外显子组测序信息分析学习教案

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1、外显子组测序信息外显子组测序信息(xnx)分析分析第一页，共32页。 一一外显子组测外显子组测序技术简介序技术简介二二外显子组测外显子组测序流程序流程三三外显子组测外显子组测序信息分析序信息分析内容内容四外显子组测外显子组测序的应用方序的应用方案案第1页/共32页第二页，共32页。一、外显子组测序技术一、外显子组测序技术(jsh)(jsh)简介简介 外显子组序列仅占全基因组序列的1%左右，与人类85%致病基因突变相关。与全基因组测序相比，外显子组测序不仅费用较低，而且(r qi)测序覆盖度更深，数据准确性更高。 外显子测序是指利用序列捕获(bhu)技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后，再

2、进行高通量测序的基因组分析方法。第2页/共32页第三页，共32页。基因组DNA的随机打断DNA片段的末端修复和接头的连接PCR扩增文库DNA液相探针杂交捕获目的片段PCR扩增捕获的DNA片段测序文库的检测HiSeq 2500测序生物信息分析第3页/共32页第四页，共32页。第4页/共32页第五页，共32页。主要信息分析内容主要信息分析内容(nirng)(nirng)归归类类3.1、数据过滤与评估、数据过滤与评估3.2、整体、整体(zhngt)质量评估质量评估3.3、SNP检测与注释检测与注释3.4、InDel检测与注释检测与注释3.5、高级分析、高级分析第5页/共32页第六页，共32页。3.1

3、、数据、数据(shj)过滤与评估过滤与评估第6页/共32页第七页，共32页。过滤接头。对含接头的reads去除接头序列。一条reads上N（未能确定出具体的碱基类型(lixng)）的比例大于5%，则过滤掉该reads。过滤低质量reads，过滤掉Q3085% reads。3.1.1、原始数据过滤、原始数据过滤(gul)第7页/共32页第八页，共32页。3.1.2、测序数据、测序数据(shj)统计与评估统计与评估测序质量(zhling)值分布图碱基含量(hnling)分布图第8页/共32页第九页，共32页。3.2、整体测序质量、整体测序质量(zhling)评估评估第9页/共32页第十页，共32页

4、。3.2.1、测序深度、测序深度(shnd)统计统计注：横坐标代表测序深度，纵坐标代表目标(mbio)区域上对应深度的碱基数占总碱基数的百分比。目标(mbio)区域的单碱基分布近似服从泊松分布。第10页/共32页第十一页，共32页。3.2.2、外显子捕获、外显子捕获(bhu)统计统计Target region statX1X2X3X4Length_of_target_region(Mb)1118.70118.70118.70118.70Reads_mapping_ref(single reads)2182.95168.4897.7696.16Mapping_datasize(Mb)313721

5、1263697769616Effective_sequences_on_target(Mb)592.0590.8666.8464.37Average_sequencing_depth_on_target747.3146.7543.0541.45Mismatch_rate_in_target_region8Mismatch_rate_in_all_effective_sequence9Base_covered_on_target(Mb)106904681566846437Coverage_of_target_region11Fraction_of_target_covered_with_at_l

6、east_20 x12Fraction_of_target_covered_with_at_least_10 x13Fraction_of_target_covered_with_at_least_4x14 当比对到参考(cnko)基因组目标区域的数据量在60%之上，认为外显子捕获效率合格。第11页/共32页第十二页，共32页。3.2.3、染色体覆盖、染色体覆盖(fgi)深度分布深度分布注：横坐标为染色体长度，纵坐标为覆盖(fgi)深度取对数。第12页/共32页第十三页，共32页。3.3、 SNP检测检测(jin c)及注释及注释第13页/共32页第十四页，共32页。3.3.1、 SNP检测检

7、测(jin c)SNP的检测主要(zhyo)使用GATK软件工具包实现。BMK IDSNP NumberTransition NumberTransversion NumberTi/Tv RatioHeterozygosity NumberHomozygosity NumberX19852546691723160822.11207400777854X28425165733992691172.13167179675337X3263326178220851062.0926436236890X4289954196145938092.0930446259508Total1556901第14页/共32页

8、第十五页，共32页。TypeR01R02R03R04INTERGENIC449352380794113110125682INTRAGENIC34252896892 975INTRON401739343966111218121865UPSTREAM244522135061056521DOWNSTREAM95551835652773230377UTR_3_PRIME395407112 124UTR_5_PRIME21651891776 850SPLICE_SITE_ACCEPTOR31361414SPLICE_SITE_DONOR61541921CDSNON_SYNONYMOUS_CODING19

9、711899882 925NON_SYNONYMOUS_START2100START_GAINED37834693100START_LOST8632STOP_GAINED2624108STOP_LOST5310SYNONYMOUS_CODING17721732923 940SYNONYMOUS_STOP1100Other1068932183.3.2、 SNP注释注释(zhsh)第15页/共32页第十六页，共32页。3.3.3、突变、突变(tbin)特征特征突变(tbin)频谱图注：横坐标为不同(b tn)类型的突变，纵坐标为不同(b tn)类型突变对应的频率。第16页/共32页第十七页，共32

10、页。3.3.3、突变、突变(tbin)特征特征突变(tbin)位点上下文碱基偏好性注：横坐标为突变位点上下文的碱基位置，0为SNP突变位点，负数代表突变位点前的碱基，正数代表突变位点后的碱基，纵坐标为不同碱基对应的比例。从图上可以看出(kn ch)，不同类型的SNP突变上下文具有不同的碱基偏好性。第17页/共32页第十八页，共32页。3.4、 InDel检测检测(jin c)及注释及注释第18页/共32页第十九页，共32页。3.4.1、 InDel检测检测(jin c)RegionR01R02R03R04TotalInsertion5168944234152331657392775Deleti

11、on57643510611670517840107838Heterozygosity89744788482858630639-Homozygosity195881644733523774-Total109332952953193834413200613第19页/共32页第二十页，共32页。TypeR01R02R03R04INTERGENIC48070416011357914755INTRAGENIC410337123117INTRON45413396821370114581UPSTREAM30602706759851DOWNSTREAM116331026535533851UTR_3_PRIME

12、333174UTR_5_PRIME26524687106SPLICE_SITE_ACCEPTOR152364SPLICE_SITE_DONOR6833CDSCODON_DELETION151635CODON_INSERTION12502EXON_DELETED2672427393FRAME_SHIFT94922730CODON_DELETION151635CODON_INSERTION12502Other19241263.4.1、 InDel注释注释(zhsh)第20页/共32页第二十一页，共32页。3.5、高级、高级(goj)分析分析第21页/共32页第二十二页，共32页。3.5.1 、基因

13、、基因(jyn)融合融合注：最外圈表示人基因组及基因组上基因分布(fnb)情况；文字代表发生基因融合的基因ID；红色线条代表染色体间基因融合；绿色线条代表染色体内基因融合。第22页/共32页第二十三页，共32页。3.5.2、氨基酸替换、氨基酸替换(t hun)预测预测ChrIDPosCodonsSubstitutionSNP TypePredictionGenechr1881627CTG-tTGL615LSynonymousTOLERATEDENSG00000188976chr111884555GAG-GgGE198GNonsynonymousTOLERATEDENSG00000011021c

14、hr112776344ATG-tTGM1LNonsynonymousTOLERATEDENSG00000188984chr112919111GAA-aAAE83KNonsynonymousDAMAGINGENSG00000120952chr116356501GCC-aCCA447TNonsynonymousTOLERATEDENSG00000186510注： Codons：密码子的变化情况；Substitution：氨基酸的替换信息；SNP Type：SNP的类型；Prediction：预测结果(ji gu)(damaging/tolerated)，TOLERATED表示这个突变是可以容忍的，

15、即对蛋白质功能没有影响或影响很小，DAMAGING表示突变是有害的，即对蛋白质功能有较大影响； Gene ：发生替换所在的基因。第23页/共32页第二十四页，共32页。3.5.3 、样品间差异表达、样品间差异表达(biod)基因基因COG分类统计分类统计COG数据库是基于细菌、藻类、真核生物的系统进化关系构建得到的，利用COG数据库可以对基因产物进行直系同源(tn yun)分类。注：横坐标为COG各分类内容，纵坐标为基因数目。在不同的功能类中，基因所占比例多少反映对应时期和环境下代谢或者生理偏向等内容，可以结合研究对象在各个功能类的分布作出科学的解释。第24页/共32页第二十五页，共32页。差

16、异基因GO注释(zhsh)聚类图 topGO有向无环图3.5.4 、样品间差异表达基因、样品间差异表达基因(jyn)GO分类统计分类统计第25页/共32页第二十六页，共32页。差异基因KEGG通路(tngl)示意图3.5.5 、样品间差异表达、样品间差异表达(biod)基因基因KEGG注释注释第26页/共32页第二十七页，共32页。四、外显子组测序的应用四、外显子组测序的应用(yngyng)(yngyng)思路思路第27页/共32页第二十八页，共32页。全外显子测序全外显子测序Whole-exome sequencing分析及预测候选基因突变致病性分析及预测候选基因突变致病性Analysis

17、and predict candidate causative variats生物学功能研究生物学功能研究Functional research在多个家系或散发病例中进行突变筛查研究在多个家系或散发病例中进行突变筛查研究Mutation screening 遴选和采集遴选和采集 病例和家系病例和家系 Samples collection第28页/共32页第二十九页，共32页。4.2 WES肿瘤肿瘤(zhngli)研究上的思路研究上的思路样本选取全基因组测序及分析WES样本选取外显子组测序及分析基因突变功能验证样本选取外显子组测序及分析转录组测序基因突变功能验证第29页/共32页第三十页，共32页。4.3 WES在复杂在复杂(fz)疾病上的研究的思路疾病上的研究的思路样本选取（遗传性较高）外显子组测序找到与疾病高度关联的低频突变在大样本里进行大规模验证第30页/共32页第三十一页，共32页。第31页/共32页第三十二页，共32页。