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1、第第25章章 免疫学检测技术免疫学检测技术Chapter 25 Immunodiagnosis第一节第一节 抗原或抗体检测抗原或抗体检测I.Detection of antigens or antibodies一、抗原一、抗原-抗体反应的特点抗体反应的特点Specificity（一高度特异性（一高度特异性 Cross-reaction:common antigen 交叉反应：共同抗原交叉反应：共同抗原 Antiserum absorption 抗血清吸收抗血清吸收 1st antibody&2nd antibody 一抗；二抗一抗；二抗Reversibility/invertibility:（
2、二可逆性（二可逆性 non-covalent,surface-binding,dissociable 非共价、表面结合，可解离非共价、表面结合，可解离 complementary capacity:affinity;avidity 互补程度：亲和力互补程度：亲和力；亲合力亲合力Visibility（三可见性的条件（三可见性的条件Compatible concentrations of antigen and antibody combined in proportion at or near equivalence Antigen:multivalent;Antibody(IgG):dival
3、ent 比例适合：抗原多价，抗体比例适合：抗原多价，抗体2价。交织成价。交织成网。网。Ph value;Temperature;Ionic concentration 条件适宜：酸碱度、温度、离子浓度条件适宜：酸碱度、温度、离子浓度Adequate concentration,binding strength;reaction time 足够浓度、结合强度和反应时间足够浓度、结合强度和反应时间Prozone phenomenon前带现象二、抗原二、抗原-抗体反应的应用抗体反应的应用Terms 术语术语Serological reaction 血清学反血清学反应应Qualitative anal
4、ysis 定性定性Quantitation 定量定量Orientation 定位定位Titration 滴定滴定Titer 效价效价/滴滴度度三、常用的抗原三、常用的抗原-抗体反应技术抗体反应技术经典技术经典技术中和反应中和反应补体结合反应补体结合反应凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应I)Agglutination（一凝集反应：（一凝集反应：颗粒性抗原或包被有可溶性抗原的颗粒颗粒性抗原或包被有可溶性抗原的颗粒+相应抗体相应抗体肉眼可见的凝集块肉眼可见的凝集块 1.直接凝集直接凝集 颗粒性抗原颗粒性抗原+相应抗体相应抗体 玻片凝集：抗原定性玻片凝集：抗原定性 （ABO血型）血型）试管凝集：抗体定量
5、试管凝集：抗体定量 （肥达反应）（肥达反应）2.间接凝集间接凝集 包被有可溶性抗原的颗粒包被有可溶性抗原的颗粒+相应抗相应抗体体 红细胞间接血凝）；乳胶间接红细胞间接血凝）；乳胶间接乳凝）乳凝）Coombs Test:红细胞红细胞Rh抗原）抗原）+不完全抗体不完全抗体+抗人球蛋白抗人球蛋白 3.派生的试验派生的试验 反向间接凝集反应：包被抗体的颗粒反向间接凝集反应：包被抗体的颗粒+抗原抗原 间接凝集抑制反应：间接凝集抑制反应：（乳胶妊娠试验）（乳胶妊娠试验）抗体抗体+未知抗原未知抗原+包被有相应可溶性抗原包被有相应可溶性抗原的颗粒的颗粒 凝集？凝集？HaemagglutinationII)Pr
6、ecipitation （二沉淀反应（二沉淀反应 可溶性抗原可溶性抗原+相应抗体相应抗体肉眼可见的沉淀物肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质使用半固体琼脂凝胶为介质琼脂扩散琼脂扩散/免疫扩散免疫扩散1.单向免疫扩散：抗原单向免疫扩散：抗原 的定量的定量Ig、C3）2.双向免疫扩散：抗原双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及抗体的定性、组成及Ag相关性分析相关性分析3.免疫电泳：免疫电泳：电泳电泳+双向免疫扩散双向免疫扩散 （抗原分析）（抗原分析）4.对流电泳：对流电泳：双向免疫扩散双向免疫扩散+电泳电泳 （抗原（抗原/抗体定性）抗体定性）5.火箭电泳：火箭电泳：单向免疫扩散单向免疫扩散+
7、电泳电泳 （抗原定量）（抗原定量）免疫比浊：免疫比浊：抗体抗体+递增量抗原递增量抗原比浊抗原定量）比浊抗原定量）III)Immunolabelling Techniques （三免疫标记技术（三免疫标记技术标记物：标记物：荧光素、酶、放射性核素、电子致密物质、化学发光物质荧光素、酶、放射性核素、电子致密物质、化学发光物质标记对象：抗原或抗体标记对象：抗原或抗体用途：用途：定性、定量、定位定性、定量、定位免疫荧光法免疫荧光法IFA）荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位 （1直接荧光法直接荧光法 （2间接荧光法：间接荧光法：荧光素一抗荧光素一
8、抗 荧光素二抗荧光素二抗 对每种抗体作标记对每种抗体作标记 不必标记每种抗体不必标记每种抗体 特异特异 敏感敏感 测测Ag 测测Ag/Ab免疫荧光法免疫荧光法2.酶免疫测定酶免疫测定EIA）:ELISA与酶免疫组化与酶免疫组化（1双抗体夹心法双抗体夹心法ELISA：查抗原：查抗原（2间接法间接法ELISA：查抗体查抗体（3BAS-ELISA：Biotin-Avidin-酶放大系统酶放大系统（4ELISPOT测定法：测定法：_包被物包被物 待测物待测物 测定结果测定结果_ 抗抗CK抗体抗体 CK分泌细胞分泌细胞 单一单一CK 已知抗原已知抗原 B细胞细胞 特异特异B细胞细胞（5酶免疫组化酶免疫组
9、化*酶标抗体酶标抗体+组织组织/细胞未知抗原）细胞未知抗原）+形态学检查形态学检查*免疫组化技术：可对抗原定性、定量、定位免疫组化技术：可对抗原定性、定量、定位 酶免疫组化：酶免疫组化：HRP免疫金银组化：免疫金银组化：胶体金颗粒胶体金颗粒免疫电镜技术：免疫电镜技术：HRP、胶体金、铁蛋白、胶体金、铁蛋白双抗体夹心法、间接法双抗体夹心法、间接法ELISA间接法间接法ELISAELISA操作图可调移液器可调移液器8孔道可调移液器孔道可调移液器3.放射免疫测定放射免疫测定RIA）常用常用 125I，测定微量物质，测定微量物质4.化学发光免疫分析化学发光免疫分析 常用常用 鲁米诺，测定超微量物质鲁米
10、诺，测定超微量物质5.免疫印迹法免疫印迹法Western Blotting）先做凝胶电泳将蛋白质分区先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定第二节第二节 免疫细胞的测定免疫细胞的测定一、淋巴细胞的分离与类型鉴定 （一血细胞分离 外周血 密度梯度离心法 外周血单个核细胞淋巴细胞+单核细胞）吸附培养分离法 淋巴细胞 尼龙毛，抗CD3单抗，E花结 T细胞 B细胞（二淋巴细胞鉴定（二淋巴细胞鉴定免疫荧光法免疫荧光法 常用间接法测常用间接法测CD3/CD4/CD8、mIgM/mIgD2.磁珠分离法磁珠
11、分离法 如抗如抗CD4抗体交联微珠可分离抗体交联微珠可分离CD4与与CD83.流式细胞术流式细胞术Flow Cytometry,FCM）可分析细胞大小、核型、表面分子多种荧光标记）可分析细胞大小、核型、表面分子多种荧光标记）检测各类免疫细胞及其比率检测各类免疫细胞及其比率 白血病、淋巴瘤的免疫学分型白血病、淋巴瘤的免疫学分型 细胞分选细胞分选二、淋巴细胞功能测定二、淋巴细胞功能测定（一（一T细胞功能测定细胞功能测定 1.T细胞增殖试验：细胞增殖试验：丝裂原丝裂原/抗抗CD3刺激刺激/特异抗原特异抗原细胞增殖细胞增殖 （1同位素掺入法同位素掺入法 （2MTT法法 （3形态观测法形态观测法 2.细
12、胞毒试验细胞毒试验 CTL、NK细胞杀伤靶细胞细胞杀伤靶细胞 （151Cr 释放法释放法 （2凋亡细胞检查法凋亡细胞检查法 阶梯状酶切图谱阶梯状酶切图谱 TUNEL法法 FCM3.细胞因子检测细胞因子检测（1免疫学检测法免疫学检测法 夹心法夹心法ELISA FCM（2生物学检测法生物学检测法 细胞增殖或细胞增殖抑制实验细胞增殖或细胞增殖抑制实验 细胞毒或细胞毒抑制实验细胞毒或细胞毒抑制实验（3）分子生物学检测法分子生物学检测法 RT-PCR测定测定mRNA4.皮肤试验：皮肤试验：测试测试IV型超敏反应能力型超敏反应能力（二（二B细胞功能测定细胞功能测定 B细胞增殖试验细胞增殖试验 小鼠：小鼠：
13、LPS 人：人：SPA；抗；抗IgM 2.抗体形成细胞检测抗体形成细胞检测 溶血空斑试验溶血空斑试验 ELISPOT试验试验（三吞噬细胞功能的测定（三吞噬细胞功能的测定 趋化功能测定趋化功能测定 Boyden 小室小室 2.吞噬功能测定吞噬功能测定 第三节第三节 补体及循环免疫复合物的测定补体及循环免疫复合物的测定III.Application of immunological techniques第四节第四节 免疫学检测方法的应用免疫学检测方法的应用1.Assessment and selection 一、免疫学检测方法的评估与选择一、免疫学检测方法的评估与选择 Reliability:tr
14、ue vs false 可靠性可靠性(gold standard*=真阴性率与真真阴性率与真阳性率阳性率)*Specificity=真阴性真阴性/（真阴性（真阴性+假阳性假阳性x 100%*Sensitivity=真阳性真阳性/（真阳性（真阳性+假阴性假阴性x 100%Safety 安全性安全性 Simplicity 简易性简易性 Saving of time and money 经济性经济性Selection as per requirement and availability 依据需要与可能选择依据需要与可能选择Screening:初筛初筛 high sensitivity first,
15、to avoid case missing 避免漏诊避免漏诊Diagnosis:确诊确诊 high specificity first,to avoid misdiagnosis 避免误诊避免误诊2.Clinical application 二、免疫学检测方法的临床应二、免疫学检测方法的临床应用用1)Infectious diseases （一）（一）感染性疾病感染性疾病 pathogen 病原体的特异抗原或抗体检测病原体的特异抗原或抗体检测2)Immunodeficiency diseases （二免疫缺陷病（二免疫缺陷病 Ig,complement,immune cells 3)Immunological supervision （三免疫学监测（三免疫学监测 illness status,curative schema,drug effect,prognosis病情分析，治疗方案，疗效评价，预后判定病情分析，治疗方案，疗效评价，预后判定Thank you!
医学微免疫学06级第25章免疫学检测技术ppt课件
