布病病原学及血清学咸阳ppt课件

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1、布病病原学及实验室诊断,陕西省疾病预防控制中心,布氏菌概述,布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌属（Brucella）的细菌侵入机体，引起的人畜共患传染变态反应性传染病，简称布病,是中华人民共和国传染病防治法规定报告的乙类传染病。 1887年英国军医Bruce首先从死于“马耳他热”的英国士兵的脾脏中分离出羊种布氏菌。,1887年，英国军医Bruce从马耳他岛死于“马耳他热”的士兵脾脏中首次分离到羊种布氏菌；1897年丹麦学者和1914年美国学者又分别从流产母牛的羊水和猪流产胎儿中分别分离到牛种布氏菌和猪种布氏菌。 最近半个世纪以来，在布病诊断、免疫、预防和治疗等方面都有较深的发展，

2、1953、1956和1966年又分别发现了绵羊附睾种布氏菌、沙林鼠种布氏菌和犬种布氏菌。,布氏菌是怎么发现的？,1994年，Foster在英国从海洋哺乳动物体内分离到布鲁氏菌，后来在地中海、南美、澳洲等世界许多地方的海洋哺乳动物体内分离到布鲁氏菌，表明其分布是世界性的。与其它布鲁氏菌种一样，也能引起动物流产，并可感染人。根据其表型和分子生物学特性分成2个种，鲸种布鲁氏菌(B.ceti)和鳍种布鲁氏菌(B.pinnipedialis),2008年，德国和捷克科学家报道了一个新布鲁氏菌种-田鼠种布鲁氏菌(B.microti)。 2010年德国人Holger C.Scholz等从具有临床症状的乳房移

3、植感染的71岁病人身上分离到一株布氏菌，鉴定结果为一个布鲁氏菌新种，为湖浪种(B.inopinata)。目前尚未得到布鲁氏菌分类小组委员会承认。,1994年分离出的2个海洋种和2008年分离的田鼠种已列入分类，即目前为9个生物种，22个生物型。,生物种 生物型 常见宿主 羊 种 13 绵羊和山羊 牛 种 17,9 牛 猪 种 15 猪、野兔、鹿、鼠类 沙林鼠种 1 沙林鼠 绵羊附睾种 1 绵羊 犬 种 1 犬 鲸 种 1 海洋哺乳动物 鳍 种 1 海洋哺乳动物 田鼠种 1 豚鼠 【9种】 【22型】,2013年，我省分离出3株布鲁氏菌，2014年共分离出20株（绥德7、延川3、定边2、子长2、

4、旬阳2、宝塔区延长宜川麟游各1株）；1991年以前流行优势种型为羊1、2型，1996年后则为羊1、3型 。 陕西省是以羊型菌为主，牛、犬种布鲁氏菌病的混合疫区，流行优势种随时间推移发生了变化。,形态和培养特征,布氏菌属细菌是一组微小的球杆状革兰氏阴性菌，可被所有的碱性染料所着色，吉姆萨染色成紫红色；无芽孢、无鞭毛、无质粒、不形成荚膜。 营养条件高，生长缓慢，生长所需温度为20-40，最适温度为37.通常要经过4-6天，有的甚至要经过20-30天（双相培养基）才能长出菌落。,布氏菌对物理、化学因子的抵抗力,不同环境中的抵抗能力,从种上来说，羊种毒力最强，猪种和牛种次之，犬种的毒力很弱，几乎不引起

5、人致病。 由于菌种毒力等因素的不同，患病后的临床表现也不完全一样。羊种布鲁氏菌患者中毒症状严重，多有典型的发烧、多汗、乏力、关节肿痛、肝脾及睾丸肿大等急性症状。,布氏菌的毒力,布病发病过程,布氏菌的实验室检验,实验室要求： 布氏菌是高致病性病原微生物，从危害程度来说为第二类病原微生物。布氏菌的分离培养要在生物安全二级以上实验室中进行。 样品采集 培养分离 菌株鉴定 种型鉴定,2.1.1 布氏菌培养检查材料： 人或动物的全血 动物流产胎儿（胎儿的肝脏、肺、胃内容物） 动物脏器、动物胎盘、关节液、阴道分泌物等 新鲜乳汁,2.1.2 双相血培养瓶,采集对象：对急性期和慢性活动期病人未用药前进行血液采

6、集 。,采样方法： 1.使培养瓶恢复至室温、编号； 2. 去掉培养瓶的保护帽，用酒精或碘消毒瓶塞； 3. 用注射器无菌静脉穿刺采集血液5mL，注入血培养瓶； 4. 再次消毒瓶塞和保护帽，盖好保护帽； 5. 从一侧到一侧倾斜培养瓶数次，混匀血液和肉汤。,双相血培养瓶培养方法,1.将瓶子水平放置用肉汤冲洗琼脂5-10分钟以接种琼脂； 2.37直立培养。每隔一天观察一次结果，如未长菌，可通过冲洗再接种一次。30天未出菌，可定为阴性，其血培养瓶经高压灭菌处理；如长菌，4冰箱保存。 3.培养后观察肉汤和琼脂：出现下列一种或更多现象者为阳性结果： 琼脂上：出现菌落或产生气体。 肉汤中：出现浑浊、沉淀或溶血

7、。,县镇村组,来源及编号：绥德县1号 姓名：张三 采血时间：2015年7月1日,布氏菌特异的油滴样菌落,布氏琼脂布鲁氏菌菌落,血平皿 布氏菌菌落,布氏菌革兰氏染色,3.1.4 布氏菌菌株鉴定,布氏菌诊断血清凝集试验 H2S产生试验，CO2培养依赖试验 染料抑菌试验(硫堇，碱性复红) 单项特异性血清A、M凝集试验 粗糙型（R）血清凝集试验 噬菌体裂解试验 PCR检测 其他方法检测 生化测定 脂肪酸分析 PFGE等,羊种布氏菌噬菌体裂解,PCR检测,AMOS-PCR检测方法 提取DNAPCR扩增电泳,3.2.1 诊断标准 （1）流行病学接触史：密切接触家畜、野生动物、畜产品、 布氏菌培养物等或生活

8、在疫区内的居民 （2）临床症状和体征 （3）实验室检查：病原菌分离、试管凝集试验、 补体结合试验、抗人球蛋白试验 具备（1）、（2）和（3）项中的任何一项检查阳性 即可确定为布病病人,3.2.2 布氏菌的血清学诊断方法,虎红玻片凝集试验 (RBPT) 试管凝集试验 (SAT) 抗球蛋白试验 (Coombs试验) 含巯基化物处理血清后的凝集试验（2ME 试验） 补体结合试验 (CFT) 乳环凝集试验 (MRT) 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 金标法 荧光偏振方法 （FPA）,凝集试验：细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块，这一类反应称为凝集反应。,虎红玻片凝集实验,原理：利用

9、酸性带色的抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性，主要检查血清中的IgG类抗体。评价：简便快速、容易操作，适用于基层大面积检疫，容易出现假阳性，结果仅供参考.,方法：在玻片上加0.03ml被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03ml，充分混匀，5min之内观察结果。 结果判定：出现可见的凝集反应就判为阳性；否则就为阴性。,注意事项：,血清静止的温度和时间对实验结果有很大的影响，在一定的时间和温度范围内，放置时间越长，温度越高，假阳性率越低； 患者空腹血清出现假阳性少； 凡是试验中凝集颗粒不规则，大小不匀，片状或絮状，凝集不清澈者，一般为假阳性，否则凝集颗粒规则，大小均匀，凝集清

10、澈者，一般与SAT结果相符，为阳性。,原理：布氏菌侵入机体后，就会刺激机体产生特异性抗体，其可与相应的抗原发生特异性结合，在电解质的作用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，也就是用已知抗原查未知抗体。,试管凝集试验,试管凝集试验,阴性,阳性,0.2ml血清,2.3ml盐水,0.5ml抗原,05ml弃去,1:1600,结果判定： 根据各管中上层液体的清亮度记录凝集反应程度（滴度），特别是50%清亮度（+）对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定。 + 液体完全透明，菌体成伞状沉淀或块状颗粒状沉淀，呈100%凝集。 + 液体近于完全透明，菌体成伞状沉淀，呈75%凝集。 + 液体略微透明，菌体呈较薄伞

11、状沉淀，呈50%凝集。 + 液体不透明，管底有很不明显的伞状沉淀，呈25%凝集。 液体不透明，无伞状沉淀。 效价以产生50%凝集的血清最高稀释倍数为受检血清的效价。 血清对照为清亮透明无沉淀，抗原对照为均匀浑浊，两种对照管成立，才可判定试验管，否则重做。 人的诊断标准：滴度1100及以上或病程一年以上者滴 度为150及以上为阳性,注意事项,受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处温度不能超过10； 采血后应于3-4日内进行检查，因放置时间过长可能会导致血清效价降低； 受检血清静置2h后再进行检查； 个别血清会出现前带现象，建议多做几个管，多采用几个稀释度。,抗人球蛋白实验（Coombs）,原

12、理：机体受布氏菌抗原刺激后可产生“完全抗体”和“不完全抗体”。不完全抗体可与相应抗原结合，但不出现可见反应。若将预测不完全抗体的人血清球蛋白作为抗原，注射于另一种动物（常用家兔）制成抗球蛋白（抗IgG、IgA、IgM）的抗体，再将此球蛋白抗体加入到抗原与不完全抗体复合体中，即可出现可见反应。分为两个阶段: 不完全抗体与相应抗原结合为不可见阶段 抗原抗体复合物有抗球蛋白抗体凝集而形成可见反应,布氏菌感染后，约在15天出现不完全抗体，3个月左右达到高峰。可持续一年左右。该实验可作为早期和追溯诊断。 该试验特异性较强，尤其适用于诊断亚急性和慢性病人，所查抗体主要为IgG、IgA类。 一般不作为常规项

13、目，在试管凝集试验为可疑，患者又处于慢性期时，可考虑抗球蛋白试验予以诊断。,适用范围,血清样本的采集和保存,采血：尽量使用负压采血管，便于无菌操作，编号，造表，妥善携带回实验室 实验时的无菌操作 妥善保存有意义的样本，编号，冻存，背景资料,布病病人能否作为传染源，首先从布病的传播途径加以分析。布病的传播途径有三个，一是直接接触传染，二是消化道传播，三是经呼吸道传播。,布鲁氏菌病人做为传染源的意义,直接接触最为常见也是最危险的传播途径，主要见于赤手为患布病的家畜接生助产过程中，胎盘、流产分泌物等含有大量的布氏菌，可经皮肤粘膜侵入人体。在人传人的机制中，此传播途径似乎最容易实现，接触含有布氏菌的病

14、人分泌物，就有可能感染。然而一般人很难去直接接触病人分泌物，患者在排菌期也正是症状期，发热、乏力、浑身疼痛，也很少有通过性生活传染的可能。另外，布氏菌对酸敏感，阴道的酸性环境不利于布氏菌传播。,消化道传播见于经消化道摄入含有布氏菌的食物和饮水。此传染途径常见吃未经熟透的羊内脏、喝生奶。在人传染人中不容易实现。 呼吸道传播常见于布氏菌严重污染的环境，形成尘埃飞沫核，被人体吸入，在抵抗力降低的情况下感染。人的分泌物排泄物是有固定地方排放的，不太容易污染环境。故而此传播途径在人传人时也不容易实现。,综上所述，布病患者虽理论上能排出细菌，在生物学意义上有作为传染源的可能，但由于布病传播途径的特殊性以及布氏菌的某些特征，在实际中不太容易实现人与人之间的传播，从全世界的病例报道中，也能证实布病患者作为传染源的流行病学意义不是十分重要。故而在布病的控制措施中，对布病患者无需作特别的处理，在健康教育工作中，为避免群众的恐慌，也强调布病人与人之间不传染。,谢谢大家！,