荧光法测定药片中维生素B2含量总论ppt课件
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荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量,1,荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量,实验目的,学习荧光分光光度法测定药片中维生素B2的分析原理。 掌握荧光分光光度计的操作技术和测定药片中维生素B2 的方法。 掌握Origin绘图软件的使用方法,2,实验原理,常温下,处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子,激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级,再以辐射跃迁的形式回到基态,发出比吸收光波长长的光而产生荧光。,3,实验原理,在稀溶液中,荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系: 当实验条件一定时,荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系: 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。,4,a. 与紫外-可见分光度法比较,荧光分析法具有更高的灵敏度。 b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱,又能依据吸收光谱来鉴定物质。 c. 所需试样量少、操作方法简便。,5,激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处,处于激发态的分子最多,荧光强度最大。,激发光谱,6,发射光谱:固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。 固定发射光波长进行激发光波长扫描,找出最大激发光波长,然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描,找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。,发射光谱,7,常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成,如下图所示:,8,荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点: a.荧光分析仪器采用垂直测量方式,以消除透射光的影响; b.荧光分析仪器有两个单色器,能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。,9,a.光源:在荧光计中常用卤钨灯作光源;荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。 b.单色器:荧光计的单色器是滤光片,只能用于定量分析;荧光分光光度计采用两个光栅单色器,可获得激发光谱和荧光光谱。 c.检测器:荧光计采用光电管作检测器;荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器。,仪器部件,10,维生素B2(又叫核黄素,VB2)是橘黄色无臭的针状结晶,其结构式为: 维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂,在中性或酸性溶液中稳定,光照易分解,对热稳定。,11,维生素B2溶液在430480 nm蓝光的照射下,发出绿色荧光,其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH=67时最强,在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素,光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多,故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内,且在避光条件下进行。,12,光黄素,13,实验预习,预习荧光分光光度法测定维生素B2的分析原理。 了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素B2 的方法。,14,F-4500型荧光光度计(日本日立公司) 10mL具赛试管10只,移液枪1只, 100 mL容量瓶2只 510-5gmL-1 VB2标准溶液(置阴暗处保存),冰乙酸(AR), 药用VB2试样(510-4gmL-1 ),仪器与试剂,15,1.打开计算机,先接通电源开关(POWER),5秒钟后再按下Xe LAMP按钮,再接通主开关(MAIN),此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下,然后打开操作软件。 2. 仪器初始化完毕后,在工作界面上选择测量项目,设置适当的仪器参数:激发波长,发射波长。 3. 样品测定。 4. 关机顺序:逆开机顺序实施操作。,基本操作,16,1. 标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定: 在10个干净的10 mL具赛试管中,分别吸取25、50、75,100、125、150、175、200uL VB2标准溶液,用石英亚沸水稀释至刻度,摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。,实验步骤,17,2. 未知试样的测定: 在两支10 mL具赛试管中,分别移取100 uL试样, 用石英亚沸水稀释至刻度,摇匀。用测定标准系列时相同的条件,测量其荧光强度。,实验步骤,18,1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。 2. 根据待测液的平均荧光强度,从标准工作曲线上求得其浓度,计算出试样中VB2含量。,数据处理,19,1. 解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。 2. 维生素B2在pH67时荧光最强,本实验为何在酸性溶液中测定?,注意事项和问题,20,1、 波长扫描(Wavelength Scan) 对样品进行激发波长或发射波长的扫描。 点击快捷栏“Method”,显示出“Analysis Method”的五个命令,分别为 General(常规)、Instrument(仪器条件)、Monitor(模拟监测)、processing(处理方法)、Report(报告格式),输入相应数据。,附录:仪器操作软件有关说明,21,1.1 General Measurement-选择Wavelength 1.2 Instrument Scan mode-输入扫描方式 Data mode-输入数据采集方式 EM WL-输入发射波长 EX Start WL-输入激发起始波长 EX End WL-输入激发终止波长 EX WL-输入激发波长 EM Start WL-输入发射起始波长 EM End WL-输入发射终止波长,附录:仪器操作软件有关说明,22,Scan speed-扫描速度选择 Delay-延迟时间 EX Slit-激发单元狭缝 EM Slit-发射单元狭缝 PMT Voltage-光电管负高压 Response-响应速度 Corrected spectra-光谱校正 Shutter control-光闸控制 Replicates-重复次数 Cycle time-循环周期,附录:仪器操作软件有关说明,23,1.3 Monitor Y-Axis Max-纵轴标尺上限值 Y-Axis Min-纵轴标尺下限值 2、时间扫描(Time Scan) 此扫描方式是EX,EM的波长均固定,仅观察样品随时间的变化。模拟画面的横坐标为时间单位,进入方法与波长扫描相同。 2 .1 General Measurement-选择Time Scan 2.2 Instrument Data mode-数据采集方式 EX WL-设定激发波长 EM WL-设定发射波长 Time unit-时间单位 Scan time-扫描周期,附录:仪器操作软件有关说明,24,2.3 其它与波长扫描相同,从略。 3、光度法(Photometry) 也称工作曲线法,是定量测量方法。有六个子命令,分别为General、Quantitation、Instrument、Standards、Monitor、Report,输入相应测量条件后进行测量。 3.1 General Measurement-选择Photometry,附录:仪器操作软件有关说明,25,3.2 Quantitation Quantitation type-选测量类型 Calibration type-校正曲线类型 3.3 Instrument 3.4 standards 4、三维扫描 (3-D SCAN) 当某个样品不知最佳激发波长和最佳发射波长时,利用该功能,可自动快速地给出最佳条件。 4.1 General-选择3-D Scan方式。 4.2 其它子命令选择方式同前。,附录:仪器操作软件有关说明,26,- 配套讲稿:
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