酶的提取与分离纯化.ppt

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1、第三章 酶的提取与分离纯化 预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。 初步纯化（rough fractionation） （提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。 高度纯化（fine fractionation） （精制）：除去与产物性质相似的杂质。 浓缩与干燥（concentration and desiccation）（成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。,第一节 酶的分离 一、发酵液预处理 (一)发酵液的相对纯化 1. 无机离子的去除 2. 杂蛋白质的去除 3. 色素及其他物质的去除,(二）发酵液的固液分离 1 . 影响发酵液过滤的因素 1）菌种

2、2）培养基组成 2. 提高过滤性能的方法 1）絮凝和凝聚 2）稀释、加热 3）加助滤剂，常用硅藻土等。,主要方法是离心分离和过滤,二、细胞破碎 （一）细胞壁组成 细胞壁的主要成分： 细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸) 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌: 多糖（几丁质和葡聚糖）,各种微生物细胞壁的结构与组成,细菌细胞壁的结构,酵母菌细胞壁的结构 M甘露聚糖；P磷酸二酯键；G葡聚糖,（二）细胞破碎的方法 机械法 物理法 化学法 生物法（酶解）,1.机械法： 1）液体剪切：搅拌、匀浆。 2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。 2.物理法： 1）超声波破碎法。 2）渗透压突变法：高渗（蔗糖，

3、高盐等） 平衡后迅速转入低渗溶液或水中。 3）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。,3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。 1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用 丙酮、丁醇、氯仿等。 2）表面活性剂处理：常用非离子型表面 活性剂，如Triton X-100，Tween等。,4.酶解法（enzymatic lysis）： 外加酶法： 根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。 自溶法（autolysis）: 细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发 生溶解的现象。,细胞对破碎方法的敏感性,细胞 声波 机械 渗透压 冻融 动植物 + + + + 革兰氏阴性菌 + + +

4、+ 革兰氏阳性芽孢菌 + + + + 酵母 + + + + 革兰氏阳性球菌 + - + + 菌丝 - + - + 孢子 - - - -,（三）细胞破碎确认 1.直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。,三、酶的提取(extraction) 把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。,提取目标： a. 将目的酶最大限度地溶解出来

5、。 b. 保持生物活性。 注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（010）操作。,提取原则 a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。,提取方法： （一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取 （三）有机溶剂提取,四、 离心分离 （一）基本原理 1. 离心力 Fc = m ac m r 2 m r （2 N/60）2 N为离心机每分钟转数 （r/min ）； Fc通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的

6、多少倍。一般用g（或数字g）表示。,RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系 旋转半径用r平均代替 r平均=1/2（r大+r小）cm,通常： 低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。 高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表 示，如：65000g。 两者可换算或查测算图。,计算近似RCF的列线图,2. 沉降系数:（sedimentation constant） 指单位离心力下颗粒的沉降速度（sedimentation velocity）,用S表示。 由于许多生物大分子的S值很小，所以定义10 13 s

7、 为一个沉降单位，1S = 11013 s。 常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系数一般在1 200之间。,（二）离心机的种类 按离心机转速的不同，分为： 常速（低速） 高速 超速,离心机的种类,实验室离心机,温度类型：常温及冷冻 超速离心机均为冷冻型。 使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头。 使用超速离心机时先抽真空。,离心的形式,角式及外摆式：外摆式一般为低速， 角式由低速到超速均有。,角式离心机和离心头（转子）,角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。,离心机的大小：落地式及台式,小台式离心机,离心管,材质：玻璃，塑料 强度：和

8、离心速度相配 大小：和转子配套 高速超速管要加盖,离心机操作,平衡、定温、定速、定时。,（三）常用离心方法 差速离心法 沉降速度法 密度梯度离心 沉降平衡法 等密度梯度离心,1差速离心 （differential centrifugation） 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。 特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 优点：操作简单 。 缺点：1）分离效果较差， 不能一次得到纯颗粒。 2）壁效应严重。 3）沉降的颗粒受到挤压。,差速离心分离示意图 （a）离心前的悬浮液 （b）（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况,2密度梯度离心 （density gradien

9、t centrifugation） 样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。 常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。,特点： 区带内的液相介质密度小于样品物质 颗粒的密度。 适宜分离密度相近而大小不同的固相 物质。,密度梯度离心示意图 （a）离心前 （b）离心后,Density gradient ultracentrifugation,密度梯度离心,步骤： A.形成密度梯度 B. 加样 C.离心 D.收集样品,3. 等密度梯度离心 又称沉降平衡离心 （sedimentation equilibrium centrifugation）。 根据颗粒的密度不同而进行

10、分离。 离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。,常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。 特点： 介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。 适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。,等密度梯度离心示意图 （a）离心前； （b）离心后,沉降速度离心和沉降平衡离心的特点,总结： 等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分离物的密度范围。 差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的离心力。 密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液。,（四）

11、应用 根据不同离心目的，分为 制备性离心： 分离纯化和制备 分析性离心： 测分子量、沉降系数、密度、纯度,五、沉淀分离（根据溶解度的不同）,使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 古老、实用、简单的初步分离方法,在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： 中性盐沉淀（盐析法） 有机溶剂沉淀 选择性沉淀（热变性和酸碱变性） 等电点沉淀 有机聚合物沉淀,（一）盐析沉淀法（改变离子强度）,1. 基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象： 1) 盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋

12、白质的溶解度。,蛋白质的盐析,硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响,离子强度,盐 析,盐溶,原因： 高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。 不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。,蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域,1）中性盐的选择 常用（NH4）2SO4，其突出优点： a. 溶解度大 b. 分离效果好 c. 不易引起变性 d. 价格便宜,2. 盐析用盐,2) 盐浓度的表示 用饱和（溶解）度表示: 溶液中饱和硫酸铵的体积 饱和度 溶液的总体积,3) 调整盐浓度的方式 a. 饱和溶液法（添加饱和硫

13、酸铵溶液） 适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。 配制饱和硫酸铵溶液,所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算： S2-S1 V=V0 1-S2 式中 V,V0分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积 S2,S1分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度,b. 添加固体硫酸铵 适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。 按下式计算，得表中数据 B(S2-S1) W= 1-AS2 A,B常数，与温度有关。 实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。,调整硫酸铵溶液饱和度计算表,盐析操作,低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，

14、一般终饱和度不超过40。 高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。 1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。 2）冰箱中（4）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。 3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration） 、透析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。,3. 盐析曲线的制作 如要分离一种新的蛋白质和酶，应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。 蛋白质量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵 饱和度,硫酸铵浓度（%） 枯草杆菌-淀粉酶发酵液的盐析曲线,4. 盐析的影响因素 1) 离子强度和种类（介绍盐析常

15、数） 蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：,I：离子强度，I = MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数 S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。 Ks代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。,当温度一定时，S0对于某一溶质是常数，用表示，盐析方程式可改写为： log S = - Ks I 两种盐析法： Ks分级盐析法 ：在一定的pH和温度条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。 分级盐析法 ：

16、在一定离子强度下，通过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。,2) 蛋白质浓度： 过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%最好。 3) pH值：等电点处最易沉淀。 4) 温度的影响： 稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。 浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。 一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在04下操作。,（二） 有机溶剂沉淀（降低介电常数） 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。 1. 沉淀机理 降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 2. 常用有机溶剂 丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。,3.优缺点： 优点：1）分辨率比盐析法高

17、2） 沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：1）容易引起蛋白质变性失活 2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。,4. 影响有机溶剂沉淀的因素 （1）温度 ：低温（0）操作。 （2）pH 值：尽可能靠近其等电点。 （3）离子强度：采用0.05mol/L的稀盐溶液 增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度 目的 防止蛋白质变性 （4）蛋白质浓度：适当，一般为520mg/ml,（三） 等电点沉淀(isoelectric precipitation) 1.原理 蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点 2. 使用方法 单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与

18、其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。,3. 优点： 1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内 2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低 3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化 4. 缺点： 酸化时，容易引起蛋白质失活,（四）有机聚合物沉淀法 1. 作用机理： 与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。 2. 沉淀剂： 常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写 PEG ） 多用分子量为600020000的 PEG。 3. 优点： 操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当 多的生物大分子。 沉淀后有机聚

19、合物容易去除。,（五）选择性变性沉淀法 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。 热变性 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。 pH变性 等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。 有机溶剂变性 使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。,六、萃取（extraction）分离 利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。 特点： 1）比化学沉淀法分离程度高 2）比离子交换法选择性好、传质快 3）比蒸馏法能耗低,（一）溶剂萃取法 明确几个概念： 料液：供提取的溶液。 溶质：料液中欲提取的物质

20、。 萃取剂 ：用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂 。 萃取液 ：经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与 萃取剂形成的溶液 。 萃余液：被萃取出溶质后的料液 。 反萃取（back extraction）：完成萃取操作后， 将产物从有机相转入水相的萃取操作。,溶剂萃取法是以分配定律（即溶质的分配平衡规律 ）为基础。 在一定温度、压力下，溶质分布在两个互不相溶的溶剂里，达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数。 萃取相浓度 C1 分配系数 K0 = = 萃余相浓度 C2 K0值随溶液pH的变化甚大，这是用萃取法实现溶质提取的重要基础。,普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离， 因为: 1） 蛋白质亲水性，

21、不溶于有机溶剂 2） 蛋白质在有机相中易变性失活 故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物物质的提取。,萃取操作的3个步骤： 1）混合 2）分离 3）溶剂回收,单级萃取 使用一个混合器和一个分离器 单级萃取流程93,（二） 双水相萃取技术 又称水溶液两相分配技术 （partion of two aqueous phase system） 用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%90%），故称“双水相”系统。,优点： 1）每一水相中均有很高的含水量，为 酶等生物物质提供了一个良好的环境； 2）PEG、

22、Dextran和无机盐对酶等无毒 害作用，不会引起变性。,双水相的形成： 两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。,a,双节线,系线,b,双节线,均相区,均相区,两相区,两相区,系线,临界点,PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图,几种典型的双水相系统 聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇 葡聚糖（Dex） 羟丙基葡聚糖 聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（Dex） 硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇 羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素 聚乙二醇（ PEG） 磷酸钾、硫酸铵 硫酸钠、硫酸镁,2. 萃取原理： 利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。,3. 应用 胞内酶

23、的提取和精制: 除去细胞碎片，并使酶得到纯化。,几种典型的双水相萃取酶蛋白实例 酶 菌 种 相系统 延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 盐 天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 盐 -半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 盐 亮氨酸脱氢酶 Bacillus sp. PEG/Dex 乙醇脱氢酶 Bakers yeast PEG/ 盐 青霉素酰化酶 E. coli PEG/ 盐,双水相萃取法的重要研究方向 亲和萃取（亲和分配 ） 使用具有生物特异性的配基（ligand）来提高分离选择性。,亲和萃取酶实例,（三） 超临界流体萃取 兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常规溶剂萃取的区别

24、：将超临界流体作为萃取剂。 超临界流体(supercritical fluid，SCF）：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点临界点后的流体。,临界点的概念可用临界温度和临界压力解释： 临界温度：高于此温度时，无论加压多大也不能使气体液化。 临界压力：在临界温度下，液化气体所需要的压力。,SCF性质介于液体和气体之间 ： 1) SCF密度接近于液体，溶解度高。 2) SCF粘度和扩散系数接近于气体， 传质扩散快。,基本过程： 1）在SCF中，溶解度大的物质溶于其中，与不溶解或溶解度小的物质分开。 2）降低压力，使SCF变为气态（密度降低），溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。,常用

25、超临界液态CO2作为萃取剂， 因为： 1）液体CO2无毒 2）临界温度（304.06K）接近常温 3）临界压力（7.38MPa）较低 4）操作安全,超临界CO2萃取技术在生物、食品 等工业中的应用 CO2萃取部分产品 原料名称 产物名称 原料名称 产物名称 小麦胚芽 胚芽油 豆子 豆油精炼油 啤酒花 啤酒花精油 茉莉花 净油 辣椒 辣椒红色素 菊花根 除虫菊酯 当归 精油 紫草 紫草宁 银杏叶 银杏内酯 花生 精炼油,（四） 反胶团萃取 1. 反胶团：又称反胶束（Reversed Micelles） 指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机 溶剂中自发形成的一

26、种稳定的纳米级的聚集体。,反胶团模型 亲水基团向内聚集,p154,2. 萃取过程 第一步：将酶从水相中萃取到反胶束相中。 第二步：将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相 中，实现对蛋白质的反萃取过程。,反胶团萃取原理,3. 表面活性剂及有机溶剂 反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是在有机溶剂中加入了少量表面活性剂。,（1）表面活性剂 常用： AOT(Aerosol OT)（阴离子表面活性剂，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸钠）。 特点：易获得，强度好；极性基团小，形成的反胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子进入。 （2） 非极性有机溶剂 环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。,4. 优点 1）萃取率和反萃取率

27、高。 2）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。 3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。 4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。 5）成本低。,第二节 酶的精制 酶纯化的基本原则： 建立一个方便灵敏的分析方法； 选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤； 常在低温（4）条件下进行纯化，以避免酶的变性。,一、膜分离 借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。,（一） 扩散膜分离 透析（dialysis）,溶质分子Y 从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动,蛋白质透析,1. 透析膜 商品透析膜大多制成管状 。 材料：纤维素衍生物。 1）透析膜的预处理：目的：除杂质。

28、2）透析袋的保存 ：防腐剂冷藏。,2. 透析方法及装置,透析袋透析简单装置。 A:透析夹，B:透析，C:透析示意图,（二）加压膜分离 根据所截留物质颗粒大小的不同，分为：,微滤(Microfiltration，MF) 一种静态过滤，随过滤时间延长，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；,超滤 (ultrafiltration，UF ) 一种动态过程，由泵提供推动力，在膜表面产生两个分力：一个是垂直于膜面的方向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜面平行的切向力，把膜面截流物冲掉。,超滤原理的示意图,利用超滤膜在一定压力下使溶液中大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方

29、法。 超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。,常规过滤(A)和超滤(B)的示意图,A,B,图4-61 超滤浓缩装置,反渗透（Reverse osmosis，RO）,利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂(通常是水)的性质，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。,渗透与反渗透,Reverse Osmosis (RO),Nanofiltration (NF),Ultrafiltration (UF),Microfiltration (MF),Membrane Filtration,3. 电场膜分离 （1）电渗析： 在半透膜的两侧分别装上正、负电极。（2）离子交换膜电

30、渗析： 用离子交换膜代替一般的半透膜。 应用：脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸及凝胶电洗脱。,二、层析法,层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。,色谱起源,色谱,组分,色素,石油醚,碳酸钙颗粒,用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography) 。,层析法的基本原理,利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固

31、定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。 mobile phase：携带样品流过整个系统的流体 stationary phase：静止不动的一相,层析法的分类,流动相有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相 按两相所处的状态分类： 液相层析 液-固层析 液-液层析 气相层析 气-固层析 气-液层析,按层析过程的机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。 凝

32、胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。,按操作形式不同分类： 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。,Column Chromatography,层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备: 层析柱、蠕动泵（恒流泵）、紫外检测仪、部分收集器、梯度洗脱器。,层析设备,层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器,记录仪,低温层析柜,层析操作,分离前： 1）树脂预处理：凝胶溶涨。离子交换纤维素需

33、作酸碱处理。 2）装柱：重力沉降法，要求均匀，无气泡。 3）平衡：层析柱使用前，须用缓冲液平衡至所需的pH值和离子强度。,层析操作,分离中： 上样：体积尽可能小。 平衡：用缓冲液使不被吸附的杂蛋白穿过。 洗脱： 连续梯度洗脱：连续改变缓冲液的pH或离子强度。 阶梯式梯度洗脱：分段地改变缓冲液的pH或离子强度。 等温平衡洗脱：用平衡缓冲液直接进行扩展洗脱。 同时进行分步收集和检测。 分离后：再生，平衡，保存。,蛋白质定量-分光比色仪(A280)法 蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基（主要是色氨酸Trp和酪氨酸Tyr 的共轭双键）对紫外光有吸收，以色氨酸吸收最强，最大吸收峰为280nm。,

34、在波长280nm具有吸光的氨基酸,分光比色仪裝置图,紫外吸收法,平衡、吸附,盐梯度冲洗 分管收集,蛋白测定制图,测A280,（一）吸附层析（adsorption chromatography） 1. 原理 利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。,吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。 吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选择。,2.吸附剂 吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。 1）吸附剂的选择： 根据吸附能力强弱分为： 弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等 强吸附剂：氧化铝

35、、活性炭,吸附剂的选择根据相似相溶原则： 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质 非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。 但为了便于解吸附，对于极性强的物质通常选用极性弱的吸附剂进行吸附。,2）吸附剂的性质： 活性炭：常用的吸附介质。 硅胶：常用的极性吸附介质。 羟基磷灰石 （HA） Ca10(PO4)6.(OH)2 : 微晶型的磷酸钙制品，表面有Ca2+和PO43-两种带电基团； 酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白质可与PO43-结合。 吸附原理是HA的Ca2+与蛋白质的负电荷基团作用。,3. 洗脱剂 要求： 粘度小，纯度高，稳定性好，完全洗脱下所要分离的成分,易与目标分子分离。 选择： 具有

36、较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相。 生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂。,4. 应用 分离纯化生物大分子,（二）凝胶过滤层析 凝胶过滤（gel filtration）又称分子筛层析（molecular sieve chromatography）、排阻层析（exclusion chromatography）,是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。,1. 基本原理 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。,Size-exclusion chromatography,凝胶对溶质的

37、排阻程度可用分配系数Kd表示： Ve-Vo Kd= Vi Vo外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml） Vi内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml） Ve某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）,凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰 . Kd=0时,即Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。 . Kd=1时,即Ve=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。 . 其它组分0Kd1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。,分配系数Kd的意义： 1) 可定量地衡量各组分的流出顺序。 2) 判断分

38、离效果，Kd差异大，分离效果好， Kd差异小，分离效果差。,2.凝胶的种类和性质 1)交联葡聚糖凝胶（dextran gel) 商品名:Sephadex 型号 Sephadex G10至G-200 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。,葡聚糖凝胶层析介质的有关参数,2）琼脂糖凝胶（agarose gel) 商品名:Sepharose （瑞典）; Bio-Gel A (美国） 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。,Sepharose及Bio-gel A 型号,3）聚丙烯酰胺凝胶 （polyacrylamide gel） 商

39、品名为Bio-Gel,型号从 Bio-Gel P2至P-300，P值越大，孔径也越大。 以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。,3. 操作： 1）凝胶的选择和处理 根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。 将干胶悬浮于510倍的蒸馏水中 ，充分溶胀，抽气，装柱。 2）柱的选择 采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。,3）加样 体积不能过多，不超过床体积的5，脱盐时可在10左右。 4）洗脱 洗脱液与平衡时用的buffer一致。 洗速不可过快，保持恒速。 5）胶的保存 洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。 用0.02%NaN3防腐。,4.

40、 应用 1）脱盐 ) 生物大分子物质的分离纯化 3）分子量的测定 4）溶液浓缩,LogM=k1-k2Ve,（Ve为洗脱体积）,先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。,蛋白质的洗脱体积与其分子量有关,（三）离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC） 1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。,1）离子交换剂： 离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。,如羧甲基纤维素离子交换剂组成 纤维素OCH2COO-Na+ 载体 电荷基团 反离子,化学原料合成 ：树脂类物质 载体 天然材

41、料制成： cellulose sephadex sepharose 阳离子交换剂: 电荷基团（）, 反离子（） 电荷基团 阴离子交换剂: 电荷基团（）, 反离子（） 如：DEAE-纤维素， CM-Sepharose,离子交换剂,-带有电荷基团的不溶性载体,-O-CH2CH2N-H,CH2CH3,CH2CH3,Cl-,载体,Diethylaminoethyl (DEAE),两种离子交换剂,阴离子交换剂： 常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基 阳离子交换剂： 常用羧甲基 CM CH2COO 磺丙基 SP C3H6SO3,DEAE C2H4N+(C2H5)2H QAE C2H4N+(C2H5)2

42、CH2CH(OH)CH3,离子交换葡聚糖,以Sephadex G-25, G-50为骨架，接入离子交换基团。 DEAE（QAE） Sephadex A-25，A-50 CM（SP） Sephadex C-25，C-50 A：anion 阴离子 C: cation 阳离子,离子交换葡聚糖,离子交换剂的选择 a. 强、弱离子交换剂的选择： 强型：适用的pH范围广，制备无离子水 弱型：适用的pH范围窄，分离生物大分子物质 b. 阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性 若pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂,2）蛋白质的电荷性质,pH 值如何影响蛋白质的电荷数,2,4,6,8,10,12,14,0,系

43、统 pH,+ 蛋白质带正电荷,蛋白质带负电荷,等电点,-,实验设计原理,利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷不同，因而与离子交换剂有不同吸附力而分离。,pH6.0,pI 6.0 蛋白质带正电,pI 6.0 蛋白质带负电,2. 阴离子交换剂分离蛋白质的过程,平衡,吸附,去吸附,分离结束,再生,+,低盐,高盐,利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Ion-exchange chromatography,3. 操作 平衡 上样 平衡 洗脱 再生

44、 1）上样：上样体积不十分严格。 2）洗脱: 增加溶液的离子强度 梯度洗脱法 改变溶液的pH值 3）再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl处理。 4.应用 制备纯化生物大分子,图4-39 梯度溶液的制备方法和洗脱曲线 （a）线性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）编程梯度,（四）疏水层析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） 从分离纯化的机制看，属吸附层析类。利用疏水层析介质和蛋白质分子都具有一定的疏水性质 ，根据被分离成分与固定相之间疏水力大小的不同而进行分离。,大多数蛋白质具

45、有较强的亲水性，但分子内部存在一个疏水核心， 欲让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠蛋白质表面的一些疏水补丁（hydrophobic patch），或让蛋白质发生局部变性（可逆），暴露出掩藏于分子内的疏水性残基。,原理:,在高盐浓度下，蛋白质发生局部可逆变性，被迫与疏水层析的固定相结合在一起，然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的蛋白质，按其结合力大小，依次进行解吸附。,2. 吸附剂 亲水性（如 Sepharose） 基质 固定相 疏水性（如硅胶、树脂） 配体 （疏水性基团）（苯基、辛基、烷基）,一些商品疏水层析介质,3. 操作 1） 加样：样品溶液中补加适量的盐。 2） 洗脱

46、：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。 3） 再生：除去固定相吸附的杂质 ，用水或 8mol/L 脲素溶液 。 4. 应用 主要用于分离纯化大分子物质。,（五）亲和层析(Affinity Chromatography) 由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。 又称： 功能层析（function chromatography） 生物专一吸附（biospecific adsorption）选择层析（selective chromatography）,1.原理 利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等

47、。,将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将欲分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。,+,C,C,C,配基,蛋白质,1.配基固相化,2.亲和吸附,固体载体,3.解吸附,Affinity chromatography,2. 基质的选择 理想的基质应满足以下要求： 高度的亲水性。 极低的非特异性吸附性（惰性）。 具有足够的化学基团。 适当的多孔性。 较好的理化稳定性。,可被应用的基质（载体）： （按性能优劣排序） 琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。 最常用的是琼脂糖，Sepharose 1B到

48、10B,3. 配体的选择 一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。 优良配体须具备的条件： 1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。,目的产物与相应的配基,4. 偶联（亲和吸附剂的制备） 配体一定，改造载体（基质） 1）基质活化： 不同的载体活化需要不同的活化剂。 常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。,溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。 如用CNBr 作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基,2）引入连接臂（space arm） 又称手臂（spacer ） “接臂” 的目的： 克服影响配基与生

49、物大分子的结合的空间障碍。 “接臂”的途径： 常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：AH-Sepharose 4B,常用手臂,5. 操作： 1） 层析前：制备亲和层析剂 选择 根据欲分离物质特性 配基 选择 根据配基分子大小及基团特性 载体 2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。 包括：非专一性洗脱和专一性洗脱,偶联,亲和层析剂,非专一性洗脱： 改变温度 改变pH值 改变离子强度 专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制 剂、底物类似物） 被吸附物质结合 竞争性地与 配体结合,6. 应用 1）纯化大分子物质 如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性

50、地结合碳水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose 4B 2) 研究酶的结构与功能： 分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。,(六) 高效（压）液相层析（HPLC：High Performance（pressure） Liquid Chromatography ）,特点： 使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高。 溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。 固定相（柱填料）： 常用坚硬、耐高压，粒度小的硅胶。,颗粒大小对分辨率的影响,流速为240ml/hr,流速对分辨率的影响,颗粒大小为5080目。,洗脱体积（ml）,1. 基本原理 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相

51、之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。 许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。,2. 分类 按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质分类： 亲和色谱： 亲和力 吸附色谱： 吸附力 离子交换色谱： 离子交换能力 凝胶色谱： 分子大小而引起的体积排阻 分配色谱： 分配系数,分配色谱又可分为： 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。 用的最多，约占6070。 固定相：硅胶填料是非极性的，官能团为烷烃。 流动相组成 ：常用“甲醇H2O” 。,反相色谱中，蛋白质按其疏水性大小进行分离，极性越大

52、疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，先被洗脱下来。 即：随着甲醇梯度的增加而洗脱出疏水性越来越强的蛋白质。,3. 色谱仪组成 1）进样系统 2）输液系统 3）分离系统 4）检测系统 5）数据处理系统,Principles of Operation for Chromatography Techniques,Gel Filtration,Ion Exchange,Hydrophobic Interaction,Affinity,Reversed Phase,衔接层析技术时注意事项,层析技术,结束情况,起始条件,小量样品,GF,低离子强度,IEX,高离子强度或pH 改变,高离子强度,HI

53、C,低离子强度,特异性结合,AC,特异性洗脱,样品稀释，缓冲液不变,第三节 电泳,电泳（electrophoresis, EP） ： 指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。 电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。,一、电泳的基本理论 1. 原理:,在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。,+,-,迁移率与内在特性和外界条件有关 内在特性：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状） 外界条件：电场强度、溶液性质、支持体特性,将带净电荷Q的

54、粒子放入电场，受到的电引力为： F引=EQ 在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻 = 6rV 当F引=F阻时 EQ = 6rV EQ V = 6r,影响迁移率的因素： 1）颗粒性质： Q越大、r 越小、形状越接近球形，v 越快。 2）电场强度：E越高，v越快。 3）溶液性质： pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定） 离子强度：离子强度越高，v 越低。 原因：离子氛（ionic atmosphere）。 通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。 4）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。 应避免用高电渗物质作支持介质。,自由界面电泳：又称移动界面电泳（mov

55、ing boundary electrophoresis, MBEP），指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。 区带电泳:（zone electrophoresis, ZEP）指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。 支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。,2. 电泳的分类,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： 纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,琼

56、脂糖凝胶电泳： 一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳： 可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。,3. 电泳常用设备 （1）电泳仪 ：为电泳提供稳定直流电源的装置 。 常压电泳仪（600V） 高压电泳仪（3000V） 超高压电泳仪（30000V50000V） （2）电泳槽： 自由界面电泳槽 管状电泳槽 板状电泳槽 （3）附属设备：,水平板式电泳槽,垂直板式电泳槽,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophores

57、is，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。,1.原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。,CH2=CH,C=O,NH2,CH2=CH,C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH,-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O -CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH NH2,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺凝胶聚合

58、的催化体系有两种： 1）化学催化系统：AP-TEMED 催化剂：过硫酸铵（ammonium persulfate，AP） 加速剂：TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺） 2）光催化系统：核黄素光（TEMED） 催化剂: 核黄素（维生素B2） 引发剂: 光 TEMED的存在，可加速聚合。,.,聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺N,N甲叉双丙烯酰胺聚合而成,凝胶的机械强度、弹性和透明度粘着度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。 T= C= 凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。 Acr与Bis的重量比应在30左右。,凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,Acr（g）+Bis（

59、g）,V（ml）,X100%,Acr（g）+Bis（g）,Bis（g）,X100%,聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表,2. 分离效应 PAGE根据其有无浓缩效应，分为： 连续电泳（continuous electrophoresis） 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统 不连续电泳（discontinuous electrophoresis） 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应 不连续PAGE 分子筛效应 浓缩效应,连续PAGE,1）电荷效应 : 分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。 2）分子筛效应 ：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率

60、。 3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,系统的不连续性表现在以下几个方面： 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。 因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。,8.3,8.3,8.9,6.7,聚

61、丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品缓冲液pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3,三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDS PAGE。 是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relative molecular mass, Mr）的一种最好的办法 。,SDS-PAGE separates proteins by MW,1.原理： SDS是一种阴离子去污剂，带

62、有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。 因此，蛋白质SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。,两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX MW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数 将已知分子量的标准蛋白质的迁移

63、率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,2. 操作：（SDS-PAGE及PAGE，即变性及非变性） 1）制胶: （变性：buffer 中加0.4%SDS） a. 分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液： Acr:Bis=29:1，分离胶buffer, TEMED, AP, 水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。 b. 浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。,2）样品制备： a. PAGE: 样品样品缓冲液（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝） b. SDS-PAGE: 样品样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸25min， 以除去亚稳态聚合。 3）加样