核酸的分离提取及定量课件

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1、动物组织中核酸的提取动物组织中核酸的提取实验目的及意义实验目的及意义能够说出组织能够说出组织DNA分离提纯的原理及方分离提纯的原理及方法并能够抽提制备法并能够抽提制备DNA能够说出组织能够说出组织RNA分离提纯的原理及方分离提纯的原理及方法并能够抽提制备法并能够抽提制备RNA。实验目的及意义2前言前言 核酸（核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。核酸样品质量将

2、直接关系到实验的成败。前言 核酸（nucleic acid）是遗传信3分离纯化核酸的原则分离纯化核酸的原则 1.应保证核酸应保证核酸一级结构的完整性一级结构的完整性一级结构的完整性一级结构的完整性完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求减少减少化学因素化学因素化学因素化学因素对核酸的降解：对核酸的降解：a.a.a.a.温度温度温度温度不要过高；不要过高；b.b.控制控制pHpH值值值值范围范围(pH值值5-9););c.c.保持一定保持一定离子强度离子强度离子强度离子强度;减少减少物理因素物理因素物理因素物理因素对核酸的降解：对核酸的

3、降解：避免避免机械剪切力机械剪切力机械剪切力机械剪切力破坏核酸结构破坏核酸结构分离纯化核酸的原则 应保证核酸一级结构的完整性4分离纯化核酸的原则分离纯化核酸的原则 防止核酸的防止核酸的生物降解生物降解生物降解生物降解：a.a.细胞内或外来的各种细胞内或外来的各种核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。破坏核酸一级结构。b.b.进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70-70冰箱中。冰箱中。c.c.所用器械和

4、一些试剂需所用器械和一些试剂需高温灭菌高温灭菌高温灭菌高温灭菌，提取缓冲液中需加，提取缓冲液中需加核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶抑制剂。抑制剂。抑制剂。抑制剂。分离纯化核酸的原则 防止核酸的生物降解：5分离纯化核酸的原则分离纯化核酸的原则 2.排除排除蛋白质、脂类、糖类蛋白质、脂类、糖类蛋白质、脂类、糖类蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染等其他分子的污染 3.无无其他核酸分子其他核酸分子其他核酸分子其他核酸分子的污染（如抽提的污染（如抽提DNA分子时应分子时应去除去除RNA分子）。分子）。分离纯化核酸的原则 6核酸的性质核酸的性质1.DNA、RNA的理化性质特点：的理化性质特点：核酸分子中既含有酸性

5、基团（磷酸基）也含有碱性基团核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸具有两性性质，是（氨基），因而核酸具有两性性质，是两性电解质两性电解质两性电解质两性电解质。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以（氨基）是一个弱碱，所以核酸通常表现为酸性核酸通常表现为酸性核酸通常表现为酸性核酸通常表现为酸性，等电，等电点比较低。如点比较低。如DNA的等电点为的等电点为pI 4-4.5，RNA的等电点为的等电点为pI 2-2.5。DNA为白色纤维状固体，为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体。为白色粉末状

6、固体。DNA和和RNA都是极性化合物，因此他们都是极性化合物，因此他们一般都微溶于水，一般都微溶于水，一般都微溶于水，一般都微溶于水，而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有机溶剂而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有机溶剂而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有机溶剂而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有机溶剂。核酸的性质 DNA、RNA的理化性质特点：7核酸的性质核酸的性质2.核酸的存在方式：核酸的存在方式：DNA和和RNA在细胞中通常以与蛋白质结合的状态存在。他在细胞中通常以与蛋白质结合的状态存在。他们与蛋白质结合形成的复合物分别称为们与蛋白质结合形成的复合物分别称为DNP（脱氧核糖核蛋白）（脱氧核糖核蛋白）和和RNP（核糖核蛋白

7、）。（核糖核蛋白）。核酸的性质 核酸的存在方式：8核酸纯化原理核酸纯化原理 DNA分离纯化原理分离纯化原理：脱氧核糖核蛋白（脱氧核糖核蛋白（脱氧核糖核蛋白（脱氧核糖核蛋白（DNPDNP）在）在）在）在0.14 mol/L NaCl0.14 mol/L NaCl中溶解度很中溶解度很中溶解度很中溶解度很低，而核糖核蛋白（低，而核糖核蛋白（低，而核糖核蛋白（低，而核糖核蛋白（RNPRNP）却较易溶解，因此用上述浓度的）却较易溶解，因此用上述浓度的）却较易溶解，因此用上述浓度的）却较易溶解，因此用上述浓度的NaClNaCl洗涤组织匀浆，可得到洗涤组织匀浆，可得到洗涤组织匀浆，可得到洗涤组织匀浆，可得到

8、DNPDNP，再用氯仿，再用氯仿，再用氯仿，再用氯仿-异戊醇除蛋白即异戊醇除蛋白即异戊醇除蛋白即异戊醇除蛋白即可得到可得到可得到可得到DNADNA。RNA分离纯化原理：分离纯化原理：组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠(SDS)(SDS)存在下，存在下，存在下，存在下，RNARNA与蛋与蛋与蛋与蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，白质分离。酚使蛋白质变性凝固，白质分离。酚使蛋白质变性凝固，白质分离。酚使蛋白质变性凝固，RNARNA则溶解在水相中，用乙则溶解在水相中，用乙则溶解在水相中，用乙则溶解在水相中，用乙醇使醇使醇使醇

9、使RNARNA从水相中沉淀而达到分离。从水相中沉淀而达到分离。从水相中沉淀而达到分离。从水相中沉淀而达到分离。核酸纯化原理 DNA分离纯化原理：9DNA分离纯化实验步骤分离纯化实验步骤剪碎组织剪碎组织 放入匀浆器加入放入匀浆器加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA液液7 mL弃上清。沉淀中加入弃上清。沉淀中加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA液液6 mL混匀。混匀。匀浆，离心匀浆，离心 5000 r/min，5 min沉淀中加入沉淀中加入3 mL 0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA,转入匀浆器匀浆，转入匀浆器

10、匀浆，在搅拌下缓缓滴入在搅拌下缓缓滴入250 g/L SDS 0.4 mL匀浆，使沉淀悬浮均匀匀浆，使沉淀悬浮均匀再加入再加入2 mol/L NaCl 4 mL（此时由于大分子脱氧核糖核蛋白的溶（此时由于大分子脱氧核糖核蛋白的溶出，溶液粘度骤然升高，再匀浆，使之均匀）出，溶液粘度骤然升高，再匀浆，使之均匀）加加氯仿氯仿-异丙醇异丙醇 5 mL，剧烈振摇，剧烈振摇10min。混合物离心。混合物离心上层水液，下层氯仿，交界面为变性蛋白。上层水液，下层氯仿，交界面为变性蛋白。收集上层水液边摇变加入收集上层水液边摇变加入等体积等体积95%乙醇乙醇，即可见有长纤维状，即可见有长纤维状DNA析出析出500

11、0 r/min 离心离心5 min3000 r/min离心离心10 minDNA分离纯化实验步骤剪碎组织 放入匀浆器加入0.14 mo10RNA分离纯化实验步骤分离纯化实验步骤加入加入3 mL 0.05 mol/L 醋酸醋酸-醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液,250 g/L SDS 0.5 mL，匀浆，匀浆移入三角烧瓶中，移入三角烧瓶中，65水浴水浴中继续中继续振摇振摇5-8min，取出取出流水冷却流水冷却5000 r/min 离心离心10-15min上层为稍浑浊含有上层为稍浑浊含有RNA的水相，的水相，中层为变性蛋白质，下层为酚中层为变性蛋白质，下层为酚液，管底残渣含有液，管底残渣含有DNA。收集上

12、层水液于量筒中，测水液的体积，加入收集上层水液于量筒中，测水液的体积，加入1/10 体积的体积的2 mol/L 醋酸醋酸钠溶液钠溶液，混匀。再加，混匀。再加2.倍体积预冷的无水乙醇倍体积预冷的无水乙醇，混匀，冷处放置至絮，混匀，冷处放置至絮状沉淀充分形成（絮状沉淀即为状沉淀充分形成（絮状沉淀即为RNA）再加入再加入等体积等体积 80%酚酚（约（约4mL），匀浆），匀浆RNA分离纯化实验步骤加入3 mL 0.05 mol/L 醋11核酸分离纯化中各试剂的作用核酸分离纯化中各试剂的作用 DNP在在2 mol/L NaCl中易溶解中易溶解 DNP在在0.14 mol/L NaCl中不溶中不溶 RNP

13、在在0.14 mol/L NaCl中易溶解中易溶解 EDTAEDTA：DNADNA酶抑制剂酶抑制剂酶抑制剂酶抑制剂 DNA酶需要金属二价离子酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用的激活，因此使用金属二价离子螯合剂金属二价离子螯合剂EDTA，可抑制，可抑制DNA酶活性。酶活性。氯仿异戊醇抽提：氯仿异戊醇抽提：氯仿异戊醇抽提：氯仿异戊醇抽提：氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层；氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层；异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。1.DNADNA分离纯化分离纯化分离纯化分离纯化核酸分离纯化中各试剂的作用 DNP在2

14、 mol/L NaCl12 乙醇沉淀法：乙醇沉淀法：乙醇沉淀法：乙醇沉淀法：DNA溶液是溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去乙醇会夺去DNA周围的水分子，周围的水分子，使使DNA失水而易于聚合失水而易于聚合。用。用无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。的方法。乙醇与核酸不会起任何化学反应，对乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理很安全，因此是理想的沉淀剂。想的沉淀剂。可用可用95乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比远比95乙

15、醇昂贵）但是加乙醇昂贵）但是加95的乙醇使总体积增大，而的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀沉淀DNA时可用时可用95乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。使用无水乙醇。核酸分离纯化中各试剂的作用核酸分离纯化中各试剂的作用 乙醇沉淀法：核酸分离纯化中各试剂的作用132.RNA RNA分离纯化：分离纯化：分离纯化：分离纯化：0.5 mol/L0.5 mol/L醋

16、酸醋酸醋酸醋酸-醋酸钠溶液醋酸钠溶液醋酸钠溶液醋酸钠溶液 使混合物中使混合物中DNA沉淀沉淀 2 mol/L 2 mol/L 醋酸醋酸钠溶液醋酸醋酸钠溶液醋酸醋酸钠溶液醋酸醋酸钠溶液 提供一定盐离子促进提供一定盐离子促进RNA沉淀沉淀SDSSDS：阴离于型表面活性剂：阴离于型表面活性剂：阴离于型表面活性剂：阴离于型表面活性剂 使蛋白质变性，有破胞和抑制核酸酶的作用；使蛋白质变性，有破胞和抑制核酸酶的作用；苯酚抽提法：苯酚抽提法：苯酚抽提法：苯酚抽提法：苯苯酚酚酚酚是极强烈的是极强烈的蛋白质变性剂蛋白质变性剂蛋白质变性剂蛋白质变性剂，它几乎使所有遇到的蛋，它几乎使所有遇到的蛋白质都变性。能增加去

17、除蛋白的效果，并白质都变性。能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑对核酸酶有抑对核酸酶有抑对核酸酶有抑制作用制作用制作用制作用。乙醇沉淀法：乙醇沉淀法：乙醇沉淀法：乙醇沉淀法：原理同原理同原理同原理同DNADNA沉淀。沉淀。沉淀。沉淀。核酸分离纯化中各试剂的作用核酸分离纯化中各试剂的作用 RNA分离纯化：核酸分离纯化中各试剂的作用14u 尽量保持低温下操作，作时注意避免破坏核酸结构尽量保持低温下操作，作时注意避免破坏核酸结构一般来讲，核酸沉淀应在低温下长时间下进行。但是低温长一般来讲，核酸沉淀应在低温下长时间下进行。但是低温长时间沉淀，易导致盐与时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。

18、因共沉淀，影响以后的实验。因此此一般使用一般使用0冰水，冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要样品足可达到实验要求。求。u 使用酚时应注意使用酚时应注意酚通常是酚通常是透明无色的结晶透明无色的结晶透明无色的结晶透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物。表明其中含有酚的氧化产物。变色的酚不能用于核酸抽提实变色的酚不能用于核酸抽提实验，氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。验，氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套。酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套。酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套。酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套。注意事项注意事项 尽量保持低温下操作，作时注意避免破坏核酸结构注意事项15