《核黄素的测定》PPT课件.ppt

1,实验四,核黄素（VB2）荧光光度定量测定法,2,一、实验目的,了解荧光法测定核黄素的原理和方法 学习荧光光度计的操作和使用 掌握荧光定量分析工作曲线法,3,二、实验原理,核黄素在pH49的条件下，用440500nm波长的光激发，核黄素可发出波长为525nm的荧光 在稀溶液中，荧光强度与核黄素浓度成正比 测定B2标准系列溶液的荧光强度和浓度,做标准曲线 测定样品中B2的荧光强度，查标准曲线得出含量,4,三、实验物品,仪器：930型荧光光度计、分析天平 样品：核黄素片 试剂：核黄素标准溶液 6mol/L醋酸 器皿：大试管：8个 吸管：1ml、2ml、10ml各一支 容量瓶 1000ml 1个,5,四、操作步骤,1、标准曲线绘制 将配好的10g/ml标准核黄素溶液，按下表所示比例稀释成6个标准溶液,管号,项目,单位：ml,6,四、操作步骤,2、样品溶液的配置 准确称取核黄素药片4片，溶于2000ml蒸馏水中 按下表所示加入试剂 单位：ml,管号,项目,7,四、操作步骤,3、上机测定 选用滤光片 激发光波长：用带通型400nm滤光片 发射光波长：用截止型510nm滤光片 选择灵敏度 标准曲线的测定 样品的测定,8,五、记录结果与计算,1、记录荧光强度F 2、计算 核黄素mg/100g=,FV总100,mV用1000,9,六、注意事项,VB2怕光，实验时应尽量避光 选择合适的灵敏度值 样品液测定条件与标准曲线测定条件一致 比色皿是石英材质，注意不要损坏 实验报告不能照抄实验指导 四人作一组实验 每组比色时间10min,10,七、思考题,1、荧光测定的方法有哪几种？ 2、荧光法测定VB2时应注意哪些问题,11,930A型荧光光度计仪器讲解,波长：330nm700nm 滤光片的种类 激发滤片：范围：330nm530nm 330 、360、 400、 500、 530nm 荧光滤片：420nm650nm 420、450、470、510、550、600、650 滤光片的选择 根据被测溶液的激发光谱和荧光光谱选择,12,930A型荧光光度计仪器讲解,使用步骤 安装滤光片 开机101010 参数的设置 1）光闸的设置：参数 1 输入 （关 OFF） 2）输入日期：参数 2 输入 09 09 27 输入 3）输入激发波长：参数 3 输入 400 输入 4）输入发射波长：参数 4 输入 510 输入 5）输入打印状态：参数 5 输入 1 输入 ON,13,930A型荧光光度计仪器讲解,使用步骤 参数的设置 6）选择拟合标准曲线：参数 6 输入 1 输入 1是一次 2是二次 3是点到点 7）起始号输入：参数 8 输入 001 输入 1号起 8）灵敏度设置：灵敏度 数值 输入 1999 注：最大荧光强度为999，因此最大浓度不要超过999,14,930A型荧光光度计仪器讲解,使用步骤 标准曲线的测量 1）按标准键 放入空白 0 输入 读取荧光光度值 放入第一管 0 2 输入 显示0.2 读取荧光光度值 放入第二管 0 5 输入 显示0.5 读取荧光光度值 放入第三管 1 0 输入 显示1.0 读取荧光光度值 放入第四管 1 5 输入 显示1.5 读取荧光光度值 放入第五管 2 0 输入 显示2.0 读取荧光光度值 2）输入结束，再按标准键： 打出拟合一次曲线,15,930A型荧光光度计仪器讲解,使用步骤 样品的测量： 放入被测样品 测量 仪器会显示出被测样品 的浓度值，并打印出荧光值和浓度值 记录： 相应标准的荧光强度，做标准曲线图 根据测量的浓度值，计算出结果,16,17,18,19,20,21,光源,22,23,24,概念,维生素 是一类维持动物机体生命活动必不可少的一类低分子有机化合物 维生素的种类 脂溶性维生素： VitA 、VitD、 VitE等 水溶性维生素：B族、VitC等,25,概念,核黄素的特点 在水溶液中具有较强的荧光强度 干燥或酸性溶液中稳定 碱性溶液中较易破坏 遇光易氧化 对热稳定 耐氧,26,概念,含核黄素的食物 以肝、肾、心、蛋、奶含量最多 其次是豆类和新鲜绿叶蔬菜 B2缺乏 口角炎、舌炎、皮肤炎、唇干裂等,27,概念,什么是荧光 当紫外光照射某一物质时，该物质会在极短的时间内，发射出较照射光波长更长的光 荧光光谱 激发光：被荧光物质所吸收的照射波长的光 发射光：把产生的荧光称发射光 仪器部件 激发光源、液槽、单色器、检测器、记录器,28,概念,定量的依据 在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度c有以下的关系： F=k I0l C F：荧光强度 k :常数； I0 :激发光强度； ：摩尔消光系数 l ：溶液厚度 C ：溶液浓度 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系 F = k C,29,概念,定量的依据 对于同一物质，当激发光强度I0和溶液厚度l一定时，荧光强度和物质的浓度成正比 荧光分析法的特点 灵敏度高 选择性好 、线性范围宽 所用的样量少,操作方法简便,30,概念,影响荧光的因素 溶剂的影响 pH 温度 光分解 样品的浓度,31,概念,影响荧光的因素 溶剂的影响 pH 温度 光分解 样品的浓度,32,概念,荧光计的种类 荧光计 荧光分光光度计 荧光检测的方法 直接荧光测定法 间接荧光测定法 荧光焠灭检测法,33,光黄素,核黄素,