荧光定量PCR(RealTimePCR)实验原理实验设计和结果分析介绍.ppt

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1、（Real Time PCR）,实时荧光定量PCR介绍,生物秀专心做生物！,主要内容,Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR 实验方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 应用实例,生物秀专心做生物！,Real Time PCR 基础知识,Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 检测方法 Real Time PCR 检测系统,差异显示结果验证,定性分析,绝对定量,相对定量,病毒和病原菌检测,基因芯片结果验证,siRNA效果确认,mRNA表达量分析,Real Time PCR 用途,操作简单，无需电泳，检测快速

2、，降低污染几率， 适用于大量样品检测，检测灵敏度高； 可以在宽广范围内进行准确定量。,生物品种鉴定,病毒和病原菌定量分析,导入基因拷贝数解析,GMO定量检测,SNP解析,Ct值,Real Time PCR 原理,使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。,Real Time PCR,生物秀专心做生物！,同一个样品重复96次PCR的扩增曲线,Real Time PCR 原理,Ct值,生物秀专心做生物！,Real Time PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 ( C-代表Cycle，t-代表threshold）,Ct值概念,

3、阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上 设定的荧光检出界限。,Real Time PCR 原理,生物秀专心做生物！,在PCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个PCR进程，最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。,Real Time PCR 原理,生物秀专心做生物！,Real Time PCR 基础知识,Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 检测方法 Real Time PCR 检测系统,生物秀专心做生物！,Real Time PCR检测方法,荧光染料嵌合法(SYBR Green I) 荧光探针法 TaqMan p

4、robe Cycling probe Molecular Beacon probe Hybridization probe Scorpions probe Amplifluor probe,生物秀专心做生物！,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。,荧光染料嵌合法(SYBR Green I),SYBR Green I,生物秀专心做生物！,荧光染料嵌合法(SYBR Green I)作用机理示意图,热变性,引物退火,延伸反应,生物秀专心做生物！,TaqMan探针为一寡核苷酸， 5端标记一个报告荧光基团(Reporter)， 3端标记一个淬灭荧光基

5、团(Quencher)。,TaqMan Probe法作用机理,TaqMan Probe 法作用机理示意图,生物秀专心做生物！,Cycling probe为一寡核苷酸，5端标记一个荧光报告基团(Reporter)，3端标记一个荧光淬灭基团(Quencher)，寡核苷酸为DNA/RNA杂合体。,核糖核苷酸,Cycling Probe法,生物秀专心做生物！,热变性,酶切,延伸,Cycling Probe法基本原理,退火,SYBR Green I法vs Probe法,SYBR Green I 法 优点：价格便宜、使用方便、无需合成特异性探针。 缺点：引物要求高（要求特异性扩增）、不能进行多重PCR。

6、Probe法 优点：特异性强，能进行多重PCR。 缺点：需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难。,以前对PCR引物的选择、PCR试剂的优化 经验不足，Probe法较为广用。 但是,使用SYBR Green I 进行检测的问题点,SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反 应体系中有非特异性扩增，非特异性DNA也将同时被检测， 从而可能导致检测结果不准确。 Primer Dimer的产生 二条引物的3端具有互补序列时，引物自身也会进行扩增， 产生短链DNA片段（Primer Dimer）。,3,3,使用 SYBR Green I 进行定量 PCR 的 Key Point

7、,Primer： 设计合适引物，防止非特异性扩增，是使用 SYBR Green I 进行定量 PCR 的 Key Point。,TaKaRa公司可以提供 最佳引物的设计合成服务,Real Time 进入 SYBR Green I 时代,设计合适的引物 选择适当的反应条件 使用良好的试剂,保证以上条件，使用SYBR Green I将 会更加便宜，更为方便，并拥有良 好的特异性。,生物秀专心做生物！,Real Time PCR 基础知识,Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 检测方法 Real Time PCR 检测系统,生物秀专心做生物！,Real Time PC

8、R检测系统-简介,LightCycler 480,Rotor-gene6000,MiniOpticon,Mx3005PTM,LINE-GENE FQD-66A,ABI PRISM 7500,iQ5 Real-Time PCR Detection System,TaKaRa TP800,各公司Real Time PCR检测系统比较,生物秀专心做生物！,Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR 实验方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 应用实例 Real Time PCR 相关试剂与服务,主要内容,生物秀专心做生物！,Real Time P

9、CR 实验方法,Real Time RT-PCR反应,以RNA为起始实验材料时。,Real Time PCR反应,以DNA为起始实验材料时。,生物秀专心做生物！,Real Time PCR 实验方法,反转录反应,One Step RT-PCR和Two Step RT-PCR的选择 RT Primer的选择 Total RNA中genomic DNA混入的对策,Real Time PCR反应,Real Time PCR引物及探针的设计 引物反应性确认 PCR条件优化顺序,生物秀专心做生物！,One Step RT-PCR 和 Two Step RT-PCR的选择,适用于mRNA表达量解析 Two

10、 Step RT-PCR效率高 使用Random和Oligo-dT 引物可以制备cDNA pool cDNA可长期保存,适用于病毒、病原菌检测 操作简单 污染几率低,生物秀专心做生物！,Random 6mer Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer,RT Primer的选择,Random 6mer Primer,Gene specific Primer,Oligo dT Primer,生物秀专心做生物！,RT Primer的选择,Random 6mer,1,500base,目的片段,5,3,R,F,目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA

11、表达量分析最适。,目的片段在距Poly(A) Tail 1.5kbp以内适用。,One Step RT-PCR只能使用Gene specific Primer， 不适用于mRNA表达量分析等复数基因的检出。,5,3,Gene specific Primer,目的片段,R,F,AAAA,5,3,目的片段,R,F,1,500base,Oligo dT Primer,生物秀专心做生物！,mRNA,Primer F,Primer R,目的片段,RT-PCR,外显子1,基因组DNA,PCR,外显子2,外显子3,外显子1,外显子2,外显子3,内含子2,内含子1,Primer F,Primer R,目的片段

12、,Total RNA中Genomic DNA混入的对策,此种情况必须采用DNase I处理，去除基因组DNA,生物秀专心做生物！,mRNA,基因组DNA,目的片段,RT-PCR,外显子1,外显子2,外显子3,Primer F,Primer R,Primer F,Primer R,PCR,长的扩增片段,无扩增片段,外显子1,外显子2,外显子3,内含子2,内含子1,Total RNA中Genomic DNA混入的对策,引物设计可以避免基因组DNA来源的Template扩增,生物秀专心做生物！,目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。,目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性

13、反应和引物二聚体要求严格。,Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同,= 对引物设计要求严格,普通PCR引物,Real Time PCR引物,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time PCR用引物设计原则,号表示重要程度，号越多，表示该参数越重要，设计时要优先考虑,生物秀专心做生物！,目的基因序列获得,好的引物 需要寻找好的参照序列,引物设计,分析序列,特异性确认,基因组序列确认,RefSeq序列,目的基因,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time RT-PCR 引物,生物秀专心做生物！,（http:/www.ncbi.nlm.nih

14、.gov/RefSeq）,通过NCBI获得参考序列和相关情报。RefSeq数据库提供无重复，准确性，完整性的基因参考序列。 序列可信度高，信息量大,NCBI:,The National Center for Biotechnology Information,NM_008777,RefSeq,评价,Pah,Pah,Pah,Pah,X51942,BC013458,BI330290,BF789560,X51942,BC013458,BI330290,BF789560,Pah,Pah,GenBank,Real Time PCR引物及探针设计,生物秀专心做生物！,NCBI提供目的基因相关信息 （基因名

15、、染色体上的位置、Accession、表现型、文献索引、同源性等其他数据库以及功能、pass way、蛋白质图谱等） 基因词典,Real Time PCR引物及探针设计,生物秀专心做生物！,LOCUS NM_008777 1959 bp mRNA linear ROD 15-APR-2005 DEFINITION Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA. ACCESSION NM_008777 VERSION NM_008777.1 GI:6679202 SOURCE Mus musculus (house mouse) ORGAN

16、ISM Mus musculus FEATURES Location/Qualifiers gene 1.1959 /gene=Pah /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 CDS 48.1409 /gene=Pah /note=go_function: iron ion binding goid 0005506 /protein_id=NP_032803.1 /db_xref=GI:6679203 /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 ORIGIN 1 aattcaaccc tgtgctaagc taga

17、cacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtt

18、tttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag 481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 5

19、41 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgga agatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtc

20、gtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca agg

21、aaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaaggg

22、tt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag 1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 15

23、61 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt,GenBank file,NM_008777,Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA.,目的基因序列获得,引物设计,序列分析,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time RT-PCR 引物,生物秀专心做

24、生物！,1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca 241 ttgaatccag acct

25、tcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag 481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gg

26、gcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgga agatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc

27、ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actg

28、gtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctc

29、c gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag 1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tat

30、attttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt 1681 tctcatcaac attcatcaaa tttgggactc atatcatttg ggctctgtct gttcattttt,CCTGGCCAAGGTCCTGCG,TTGGAACCAGGGCACTGTGT,AAAGCAGTTTGCTGACA

31、TTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,ACTCTTGCGACATGTGCCCTTG,TCTTCTCTAGCTCCAGGGCC,AAAGTCATGAACAGAAAGTGA,GTGATCCTCCACTATGTTAG,Forward,Reverse,目的基因序列获得,引物设计,序列分析,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time RT-PCR 引物,生物秀专心做生物！,CCTGGCCAAGGTCCTGCG,TTGGAACCAGGGCACTGTGT,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTC

32、CTGAACACCGTTCC,ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG,TCTTCTCTAGCTCCAGGGCC,AAAGTCATGAACAGAAAGTGA,GTGATCCTCCACTATGTTAG,Forward,Reverse,5-,5-,5-,5-,5-,5-,5-,5-,-3,-3,-3,-3,SNP,3 末端的T,3bp互补,目的基因序列获得,引物设计,序列分析,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time RT-PCR 引物,生物秀专心做生物！,物种选择,参考数据库 RefSeq-rna,WordSize 7,目的基因序列获

33、得,引物设计,序列分析,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time RT-PCR 引物,生物秀专心做生物！,AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC,TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC,5-,5-,-3,http:/genome.ucsc.edu,目的基因序列获得,引物设计,序列分析,特异性确认,基因组序列确认,目的基因,-3,Real Time PCR引物及探针设计,Real Time RT-PCR 引物,生物秀专心做生物！,Real Time PCR用TaqMan探针设计原则,Real Time PCR引物及探针

34、设计,号表示重要程度，号越多，表示该参数越重要，设计时要优先考虑,生物秀专心做生物！,TaqMan探针荧光标记物选择,Real Time PCR引物及探针设计,生物秀专心做生物！,引物反应性确认,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,No template control确认,PCR扩增效率（E）:0.8-1.2,35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增,30Cycles内无引物二聚体产生,相关系数（r2）：大于0.98,生物秀专心做生物！,PCR条件优化顺序,标准Protcol 95 10sec. 60 20sec. (Prime

35、r 终浓度200nM),B. 有非特异性扩增时 提高退火温度 缩短退火、延伸时间 降低引物浓度,A. 扩增效率低时 延长退火、延伸时间 提高退火、延伸温度 改为三步PCR,降低退火温度 提高引物浓度,生物秀专心做生物！,Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR 实验方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 应用实例 Real Time PCR 相关试剂与服务,主要内容,生物秀专心做生物！,Real Time PCR 解析方法,标准曲线分析 融解曲线分析 绝对定量和相对定量解析方法,生物秀专心做生物！,基线平整 Negative contro

36、l为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽,理想的标准品扩增曲线,生物秀专心做生物！,标准品的种类,DNA样品定量标准品 基因组DNA 质粒 PCR产物,RNA样品定量标准品 Total RNA & cDNA 体外转录RNA PCR产物或质粒,生物秀专心做生物！,绿色 部分为Real Time引物区,红色 部分为标准品构建用引物区,质粒标准品引物设计,质粒标准品构建,AGTACCTAGATCCTAG,AGTACCTAGATCCTAG,生物秀专心做生物！,质粒标准品构建流程,基因组DNA,PCR,目的基因克隆,质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/

37、ul，作为标准品。,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,生物秀专心做生物！,绿色部分为Real Time引物区,红色部分为标准品构建用引物区,蓝色部分T7启动子和Poly(T),RNA标准品引物设计,生物秀专心做生物！,RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。,体外转录RNA标准品构建流程,T7 RNA polymerase,体外转录RNA,Total RNA,PCR,cDNA,RT,T7 Promoter,TTTTT,PCR产物,目的基因,目的基因,目的基因,AAAAA,AAAAA,生物秀专心做生物！,标准曲线制作,扩增曲线,106 105

38、 104 103 102 101,标准曲线,106 105 104 103 102 101,标准品梯度的选择：56个梯度 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10,生物秀专心做生物！,理想的标准曲线,相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。,相关系数,斜率,扩增效率（E）计算方法,标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时 E=10-1/a-1 标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10) E=10-a-1,生物秀专心做生物！,Real Time PCR 解析方法,标准曲线分析 融解曲

39、线分析 绝对定量和相对定量解析方法,生物秀专心做生物！,Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。,融解曲线分析,SYBR Green I法进行检出时， 要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。,生物秀专心做生物！,特异性产物,非特异产物,引物二聚体,对PCR产物特异性进行分析,融解曲线分析,生物秀专心做生物！,标准曲线分析 融解曲线分析 绝对定量和相对定量解析方法,Real Time PCR 解析方法,生物秀专心做生物！,提取样品,绝对定量解析方法,引物设计,标准品制备,Real Time PCR反应,数据分析,流 程,生物秀专心做生物！,绝对定量解析方法,通过制作标准曲线来确定样品的初始模板

40、拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。,105,104,103,101,扩增曲线图,标准曲线图,检测样品,检测样品,102,以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正， 进行相对表达量分析。,理论上目的基因表达量分析条件,进行相对表达量分析必要性,实际上目的基因表达量分析,生物秀专心做生物！,管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等,筛选方法,根据文献提供 通过具体实验筛选,管家基因筛选,生物秀专心做生物！,P,P,P,O,管家基因筛选,生物秀专心做生物！,用实验例对相对定量计算进行

41、说明,相对定量解析顺序,生物秀专心做生物！,相对定量解析顺序,生物秀专心做生物！,通过标准曲线对对照样品、检测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。,相对表达量计算,相对值=,校正值=,目的基因定量结果,管家基因定量结果,检测样品的校正值,对照样品的校正值,相对定量解析顺序,生物秀专心做生物！,Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR 实验方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 应用实例 Real Time PCR 相关试剂与服务,主要内容,生物秀专心做生物！,Real Time PCR 应用实例,定

42、性分析 对人的ALDH2基因进行SNP解析 绝对定量 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量分析 相对定量 分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化,生物秀专心做生物！,定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,检测方法 Cycling Probe法 SNP位点 ALDH2 type1和ALDH2 type2 (G/A) 使用试剂 Cycleave PCR Core Kit TaKaRa Code.CY501 使用仪器 Smart Cycler ,实验背景 Aldehyde dehydrogenase-2（ALDH2）基因位于人类第12对染色体q24位置，有ALD

43、H2 type1和ALDH2 type2两种基因型，其基因表现序列最主要的差别在exon12第487个氨基酸位置，ALDH2 type1型为Glu(GAA), ALDH2 type2型为Lys(AAA)。,生物秀专心做生物！,热变性,酶切,延伸,Cycling Probe法基本原理,退火,RNase H分解,PCR扩增产物,PCR扩增产物,PCR扩增产物,杂合探针,杂合探针,杂合探针,PCR反应,模板DNA,野生型（wild homo）为ROX标记，突变型（mutant homo）为FAM标记。,利用Cycleave法的SNP解析原理,ROX荧光,ROX荧光,FAM荧光,FAM荧光,FAM荧光

44、,ROX荧光,Wild homo,hetero,Mutant homo,SNP point,定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,Cycling Probe法,PCR-RFLP法,ROX,FAM,ROX、FAM通道均有信号检出,Eco57 I CTGAAG(N)16 GACTTC(N)14 wild type :切断 Mutant type :不切断,ROX,FAM,Mutant,wild,ROX通道有信号检出,FAM 通道检出荧光信号,ROX,FAM,Mutant,wild,Mutant,wild,杂合型 (hetero),野生型 (wild homo),突变型 (mutant

45、 homo),生物秀专心做生物！,提取样品,引物、探针设计,Real Time PCR反应,数据分析,流 程,定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,生物秀专心做生物！,从人血液中（共计10个样品）提取基因组DNA,实验样品,提取试剂：Blood Genome DNA Extraction Kit (TaKaRa Code.D9081),定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,生物秀专心做生物！,实验结果,定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,杂合型,突变型,Sample1、 Sample2: 杂合型 (ROX, FAM 同时检出） Sample6: 突变

46、型（只有FAM检出） 其它Sample: 野生型（只有ROX检出）,生物秀专心做生物！,FAM,ROX,FAM,ROX,FAM,ROX,Sample1、 Sample2 同时检出ROX、FAM,Sample6只检出FAM,Sample3-5、7-10 只检出ROX,杂合型,突变型,野生型,定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析,生物秀专心做生物！,绝对定量应用例 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,检测方法 Taq ManTM probe 法 检测样品 3个从SARS病毒培养液中提取的genome RNA 目的基因 SARS病毒RNA 内 参 SARS Inter

47、nal Control RNA 标 准 品 SARS Control RNA 试 剂 One Step RT-PCR Kit（Perfect Real Time） TaKaRa Code.DRR044 仪 器 Smart Cycler ,生物秀专心做生物！,pBluescript II SK(+) vector,T7 promoter,SARS Control RNA构建,绝对定量应用例 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,生物秀专心做生物！,绝对定量应用例 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,纯化的SARS Control RNA OD值测定结果,体外转录

48、的SARS Control RNA 电泳照片,M1 M2,M1: -Hind digest M2: DL-2000 Marker,DNase I 处理前,DNase I 处理后,生物秀专心做生物！,DNA,T7 promoter,SARS Internal Control RNA的构建,绝对定量应用例 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,pBluescriptII SK(+)vector,生物秀专心做生物！,绝对定量应用例 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,体外转录的Internal control RNA电泳照片,M1: Hind digest M2:

49、DL-2000 Marker,纯化的SARS Internal Control RNA OD值测定结果,M1 M2,DNase I 处理前,DNase I 处理后,生物秀专心做生物！,探针的选择,绝对定量应用例 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,生物秀专心做生物！,SARS Control RNA105-101扩增曲线,SARS genome RNA Sample 1、扩增曲线,SARS Internalcontrol RNA扩增曲线,标准曲线,绝对定量应用例 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,生物秀专心做生物！,定量结果,绝对定量应用例 对SARS病毒

50、培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,对三个样品所含SARS病毒RNA进行了准确定量。,生物秀专心做生物！,检测方法 SYBR Green I荧光嵌合法 管家基因 GAPDH基因 目的基因 X基因 标 准 品 体外转录RNA 试 剂 SYBR ExScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time） TaKaRa Code No.DRR053 仪 器 Line-Gene33,相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化,生物秀专心做生物！,样 品,相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化,生物秀专心做生物！,Total RNA提

51、取,Total RNA基因组 DNA去除,标准品RNA制备,标准曲线制作及预实验,详细的实验资料获取,实验设计及引物 设计、合成,样品Real Time PCR反应,相对定量计算 及数据分析,数据整理及论文撰写,相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化,生物秀专心做生物！,提取Total RNA去除基因组DNA后电泳照片,RNA纯度：1.8 260/280 2.3,提取试剂：TaKaRa RNAiso Reagent TaKaRa Code D312,基因组DNA去除试剂：DNase I(RNase Free) TaKaRa Code D2215,相对定量应用实例分析小鼠

52、某目的基因药物处理不同时间点表达量变化,生物秀专心做生物！,构建RNA标准品电泳照片,M GAPDH X基因,TaKaRa in Vitro Transcription T7 Kit (TaKaRa Code D6140),相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化,生物秀专心做生物！,目的基因标准曲线制作结果,扩增曲线图,融解曲线图,标准曲线图,管家基因标准曲线制作结果,相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化,生物秀专心做生物！,样品目的基因定量结果,扩增曲线图,融解曲线图,样品管家基因定量结果,相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点

53、表达量变化,相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化,生物秀专心做生物！,由以上结果显示小鼠某基因经药物处理6小时时表达量最高,相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化,生物秀专心做生物！,Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR 实验方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 应用实例 Real Time PCR 相关试剂与服务,主要内容,生物秀专心做生物！,Real Time PCR 相关试剂的选择,试剂选择的要素 TaKaRa Perfect Real Time相关试剂在各种仪器上的适用性 T

54、aKaRa Perfect Real Time相关试剂与其它公司同类产品的比较 TaKaRa Perfect Real Time相关系列产品特点 TaKaRa Real Time相关试剂的选择,生物秀专心做生物！,使用方便性 2Premix type，无需反应条件摸索。 高扩增效率可以检测低拷贝DNA模板。 高反应特异性可在宽广范围内进行准确定量。 与Real Time PCR检测系统的匹配性选择适用于各种Real Time PCR检测系统的试剂。 价格因素降低实验成本。,试剂选择的要素,生物秀专心做生物！,定量范围宽广,扩增效率高， 起峰时间早,低拷贝检测清晰,反应特异性高， 负对照扩增稳定

55、 (无非特异性扩增),间隔距离均匀,信号强度高,试剂选择的要素,生物秀专心做生物！,实验项目 以DNA（1fg、10fg、100fg、1pg、10pg、100pg、1ng） 为模板，进行300bp扩增性能及扩增特异性检测。,试剂名称 SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time） Code No.：DRR041,TaKaRa Perfect Real Time相关试剂在各种仪器上的适用性,Smart Cycler ABI 7000 Light Cycler 2.0 Rotor-Gene 2000,使用仪器,生物秀专心做生物！,增幅效率=1.02 相关系数= 1.

56、000 (Standard Curve取7点）,增幅效率=0.99 相关系数= 0.999 (Standard Curve取7点）,实验结果,ABI PRISM 7000,Lightcycler 2.0,Rotor-gene 2000,Smart Cycler II (Ver.2.0C),增幅效率=1.02,相关系数=0.999,（Stand curve取7个点）,增幅效率=1.03 相关系数= 1.000 (Standard Curve取7点）,TaKaRa Perfect Real Time相关试剂在各种仪器上的适用性,生物秀专心做生物！,试剂名称 SYBR Premix Ex TaqTM

57、（Perfect Real Time） TaKaRa CodeDRR041 以及A、B、C、D公司同类试剂,实验项目 以DNA（1fg、10fg、100fg、1pg、10pg、100pg、1ng）为模板， 进行300bp扩增性能及扩增特异性检测。,使用仪器,ABI 7000,TaKaRa Perfect Real Time相关试剂与其它公司同类产品的比较,生物秀专心做生物！,在ABI PRISM 7000上的比较,TaKaRa C A,TaKaRa Perfect Real Time相关试剂与其它公司同类产品的比较,进行 Real Time PCR,TaqMan Probe探针法,Cyclea

58、ve探针法检测 (CycleavePCR),不需要优化反应体系,不需要优化反应体系,要组成独特反应体系,SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (Code RR041A/B ),CycleavePCR Core Kit (Code CY501),TaKaRa Ex Taq R-PCR er.2.1 (Code RR031A/B ),Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (Code RR039A/B ),进行Real Time RT-PCR反应,SYBR Greenl法检测,TaqMan Probe探针法,Cycleave探针法

59、检测 (Cycleave RT-PCR),SYBR Ex Script RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (Code RR053A ),Ex Script RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (Code RR051A ),Cycleave RT-PCR Core Kit (Code CY502),One Step RT-PCR,One StepSYBR RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (Code RR046A/B ),One Step RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (Code R

60、R044A/B ),对使用Perfect Real Time进行Real Time RT-PCR的客户,提供primer合成服务,标准品稀释专用试剂-EASY Dilution (Code No.9160),探针法检测,SYBR Greenl法检测,探针法检测,生物秀专心做生物！,TaKaRa Perfect Real Time相关系列产品特点,适合各种Real Time PCR装置 适合快速Real Time PCR反应 高性能的PCR扩增 宽广范围内准确定量 灵敏的低拷贝模板检测 ROX Reference Dye附带 BSA添加 价格优势,Real Time PCR 相关试剂的选择,生物

61、秀专心做生物！,Real Time PCR用引物设计合成服务 Real Time PCR检测技术服务,Real Time相关服务,生物秀专心做生物！,使用专用引物探针软件，免费设计。 与Perfect Real Time系列试剂配套使用效果最佳。不需要反应条件检讨。 不易形成引物二聚体。 进行RNA引物设计时通常设计在exon junction上，使用genomic DNA的扩增难以进行。 引物序列不含有已知的SNP位点(已在dbSNP上登录) 通过同源性检索确认了其特异性。 可根据实验目的，自主选择设计的区域，通常一个目的基因提供1-3对引物。,TaKaRa设计Real Time PCR用引

62、物探针特点,对登录在NCBI RefSeq上的MouseRatHuman的mRNA序列已全部设计完成(SYBR法),Real Time PCR用引物设计合成服务,生物秀专心做生物！,内含子大小,全序列中内含子数目,点击进入UCSC网站,内含子大小,全序列中内含子数目,点击进入UCSC网站,引物详细资料,Real Time PCR用引物设计合成服务,生物秀专心做生物！,Real Time PCR检测技术服务,TaKaRa Real Time PCR检测技术服务包括从引物探针设计合成到Real Time PCR反应性确认以及样品检测、解析的全套服务。,技术不足,条件不足,技术、条件都不足,02164127324,hello,时间因素,快速获得 满意实验结果,生物秀专心做生物！,客户提供信息,