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1、1,实验四,核黄素（VB2）荧光光度定量测定法,2,一、实验目的,了解荧光法测定核黄素的原理和方法 学习荧光光度计的操作和使用 掌握荧光定量分析工作曲线法,3,二、实验原理,核黄素在pH49的条件下，用440500nm波长的光激发，核黄素可发出波长为525nm的荧光 在稀溶液中，荧光强度与核黄素浓度成正比 测定B2标准系列溶液的荧光强度和浓度,做标准曲线 测定样品中B2的荧光强度，查标准曲线得出含量,4,三、实验物品,仪器：930型荧光光度计、分析天平 样品：核黄素片 试剂：核黄素标准溶液 6mol/L醋酸 器皿：大试管：8个 吸管：1ml、2ml、10ml各一支 容量瓶 1000ml 1个,
2、5,四、操作步骤,1、标准曲线绘制 将配好的10g/ml标准核黄素溶液，按下表所示比例稀释成6个标准溶液,管号,项目,单位：ml,6,四、操作步骤,2、样品溶液的配置 准确称取核黄素药片4片，溶于2000ml蒸馏水中 按下表所示加入试剂 单位：ml,管号,项目,7,四、操作步骤,3、上机测定 选用滤光片 激发光波长：用带通型400nm滤光片 发射光波长：用截止型510nm滤光片 选择灵敏度 标准曲线的测定 样品的测定,8,五、记录结果与计算,1、记录荧光强度F 2、计算 核黄素mg/100g=,FV总100,mV用1000,9,六、注意事项,VB2怕光，实验时应尽量避光 选择合适的灵敏度值 样
3、品液测定条件与标准曲线测定条件一致 比色皿是石英材质，注意不要损坏 实验报告不能照抄实验指导 四人作一组实验 每组比色时间10min,10,七、思考题,1、荧光测定的方法有哪几种？ 2、荧光法测定VB2时应注意哪些问题,11,930A型荧光光度计仪器讲解,波长：330nm700nm 滤光片的种类 激发滤片：范围：330nm530nm 330 、360、 400、 500、 530nm 荧光滤片：420nm650nm 420、450、470、510、550、600、650 滤光片的选择 根据被测溶液的激发光谱和荧光光谱选择,12,930A型荧光光度计仪器讲解,使用步骤 安装滤光片 开机10101
4、0 参数的设置 1）光闸的设置：参数 1 输入 （关 OFF） 2）输入日期：参数 2 输入 09 09 27 输入 3）输入激发波长：参数 3 输入 400 输入 4）输入发射波长：参数 4 输入 510 输入 5）输入打印状态：参数 5 输入 1 输入 ON,13,930A型荧光光度计仪器讲解,使用步骤 参数的设置 6）选择拟合标准曲线：参数 6 输入 1 输入 1是一次 2是二次 3是点到点 7）起始号输入：参数 8 输入 001 输入 1号起 8）灵敏度设置：灵敏度 数值 输入 1999 注：最大荧光强度为999，因此最大浓度不要超过999,14,930A型荧光光度计仪器讲解,使用步骤
5、 标准曲线的测量 1）按标准键 放入空白 0 输入 读取荧光光度值 放入第一管 0 2 输入 显示0.2 读取荧光光度值 放入第二管 0 5 输入 显示0.5 读取荧光光度值 放入第三管 1 0 输入 显示1.0 读取荧光光度值 放入第四管 1 5 输入 显示1.5 读取荧光光度值 放入第五管 2 0 输入 显示2.0 读取荧光光度值 2）输入结束，再按标准键： 打出拟合一次曲线,15,930A型荧光光度计仪器讲解,使用步骤 样品的测量： 放入被测样品 测量 仪器会显示出被测样品 的浓度值，并打印出荧光值和浓度值 记录： 相应标准的荧光强度，做标准曲线图 根据测量的浓度值，计算出结果,16,1
6、7,18,19,20,21,光源,22,23,24,概念,维生素 是一类维持动物机体生命活动必不可少的一类低分子有机化合物 维生素的种类 脂溶性维生素： VitA 、VitD、 VitE等 水溶性维生素：B族、VitC等,25,概念,核黄素的特点 在水溶液中具有较强的荧光强度 干燥或酸性溶液中稳定 碱性溶液中较易破坏 遇光易氧化 对热稳定 耐氧,26,概念,含核黄素的食物 以肝、肾、心、蛋、奶含量最多 其次是豆类和新鲜绿叶蔬菜 B2缺乏 口角炎、舌炎、皮肤炎、唇干裂等,27,概念,什么是荧光 当紫外光照射某一物质时，该物质会在极短的时间内，发射出较照射光波长更长的光 荧光光谱 激发光：被荧光物
7、质所吸收的照射波长的光 发射光：把产生的荧光称发射光 仪器部件 激发光源、液槽、单色器、检测器、记录器,28,概念,定量的依据 在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度c有以下的关系： F=k I0l C F：荧光强度 k :常数； I0 :激发光强度； ：摩尔消光系数 l ：溶液厚度 C ：溶液浓度 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系 F = k C,29,概念,定量的依据 对于同一物质，当激发光强度I0和溶液厚度l一定时，荧光强度和物质的浓度成正比 荧光分析法的特点 灵敏度高 选择性好 、线性范围宽 所用的样量少,操作方法简便,30,概念,影响荧光的因素 溶剂的影响 pH 温度 光分解 样品的浓度,31,概念,影响荧光的因素 溶剂的影响 pH 温度 光分解 样品的浓度,32,概念,荧光计的种类 荧光计 荧光分光光度计 荧光检测的方法 直接荧光测定法 间接荧光测定法 荧光焠灭检测法,33,光黄素,核黄素,
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