鉴定 自家凝集导致的 ABO正反定型不相符 正定 （抗体血清） 反定 （试剂红细胞） 抗 -A 抗 -B 抗 -D 阴性对照 A细胞 B细胞 w+ w+ 3+ w+ 4+ 4+ 对于极端的个例，包被了大量的 IgG抗体红细胞在定型血 清中会发生自发的凝集，使用试剂的稀释液作为阴性对照 ，可以发现出现弱的自发凝集产生的

4、阳性反应，从而干扰 定型。 一般而言，由于温自身抗体属于不完全抗体，即使包被大 量此抗体的红细胞，正定型时与抗 -A或抗 -B混合后，也不 会自发凝集。同样，反定型时血清中的温自身抗体和反定 型红细胞在室温盐水介质也不产生凝集反应。 WAIHA患者的 Rh定型 由于盐水介质抗 -D试剂中添加了增强剂，因此 ，容易导致包被温自身抗体的 D（ -）红细胞自 发凝集，产生假阳性，因此必须要用试剂厂商 的试剂稀释液做阴性对照。只有阴性对照为阴 性时结果才可靠 (在订购试剂时要含有阴性对照 ）。 红细胞包被的 IgG抗体不能通过洗涤而除去， 因此，为了准确定型，必须采用放散的方法来 除去包被在红细胞上的

5、 IgG抗体，得到 DAT阴 性的红细胞来定型。 DAT阴性红细胞的制备 甘氨酸 -EDTA法 二磷酸氯喹法 甘氨酸 -EDTA法去除 IgG抗体（ 1） 试剂： 10% Na2EDTA 0.1 M 甘氨酸 -HCl缓冲液（ pH 1.5): 0.75g甘氨酸 溶于 100ml生理盐水，用浓盐酸调节 pH到 1.5 1.0 M Tris-NaCl: 12.1g tris 和 5.25g NaCl溶于 100ml蒸馏水。 甘氨酸 -EDTA法去除 IgG抗体（ 2） 方法： 待处理红细胞盐水洗涤 6次 酸化 -甘氨酸 -EDTA液：甘氨酸 -HCl和 EDTA按照 20： 5的体积比混合。 在试

6、管中将红细胞和 酸化 -甘氨酸 -EDTA液按照 10： 20体积比充分混合，室温孵育 23分钟。 向试管中添加 1体积的 Tris-NaCl, 混匀后于 900-1000g 离心 1分钟，弃上清液，盐水洗涤红细胞 4次。 用抗 -IgG检测洗涤后的红细胞，确认 DAT阴性，表明 包被在红细胞上的 IgG抗体已经去除。 氯喹放散法（ 1） 试剂： 二磷酸氯喹： 20g二磷酸氯喹溶于 100ml盐 水，用 1N NaOH调节 pH到 5.1。 DAT阳性的红细胞（包被 IgG） 对照细胞（已知部分血型） 抗 -IgG血清 氯喹放散法（ 2） 方法： 0.2ml盐水洗涤的压积红细胞和 0.8ml氯

7、喹液 混合。室温放臵 30分钟。同时做对照。 取出部分细胞，盐水洗涤 4次，进行 DAT试验 ，如果 DAT为阴性，则放散完成，将全部处 理后的细胞洗涤备用。否则继续处理 30分钟 后检测。 WAIHA的 DAT 单纯 IgG抗体引起 20 66% IgG+C3 2463% 单纯 C3 714% 极少数： IgA或温反应性 IgM抗体 温自身抗体 DAT反应结果 多特异性 AHG 3+ 4+ 抗 -IgG 3+ 4+ 抗 -C3 0 3+ 阴性对照 0 温自身抗体的筛选反应格局 盐水立即离心 37 IAT I 0 0 0 4+ II 0 0 0 4+ WAIHA的抗体筛查及抗体鉴定 患者的病历

8、信息 分析产生 DAT阳性的原因 只有自家抗体（无免疫史） 自家抗体可能合并同种抗体（有免疫 史） 药物抗体（治疗用药情况） 患者的病历信息 临床诊断 原发性： 无任何关联疾病的情形下发生 继发性： 其他疾病相合并发生：如淋巴瘤、慢性淋巴细胞白 血病、系统性红斑狼疮、其他自家免疫疾病、卵巢肿瘤以及 其他慢性炎症。 治疗所用药物 有好几种药物可以诱导产生和 WAIHA一样的血清学反应。如 ：甲基多巴和甲基苄肼。 免疫史（输血史、妊娠史） 输血史对于判定患者血清中的是否存在同种抗体非常重要。 据报道， 1540%的有输血史或妊娠史的 WAIHA患者血清中 除自身温抗体外，还伴随有同种抗体。 WAI

9、HA的抗体筛选和鉴定 无免疫史的 WAIHA检测：直接进行抗体鉴定， 检测抗体特异性，如果有特异性，选择无对应抗 原的血液可以输用。 有免疫史的 WAIHA患者检测： 放散试验 吸收试验： 无近期（ 23月内）输血史患者：采用自身吸收 近期有输血史或严重贫血的患者：采用异体吸收 抗体筛查及抗体鉴定 药物诱导产生的 AIHA，采用放散试验，检测放 散液 增强自身抗体强度的方法 LISS 微胶柱 固相化技术 PEG-IAT 自身细胞放散试验目的 确定是否存在温自身抗体 确定 DAT阳性的原因是否是同种抗体引起而 不存在温自身抗体。 放散液和一些试剂红细胞出现阴性反应表明血清 中存在特异性同种抗体。

10、 确定是否是药物引起的免疫性溶血性贫血： 放散液反应阴性可能是药物依赖性抗体导致的， 由于放散液中缺乏药物，所以产生阴性反应。 WAIHA样本何时进行放散 评估第一个样本 首次放散的目的是来确认温自身抗体引起的 WAIHA，从而排除 药物依赖性抗体的干扰。放散液必须和所有的试剂红细胞产生典 型的阳性反应。 每个样本： 不需要对 WAIHA患者的每一份都进行放散，因为血清学反应格 局不会因为同一患者不同样本而轻易发生改变。 简单的血清学检验已经表明是 WAIHA，仍然需 要进行放散检测 ： 可以确定是否存在药物依赖性抗体，如果药物导致，则更换治疗 药物。 如果放散液中有同种抗体，则可能和抗体鉴定

11、谱细胞产生阳性反 应。产生 DAT/自身对照为阳性的原因不一定全部是患者的抗体引 起的，如患者最近输注了已经包被抗体的供者红细胞。 温自身抗体的特异性 大多数是多特异性抗体，且和 Rh系统抗原相关。 用 Rhnull或 D-细胞来鉴定 。 类似特异性：如类似抗 -c,抗 -e特异性（ 指此抗体和 具有该抗体对应抗原的红细胞反应强度要明显强于缺乏对 应抗原的红细胞） 具有单特异性：如抗 -e、抗 -c、抗 -D、抗 -E、抗 -C 的特异性抗体。 其他系统：很少见，如 Kidd、 Kell、 LW、 Duffy、 Ena等。 一般不需要对自身温抗体进行抗体特异性鉴定。因为绝大多数 自身抗体属于

12、Rh系统的抗体，且具有多特异性，只有少数具有 单特异性。且温自身抗体鉴定无助于疾病的诊断、治疗以及输 血，因此不需要常规进行。 温自身抗体与不同 Rh型反应 红细胞 Rh血型 正常血型 部分缺失 全部缺失 （ cde/cde,等 ) （ -D-/-D-等） （ Rhnull) 抗 -nl + 0 0 抗 -pdl + + 0 抗 -dl + + + 避免温自身抗体检出的方法 试管方法： LISS-IAT 盐水 IAT 温自身抗体的吸收去除 自身吸收（近期未输血） 同种吸收： 未知患者血型 已知患者血型 自身吸收 DAT阴性自身红细胞的化学处 理： ZZAP 菠萝酶或木瓜酶 DTT或 2-ME

13、酶：菠萝酶或木瓜酶 ZZAP处理红细胞（ 1） 试剂： 1%酶：如无花果酶、菠萝酶等 pH分别为 6.5和 8.0的 PBS 0.2 M的 DTT: 1g DTT溶于 32.4ml的 pH 8.0 的 PBS 待吸收血清 /血浆 2ml 自身压积红细胞（ DAT阴性） ZZAP试剂： 1ml 1%的无花果酶、 2.5ml 0.2M DTT、 2ml pH 6.5的 PBS, 混合。 ZZAP处理红细胞（ 2） 方法： 2ml 压积细胞分装 2管， 1ml/管。 将 1ml 压积细胞和 2ml ZZAP试剂混合， 37度孵 育 2030分钟，间歇摇匀。 盐水洗涤 3次（ 9001000g)，除尽

14、末次洗涤上 清液。加入待吸收血清，混匀后 37度孵育 2045分钟。 离心，上清液转移至另一支含处理后红细胞的 试管中吸收。 用筛选红细胞以及自身 DAT阴性红细胞检测吸 收后血清。 影响吸收的循环次数的因素 与血清中抗体的反应强度有关 测定抗体的倍比稀释度，以产生阳性的 最后一管来可以用于确立稀释的循环次 数。 如效价为 16，需要准备 4管红细胞，吸收 4次。 确定吸收的循环次数（ 2） 测定血清中抗体的反应强度 吸收循环次数为反应强度再加 1。 如 IAT反应强度为 3+，则吸收循 环次数为 4次。 异体吸收 吸收用细胞血型 剩余抗体 R1R1, (CCee) -c, -E R2R2,

15、(ccEE) -e, -C rr (ccdee) -D, -C, -E 异体吸收后检测（吸收是否完全） 吸收后血清 检测用红细胞 R1R1吸收 R2R2吸收 rr吸收 R1R1 0 R2R2 0 rr 0 异体吸收后血清检测（特异性 1） 不同 Rh血型红细胞异体吸收后的每一份 血清分别用 R1R1、 R2R2和 rr红细胞，使 用 IAT方法检测，结果均为阴性， 表明：一、温自家抗体已经完全通过异体 吸收去除。 二、溶贫患者血清中不存在同种抗 体。 异体吸收后血清检测（特异性 2） 不同 Rh血型红细胞异体吸收后的每 一份血清分别用 R1R1、 R2R2、 rr红 细胞以及 患者自身 DAT

16、阴性的红细胞 使 用 IAT方法检测，结果出现阳性 ,表明 异体吸收不够充分，只是反应强度减弱， 需要继续进行吸收试验。 异体吸收后血清检测（特异性 3） 不同 Rh血型红细胞异体吸收后的每一份 血清分别用 R1R1、 R2R2和 rr红细胞，使 用 IAT方法检测，结果出现阳性，而和自 身 DAT阴性细胞反应为阴性，表明： 存在 同种抗体 1、用 DAT阴性红细胞检测吸收后血清 2、用吸收用的红细胞检测用其吸收后的 对应的血清 3、鉴定存在的同种抗体。 吸收后血清检测（特异性 4） 当吸收后血清的反应强度没有减弱，表 明自身抗体的对应抗原是可以被 ZZAP试 剂破坏，此时应该： 1、用 ZZ

17、AP或酶处理后的红细胞检测未作吸收 的血清。 2、用未处理的红细胞进行吸收。 DAT阴性的 WAIHA 自身抗体属于低亲和力的 IgG抗体 红细胞上结合的 IgG数量太少， DAT检测 不出来阳性 自身抗体属于 IgM性质或 IgA性质 DAT阴性的 WAIHA的检测（ 1) 使用增强 DAT检测方法 1、冷盐水洗涤红细胞 2、冷 LISS液洗涤红细胞 3、 PEG-DAT试验 4、聚凝胺 -DAT试验 5、 ELAT 6、流式细胞仪检测 DAT阴性的 WAIHA的检测 (2) 抗体检测的增强方法 1、酶方法 2、 PEG 3、微胶柱 4、聚凝胺 DAT阴性的 WAIHA的检测（ 3） 放散液

18、检测： 1、浓缩放散液（如 1ml细胞加 0.2ml盐水 放散） 2、用增强技术方法检测放散液 PEG 微胶柱 WAIHA患者的输血（ 1） 原则建议不要输血，因为对于 WAIHA患者： 1、患者机体对于贫血已经具有耐受性，除非病人的 生命处在危险中，血色素明显快速下降，已经危 及到患者生命安全，否则不要输血。 2、 很难找到完全相配合的血液： WAIHA患者输血要比常规的输血治疗更加危险， 由 于很难找到和患者相配合的血液（即缺乏自身 抗体相对应抗原的血液）；因此输入的血液和自 身血液一样都是不配合的，且输入的红细胞在体 内存活期短于自身细胞。 WAIHA患者的输血（ 2） 3、 输血会引起

19、患者同种免疫，容易产生同种抗体， 给以后输血造成困难。 4、 输血有可能导致溶血病情加重： （ 1）由于自身抗体的存在，很难排除是否存在 同种抗体，输血可能导致输血反应。 （ 2）输血会促进自身抗体的生成，加快溶血速 度，且输入的红细胞干扰血清学检测。 WAIHA患者的输血 （ 3） （ 3）、输血会抑制患者自身的代偿性造血 机能，反而加重病情。 （ 4）对于 WAIHA患者，溶血也是线性的， 即体内红细胞越多，溶血的就越多，因此 输血增加了患者的血容量，同时造成更多 输入的红细胞溶血，产生的血红蛋白造成 患者脏器如肾脏负担加重。 WAIHA患者的输血（ 4） 血色素超过 8g/L的慢性 WA

20、IHA患者很少需要输血 ，很多 5g/L甚至更低的患者也不必输血治疗。 当患者必须输血来挽救生命时，需要输血治疗，以 提供足够的携氧能力，如： 患者血色素快速下降，数值很低且血压过低 血色素快速下降引起的严重贫血 患者严重贫血并伴发心肺疾病 患者出现缺氧的症状 输注量：以维持足够携氧能力的最少量的红细胞， 且在输注过程中密切观察患者情况。 WAIHA患者的交叉配血 未吸收的原血清 , IAT交叉 不配合。 吸收后血清： 配血相合 配血不相合 WAIHA的血清学检测 抗体筛选试验 阳性 阴性 抗体鉴定 同种抗体 自身抗体，（同种抗体？） 吸收试验 自身吸收 异体吸收 抗体筛查 阳性 阴性（无同种抗体） 抗体鉴定 WAIHA的治疗 输血治疗 激素治疗（皮质固醇类）：阻断巨噬细胞清除 IgG 或 C3包被的红细胞。 静脉注射免疫球蛋白（ IVIG)：通过结合巨噬细胞 上 Fc的受体，来延长包被 IgG抗体红细胞的寿命。 由于竞争抑制机制，使得自身抗体水平下降。 脾切除术 免疫抑制剂治疗 单克隆抗体治疗：抗 -CD20, WAIHA患者的 B淋巴 细胞为 CD20阳性。 血浆臵换： 促红细胞生成素