2021 细胞工程实验报告

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1、2021 细胞工程实验报告细胞工程试验报告要求：1、因需上报细胞工程实验成绩，实验报告要求每人一份。 2、请使用实验报 告纸、手写（不能打印）。实验1 细胞培养室的设置和无菌操作一、【实验原理】细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作， 避免微生物及其他有害因素的影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备 室和培养室。三室既相互连接又相对独立，各自完成培养过程中的不同操作。二、【实验目的】 了解培养室的设置和设备。 学习无菌概念和无菌操作要领。三、【操作步骤】1实验室设置（1）配液室（2）准备室（3）培养观察室（4）储藏室（5） 清洗灭菌室 2实验室常用设备 （1）准备

2、室的设备 （2）配液室的设备 （3） 细胞培养室的设备 3无菌操作（1）无菌室的灭菌： 紫外灯无人时就要打开； 进无菌室要穿无菌服、戴帽子和口罩；每周清洗消毒一次；所用物品要以外科手术方式严格消毒；1室内台面要要保持洁净，做完实验后，用75%酒精或千分之三新洁尔灭棉 球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等； 所用 物品要一次性准备好； 瓶口要用酒精火焰消毒； 尽量减少出入。（2）实验人员的无菌准备： 肥皂洗手 穿好隔离衣 酒精棉球擦手四、【实验报告】画出本细胞培养室的草图，标明各室的必需设备。（1）准备室的设备 双蒸馏水蒸馏器酸缸烤箱高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、 塑

3、料器具等灭菌。不同物品其有效灭菌压力和时间不同。储品柜1:放置未消 毒物品。储品柜2：放置已消毒物品。包装台：灭菌前的包装用。准备室 注意事项: 预防蒸馏器被烤干。 放置水池中的水渗出。 勿将酸液溅到 衣物或地面。勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。已消毒物品应与未消毒物 品分柜存放。 （2）配液室的设备 天平（扭力天平和电子天平）：称量用pH计：磁力搅拌器：超净 工作台：超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其 工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环 境中具无菌而均匀的空气。 4C冰箱和低温冰箱 CO2培养箱：A. 定浓度的CO2对细胞生

4、长，尤其是原代培养和单细胞培养有促进作用 （5%）。B. 定浓度的CO2可维持培养液恒定的pH。适用于开放培养，培养箱封口后， 可在一般恒温培养箱内培养，但是采用培养皿或多孔板培养时，则需要高湿度和 高CO2含量的空气。C. 它增加了湿度，箱体内装有水浴，可以保证培养箱内的湿度。2D. 培养箱内装有紫外灯。E. 通过气体流量计可以调节CO2和空气的比例。F. 在水中可加入防腐剂（二氧乙酸）。可防止因CO2培养箱中湿度较高，易 长霉菌。离心机：CO2钢瓶：液氮罐：储品柜：用来存放杂物紫外灯：空气净化系统倒置显微镜3实验2 器械的清洗与消毒、【实验原理】在组织培养过程中，离体细胞对任何毒性物质都十

5、分敏感。毒性物质包括解体 的微生物及细胞残余物以及非营养的化学物质，因此对新采用和重新使用的培养 皿等培养用品都要严格清洗和消毒。二、【实验目的】 学习并掌握细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。三、【操作步骤】1清洗（1）玻璃器皿的清洗步骤：按浸泡f刷洗f浸酸f冲洗等四步程序进行。 浸泡：新购进的玻璃器皿常带有灰尘，呈弱碱性，或带有铅、碑等有害物质， 故先用自来水浸泡过夜、水洗，然后再用2%5%盐酸浸泡过夜或煮沸30min，水 洗。要领：培养用后的玻璃器皿要立即泡入清水中，使下道刷洗工作能顺利进行。 用后的玻璃器皿常带有大量的蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清 水浸泡。 刷洗：用软

6、毛刷、优质洗涤剂，刷去器皿上的杂质，冲洗晾干。要领：浸泡 后的玻璃器皿用毛刷沾洗涤剂去器皿上的杂质、刷洗次太多，会损害器皿的表面 光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以易选用软毛刷和优质洗涤剂。禁止用 去污粉。因其中含有砂粒。会严重破坏玻璃器皿的光洁度。特别注意刷洗瓶角部 位。酸浸之前要把洗涤剂冲干净。 浸酸：将器皿浸泡于清洁液24h,如急用也不得少于4h。清洁液由重铬酸钾、 浓硫酸及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强。经清洁液浸泡 后，玻璃器皿残留的末刷洗掉的微量杂质可被完全清除。 冲洗：先用自来水充分冲洗，吸管等冲流lOmin,瓶皿需每瓶灌满、倒掉， 反复10次以上。然后再经

7、蒸馏水漂洗3次,不留死角。晾干或烘干备用。对已用 过的器皿，凡污染者必先经煮沸30min或放3%盐酸中浸泡过夜，未污染者可不 需灭菌处理，但仍要刷洗、清洁液浸酸过夜，冲洗等。（2）塑料器皿清洗自来水充分浸泡f冲洗一2%NaOH浸泡过夜一自来水冲洗一2%5%盐酸浸泡 30minf自来水冲洗f蒸馏水漂洗3次f晾干f紫外线照射30min（或先用75%酒 精浸泡、擦拭，再用紫外线照射30min）。凡能耐热的塑料器皿，最好经 101.3kPa（121.3C）高压灭菌。4（3）胶塞等橡胶类处理新购置者先经自来水冲洗f2%NaOH煮沸15minf自来水冲洗一2%5%HCl煮沸 15minf自来水冲洗5次以上

8、f蒸馏水冲洗5次以上f蒸馏水煮沸lOmin,倒掉 沸水让余热烘干瓶塞等。或蒸馏水冲洗晾干，整齐摆放于小型金属盒内经 101.3kPa高压灭菌。（4）金属器械的清洗 新购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用过的金属器械应先以清水煮沸消毒，再擦拭干净。 使用前以蒸馏水煮沸lOmin,或包装好以101.3kPa高压15min。（5）除菌滤器的处理用过的滤器将滤膜去除，用三蒸水充分洗净残余液体，置干燥箱中烘干备用。2包装包装的目的是防止消毒灭菌后再次遭受污染，所以经清洗烤干或晾干的器材， 应严格包装后再行消毒灭菌处理。包装材料常用包装纸、牛皮纸

9、、硫酸纸、棉布、 铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。包装分为局部包装和全包装两类，前者 用于较大瓶皿，一般用硫酸纸和牛皮纸将瓶口包扎好；后者适于较小培养瓶皿、 吸管、注射器、金属器械和胶塞等，以下为常用瓶皿、吸管、无菌衣帽等的包装 方法，其它物品可参照处理。 瓶类：硫酸纸罩以瓶口，外罩二层牛皮纸用绳扎紧。 小瓶皿、胶塞、刀剪等器械可装人饭盒，饭盒再以牛皮纸包好，绳扎好。 吸管、滴管口用脱脂棉塞上（不要太紧或太松）装人消毒筒内，滤器、滤瓶、橡皮管等都要用牛皮纸包好瓶口等，外罩一层牛皮纸包好，再用包布包好。 无菌衣、帽、口罩，均以牛皮纸或包布包好，绳扎好。3消毒灭菌 严格的消毒灭菌对保证细胞培养

10、的成功是极为重要的，其方法分为物理法和化 学法两类。前者包括干热、湿热、滤过、紫外线及射线等，后者主要指使用化学 消毒剂等。四、【实验报告】写出细胞工程实验室常用消毒灭菌的方法和适用范围。 热灭菌：玻璃器皿，160170C, 90120min 或 180C4560min。 蒸气灭菌：用于玻璃器皿、滤器橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不 变性的溶液等，不同物品其有效灭菌压力和时间不同，如培养用液、橡胶制品、 塑料器皿等用68kPa(115C)高压灭菌lOmin；布类、玻璃制品、金属器械等用 103kPa(121.3C )高压灭菌 1520min。 滤过除菌：适于含有不耐热成分的培养基和试剂的除菌，用孔径为0.22口m 微孔滤膜可除去细菌和霉菌等，用此滤膜过滤两次，可使支原体达到某种程度的 去除，但不能除去病毒。5