银杏提取物EGb 761抑制热休克蛋白在食细菌线虫中的表达研究外文文献翻译、中英文翻译
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银杏提取物EGb 761抑制热休克蛋白在食细菌线虫中的表达研究摘要:EGb 761是一种典型的银杏叶提取物,它具有抗氧化营养的本质属性。我们以前论证了EGb 761 在食细菌线虫有机体模型中能增强抵抗力和延长寿命。在这项研究中,EGb 761 的物理分子在氧化力上的缓和效果被进一步研究用于基因被改变的食细菌线虫的GFP标记的可诱导的探讨热应激蛋白。Hsp-16-2的表达被胡桃醌促氧化剂催化,热应激力被分别由86%和33%配成的转基因线虫饲料所抑制。这样的影响与其相关761银杏叶提取物的能力能增加平均生存率急性氧化反应以及热应力在这一基本水平的过氧化氢的有机体。因此,我们把抑制hsp-16-2 绿色显示出银杏叶提取物表达减少细胞的压力。尽管如此,还是导致外源转录基因数的下降。这些结果支持这样一种假设,即银杏叶提取物EGb761加大了自然反压力线虫制度,从而增加抗氧化性和寿命。关键词:GFP记录,ROS,氧化力,外源转录基因数,EGb761,抗性。 所有的生物体已经开发了反应能力的综合环境威胁应激力响应高度同源性的蛋白质。一个普遍的反应温度升高和其他形式的压力是热应激诱导蛋白(HSPs)。这些包括HSP-100,HSP-90 HSP-70,HSP-60,HSP-40,HSP-30,sHSPs。该sHSPs属于一种低分子量多肽家族(12-43科威特第纳尔) 已通过人类的高度保守序列,并显示以及来自酵母在镜头乙晶状体功能的相似性。在一定的生理条件下,sHSPs是其中在热应力或氧化应激高度诱导热休克蛋白。线虫体种16 sHSPs已经确定。 16 kD的种类主要sHSPs (热休克蛋白- 16 - 1,热休克蛋白- 16 - 2,热休克蛋白- 16 - 41,和HSP - 16 - 48)是只表示在压力条件下产生。突变的热休克蛋白- 16 - 2启动子的HSF研究表明有其他可能性。银杏叶提取物的标准化761,两个主要活性成分组成,黄酮醇(24)和萜内酯(6),是由施瓦布制药(卡尔斯鲁厄德国提供)。异黄酮成分是来自Beaufour易普森(巴黎,法国)。该萜内酯包括遗传,国际标准,气相色谱,吉焦,和BB,获得了多科特(全国天然产物研究中心)的认可。银杏叶提取物储备液761(1000 )进行了100的乙醇。乙醇的最终浓度不超过0.01的食品(大肠杆菌OP50)。胡桃醌,5 -羟基- 1 ,均购自Sigma制药(圣路易斯,密苏里州)。线虫株的维护和治疗野生型菌株获得氮气的线虫基因中心,明尼苏达州大学(明尼阿波利斯,明尼苏达州)。转基因株hsp-16-2/GFP(CL2070)生成的特点如前面所述的链接。水母的绿色荧光蛋白含有CL2070记录转基因的启动子下的热休克蛋白基因的sHSP- 16- 2控制。联保热休克蛋白- 16- 2表达或热休克(2小时35 C)或暴露在胡桃醌(40微米,24h),已知的诱发超氧自由基的线虫醌。所有线虫生长培养基上培养(NGM)在60毫米的板琼脂和维持在温度控制的孵化20。大肠杆菌(OP50)为食物来源,并添加到表面镀的NGM 100ml。要获取年龄相仿的线虫,我们离开雌雄同体奠定他们的生活第三天(4-8小时),然后取出他们的同步生产的卵。对于预处理协议,银杏叶提取物喂线虫761对孵化48小时后的一天,和压力上适用第三天,他们在生存时,传递到成年期。结合胡桃醌提出为1毫克/ 1毫升100的乙醇。胡桃醌混合与NGM新鲜达到预期值,烘干至终浓度和管理,通过外源性皮肤的压力测试。荧光显微镜和HSP- 16 -2表达的定量使用CL2070应变,我们使用热或氧化应激诱导热休克蛋白- 16 -2基因表达。热休克时,hsp-16-2/GFP蠕虫,指出保持和以上同步,暴露于35 C的2-4小时蠕虫然后让其恢复正常。在20 C环境下12小时前拍摄照片。氧化应激是指揭露40微米的蠕虫胡桃醌24小时同时归纳结果后,对热休克蛋白-16 -2进行表达。通过直接观察测量的记者GFP荧光。萤光图像在相同的曝光使用显微镜的40 倍目标参数用数码相机(Micropublisher5.0装备(伯纳比,哥伦比亚省,加拿大)。量化的GFP报告动物种群,每个40 倍图像使用ProPlus4.51软件进行形象的分析生存实验耐热性测定采用热压力,蠕虫(3蠕虫各30道菜)为治疗100微克/毫升761银杏叶提取物48小时,然后被暴露2-4小时至35 C这个数字,生存力是每隔一小时计算,直到所有的都死了。氧化应激诱导急性,致死浓度胡桃醌在160微米。蠕虫先用100微克/毫升银杏叶提取物在孵化后761天,然后被转移到新的器皿中进行2天的治疗。胡桃醌被添加到液化NGM在65 C,然后吸管至35毫米的Petri板。后板已经凝固,OP50加入70m和板块在通风橱中干燥。蠕虫在一个被转移的准备器皿中,每30分钟计数,直到所有的都死了。如果他们不回应触摸刺激,则被确定为死亡。自由基氧化分析细胞内过氧化氢(H2O2)的有关活性氧(ROS)的测定:线虫使用2,7-二氯二乙(DCF法达,分子探针)。 DCF多巴胺是一种细胞渗透的染料,很容易转化为2,7- dichlorofluoroscein(DCF)的由相互作用主要与过氧化氢。现代同步诊断线虫EGb761是否在761天72小时孵化后,收集到100微升PBST(PBS包含0.1)各组30蠕虫和3次治疗组。这些蠕虫就受到定时同质化和超声,打破了外层角质层。样品被涡旋,于96孔板转让,并与50M的DCF法达在PBS孵育37荧光酶标仪(生物泰克仪器,Winookski,VT)的20 C温度中的定量,在激发485 nm,发射640 nm荧光,样品动力学10分钟为2.5小时。统计分析统计处理间进行了比较与非配对t检验用Origin 6.0软件(Microcal软件,北安普顿,马萨诸塞)。平均误差标准中使用了数字。 P的0.05差异被定义为具有统计学意义。研究结果:HSP-16-2的压力感应的表达被由EGb 761的转基因食细菌线虫所抑制。 我们早前曾表明,银杏叶提取物在模型中增加761线虫抗逆性。要确定这是否是由于银杏叶提取物761规范一个具体压力反应的基因,我们使用转基因线虫(CL2070)表达作为诱导热休克蛋白基因绿色荧光蛋白162记录表达。图1A显示了野生型(a)和转基因表型应变CL2070),其中hsp-16-2/GFP基因的表达,从上升温度20 C诱导以35小时2经热应力诱导,GFP荧光是在头部可见蠕虫,包括咽,在转基因蠕虫前神经环上,但不是在野生型对照组。对热休克蛋白16热休克诱导2表达显着抑制33CL2070蠕虫与银杏叶提取物(GFP的平均主场迎战银杏叶提取物处理,绿色荧光蛋白像素密度75像素密度平均50岁,72例蠕虫,磷0.05,图1B)。图1B插图:代表hsp-162/GFP。热休克诱导CL2070蠕虫未处理(a)或100ml处理的表达,10微克/毫升银杏叶提取物761(b)项。转基因蠕虫暴露于40m的胡桃醌的氧化压力下,24小时产生更高的热休克蛋白- 16- 2表达(图1C,插图一)比热休克诱发(图1B,插图一)能量更高。胡桃醌较短的曝光时间,也诱导热休克蛋白,但至A -16- 2表达较小的程度:11和30的诱导,观察暴露于6h胡桃醌蠕虫和12 h(24小时曝光设置为100,数据未显示)。最重要的是,胡桃醌诱导的热休克蛋白- 16- 2表达显示由86降低预处理的蠕虫100微克/毫升761银杏叶提取物,而未经处理的对照组(图1C示),从类似的结果中获得了接触到高浓度的胡桃醌蠕虫(60微米,数据未显示)。这可能是表达的hsp-16-2/GFP银杏叶提取物761衰减可能是由于药物的干预与记录表达绿色荧光蛋白质本身。为了排除这种可能性,我们使用了转基因染色体整合线(CL1234)来表达绿色荧光蛋白的组成泛神经元,作为启动子控制。蠕虫的CL1234银杏叶提取物诊断的761为CL2070蠕虫的同一时间同一浓度,绿色荧光蛋白随后荧光测定荧光显微镜。插图1B显示了代表绿色荧光蛋白表达的控制(A)和EGb761处理CL1234蠕虫。对于统计分析GFP基因表达的影响银杏叶提取物治疗761,只有前神经元在头部区域的蠕虫进行概述和分析。由三位独立30蠕虫每个实验,荧光密度没有明显受到影响与银杏叶提取物761(图一维图)蠕虫的CL1234治疗,强烈表明银杏叶提取物的hsp-16-2/GFP衰减不是一个偶然。银杏叶提取物761治疗增加压力条件下存活的转基因线虫率为了提供进一步的证据表明,热休克蛋白- 16- 2表达的银杏叶提取物治疗761衰减,动物是一个有益的作用,我们在处理CL2070蠕虫或生存实验银杏叶提取物761之前没有接触到任何一热或一氧化压力。图2A表明,与100微克的CL2070蠕虫预处理/761毫升增加了银杏叶提取物。生存在热休克反应(在15小时,控制15.0 10.1对比百分之生存银杏叶提取物48.60.9,共189人虫)。图2b显示,该CL2070蠕虫100mg/ml预处理761银杏叶提取物提高他们的存活率回应暴露在亲氧化剂胡桃醌(160M)会(平均存活:控制银杏叶提取物5.64.6,N= 179蠕虫),这一结果是一致的。我们在与野生型线虫以前观察银杏叶提取物治疗761,并进一步表明,银杏叶提取物761 hsp-16-2/GFP表达不会导致异常生理变化衰减,可能影响GFP报告基因的表达。用银杏叶提取物治疗EGb 761抑制热休克蛋白- 16 -2表达银杏叶提取物761一直被称为具有双重抗氧化的行动,其类黄酮成分要清除自由基,抗氧化释放的银杏内酯成分能够防止形成自由基。为了测试761银杏叶提取物抗氧化损伤poststress任何影响,我们无论是同时处理或暴露后24小时至40微米的银杏叶提取物761蠕虫。胡桃醌诱导hsp-16-2/GFP表达。图3A表明,银杏叶提取物抑制热休克蛋白761- 16- 2,随之而来的胡桃醌治疗引起的66(对照表达,GFP的平均像素密度,银杏叶提取物240对比761,绿色荧光蛋白平均像素密度80,n = 2时,磷0.05,共30蠕虫),和HSP- 16- 2治疗引起了50(对照,表达绿色荧光蛋白平均密度240像素对比,银杏叶提取物761,绿色荧光蛋白平均密度120像素,当n = 2,磷0.05,共35个蠕虫)。这些结果表明:银杏叶提取物可能是761胡桃醌功能产生损害的下级表现,因为它不仅防止应激诱导的热休克蛋白- 16 -2基因的表达,但它也抑制基因表达的损害。如果胡桃醌诱导的热休克蛋白- 16- 2表达抑制银杏叶提取物761,是因为它的抗氧化的动作,然后其他抗氧化剂应该表现出相同的效果。为了进一步参与761银杏叶提取物抗氧化性能,在热休克蛋白- 16- 2表达的变化,我们预处理的L-抗坏血酸(维生素C,100微克/毫升)或已知的抗氧化剂的蠕虫。银杏叶提取物761(FLV的,100微克/毫升)黄酮类分数面前暴露于40微米胡桃醌。图3B表明,胡桃醌诱导的热休克蛋白- 16- 2表达无明显抑制,无论是L -抗坏血酸或黄酮类组分,即使有较高浓度的类黄酮,比整个提取物(注意目前的热休克蛋白的维生素衰减- 16 -2表达增多,但仍然比银杏叶提取物761看到)少。银杏叶提取物761减少有毒线虫细胞内过氧化氢含量,氧自由基被假定为一个老化的原因和一些退行性疾病(26,27)。深厚的热休克蛋白- 16 -2胡桃醌表达(图1C)诱导建议,氧化压力感应触发sHSP诱导表达。最近,我们能够衡量线虫过氧化氢活性氧水平有关,我们观察到,年龄依赖性增加在过氧化氢和过氧化氢含量在转基因线虫模型表达水平提高A肽(28)。为了监测与治疗,转基因三线虫CL2070的ROS水平银杏叶提取物761,我们进行了DCF的达荧光检测。虽然我们无法检测到ROS的增加在这些蠕虫胡桃醌诱导,我们一贯观察(图4),在CL2070线虫与银杏叶提取物治疗761,基底细胞内ROS水平明显减弱24。在CL2070蠕虫处理与L-抗坏血酸下,H2O ROS水平是下降的31。随着银杏叶提取物761黄酮30(100对比的FLV控制70)。再加上能力,银杏叶提取物761和有名的抗氧化剂抑制热休克蛋白- 16 -2表达,它表明,其他银杏叶提取物761功能促进热休克蛋白- 16 -2表达的抑制。讨论:本研究试图划定761银杏叶提取物的抗应激机制,通过转基因线虫应变CL2070,以及适合的特定监管模式,基因在体内和审查应激反应和老化(29)。我们的研究结果表明,该基因表达hsp-16-2/GFP记者热和氧化应激诱导显着抑制CL2070线虫(图1)。银杏叶提取物761本相关的影响。随着银杏叶提取物能增加761机体的抵抗力对热和氧化压力(图2),并减轻整个机体过氧化氢有关的活性氧水平(图4)。我们把一个迹象解释为,转基因表达的抑制hsp-16-2/GFP记录。银杏叶提取物761细胞压力下降外源压力引起的,导致诱导转录基因记录下降。银杏叶提取物761,抑制热休克蛋白- 16 -2表达(图3)表明,提取物不仅是清理运作的氧化,防止自由基的破坏自由基的传播,而且还作为维修或增强转过来的破坏大分子。我们建议,热休克蛋白- 16 -2表达诱导治疗后可以与压力结果从细胞内ROS的增加,或由(图5)受损蛋白质高的水平。这是不太可能直接诱导的氧化应激热休克蛋白- 16-2的表达。由此产生的损坏蛋白质可实际的信号,这或许可以解释热休克蛋白- 16 -2表达抑制。银杏叶提取物761之后的显现的胡桃醌(图3b),也就是761银杏叶提取物抗氧化活性降低胡桃醌氧化蛋白暴露。胡桃醌的抑制引起的热休克蛋白- 16- 2由银杏叶提取物761表达比这更深刻的热休克诱导的热休克蛋白- 16 -2表达(图1B和1C),表明了强烈的提取物抗氧化作用。这761银杏叶提取物的影响,显然不是因为影响到绿色荧光蛋白报告基因的表达本身,因为线虫转基因品系(CL1234)表达GFP组成并没有显示出差异在绿色荧光蛋白的表达与银杏叶提取物治疗后761(图1C)。此外,蠕虫与治疗银杏叶提取物胡桃醌暴露前761,明显高于健康胡桃醌治疗的动物。图2B表明了胡桃醌诱导的热休克蛋白- 16- 2表达抑制不是由于银杏叶提取物761,无法产生绿色荧光蛋白。对热休克蛋白- 16 -2银杏叶提取物761表达的变化是有益的,这可能是最重要的。如果热休克蛋白- 16 -2具有抵抗压力,银杏叶提取物的保护功能可能761防范有害导致热休克蛋白- 16 -2表达需求减少的过程。银杏叶提取物761的能力导致了提高成活率的食细菌线虫的诱导范围广(图2,参22)在不同的刺激暗示出一般的水平和早期干预。银杏叶提取物761被假设作为一种生物反应调节剂,其功能或许帮助热休克蛋白- 16- 2。在一个A的分泌转基因神经母细胞瘤细胞株,我们已经表明,银杏叶提取物抑制A的聚集和761A细胞凋亡。我们可以推测,银杏叶提取物的存在降低了761的自由基,导致了损坏的蛋白质减少,随之减少热休克蛋白表达的要求。这一假设进行了报道,最近加强了银杏叶提取物761调控热休克蛋白70的表达在几个模型系统(37-39)。结果描述不正视761银杏叶提取物和HSP- 16- 2的功能互动,但它可能是银杏叶提取物761功能外加的压力源。我们的观察是,银杏叶提取物能够抑制761后24 h的热休克蛋白- 16 -2表达胡桃醌曝光(图3b)。在哺乳动物细胞中,组成型表达磷酸化sHSPs是一种应激反应的第一阶段,而升高的sHSP表达,一次,当蛋白磷酸化是已经下调,包括第二阶段(31)。 MAP激酶被确定磷酸化在压力条件sHSPs(31岁,40-42)。银杏叶提取物761可从而影响到上游通过sHSP表达事件的MAP激酶介导的抑制信号通路。随后,提取物可能会限制应激性损伤干扰与降解途径,从而节约或增强正常的细胞神经元保护机制。银杏叶提取物潜在的761多价活动给予银杏,通过提供更有效的提取比传统的单组分的抗氧化剂更好的细胞保护。综合上述二者,这项研究的结果表明,银杏叶提取物761调节表达式,即时压力反应基因热休克蛋白- 16- 2在外源应力刺激下,这种作用超越其作为一个氧化清理已知的功能。我们的研究结果表明,由此产生的氧化应激和氧化损伤可以成功地抵消了银杏叶提取物银杏叶提取物761,可能通过调节内源性抗应激机制。更好地利用银杏叶提取物的神经保护机制EGb 761将是重要的有助于基本了解相关应激反应的过程和成效。
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