第二章酶与细胞的固定化

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1、第二章 酶与细胞的固定化第一节 概述溶性酶的缺点： 1 大部分酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）2 不能回收，无法自动化、连续化生产 3 专一性高1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。什么是固定化酶？固定化酶的优点

2、：(1) 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。(2) 可在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。(3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。(4) 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。(5) 酶使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。固定化酶的缺点： (1) 酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。 (2) 比较适应水溶性底物和小分子底物。 (3) 与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后才能固定化。 第二节 固定化酶的制备一 、一般方法及特点关键在于选

3、择适当固定化方法和必要的载体及稳定性研究、改进。 1、四大类方法：吸附法；包埋法；结合法；交联法2、选择方法依据： （1）酶的性质（2）载体的性质（3）制备方法的选择在具体选择时，一般应遵循以下几个原则。 （1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。（2）酶与载体必须有一定的结合程度。（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。（4）固定化酶应有最小的空间位阻。（5）固定化酶应有最大的稳定性。（6）固定化酶的成本适中。3、固定化后酶的考察项目：（1）测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率（2）考察固定化酶稳定性（3）考察固定化酶最适反应条件二、酶的固定化方法（一） 吸附法吸附法（a

4、dsorption）是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。 （1）物理吸附法 物理吸附法(physical adsorption)是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。是制备固定化酶最早采用的方法，如-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此法进行固定化。常用载体：n 无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。一般吸附量1mg蛋白/克吸附剂n 有机载体：淀粉、白蛋白等。一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂n 研究热点：大孔型合

5、成树脂、陶瓷物理吸附法制备固定化酶，操作简单、价廉、条件温和，载体可反复使用，酶与载体结合后，活性部位及空间构象变化不大，故所制得的固定化酶活力较高。 靠物理吸附作用，酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落，所以使用受到限制。常与交联法结合使用。（2）离子吸附法 离子吸附法(ion adsorption)是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。 此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0.5mol

6、/LNa0H和水洗涤加入pH7.0-7.5的米曲霉3042粗酶液(水解乙酰-DL-Ala活力为25umol/mlh) 充分混合，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液(1g湿重载体加60ml酶液) 固定化酶活力回收50-60用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4备用。 水解乙酰-DL-A1a活力为600-800umol/gh湿固定化酶。n 离子吸附法所使用的载体是某些离子交换剂。 阴离子交换剂有DEAE-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等； 阳离子交换剂有羧甲基纤维素、纤维素柠檬酸盐等。 其吸附容量一般大于物理吸附剂。n 离子吸附法具有操作简便、条件温

7、和、酶活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。 n 吸附力弱，不适宜的pH，高盐浓度，高底物浓度，高温等都能把吸附的酶解吸下来。提高吸附容量和吸附力的途径： 1 选择最佳条件操作（如温度、pH）。 2 选吸附量大的载体，控制酶和载体量。 3 采用高酶量吸附。 4 开发新载体。 5 对酶进行修饰后再进行交换吸附。 如烃基-琼脂糖衍生物吸附酸性pH的酶(脲酶)，用亲和吸附剂 ConA-葡聚糖能专一吸附糖蛋白。对酶进行修饰以后再与载体结合，胰蛋白酶+丙烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚体共价偶联再加DEAE-纤维素结合。 结果：结合力增大(吸附量也大)，也相当稳定，使用寿命长，有时可以连续使用

8、3个星期。多孔物质包络法：利用棉布、尼龙布、金属死网、海绵、塑料等固定化放线菌、真菌组成盘状生物反应器，进行连续生产有机酸、糖化酶、四环素。这些材料有足够大，但空隙又不十分大的空隙，能够使细胞进入空隙，通常为细胞直径的见倍大。超过滤法：利用超过滤膜将细胞固定化。底物和产物可以自由进出超过滤膜，而膜内的细胞却出不来。制备成膜反应器和生物传感器。但是需要防止细胞生长导致浓度过高而使超过滤膜破裂。吸附方法： 1、静态吸附，自然吸附、解吸、再吸附的固定化方法。效率低，时间比较长，而且不完全。 2、电沉积，在载体附近加电极，酶移向载体表面的固定化方法。需要酶在电场中不破坏，保持原来酶性能。 3、动力法固

9、定化，酶与载体混合后搅拌等条件下进行固定化，注意速度，不破坏酶和载体。 4、反应器固定化，载体装入反应器，再循环加入酶溶液达到固定化。但是吸附少，不适合的条件（pH、盐等）容易解吸。注意操作条件。最主要，更加有效的还是开发新的吸附剂。影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化，从而影响酶吸附。2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上吸附速度比小分子慢得多。 6. 载体：对于非多孔性载体，颗粒越小吸附力越

10、强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。吸附法的优点： 操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。吸附法的缺点： 酶和载体的结合力不强，易脱落，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。（二） 包埋法（entrapping method） 将聚合物单体和酶溶液混合后，再用聚合促进剂(包括交联剂)的作用而聚合，酶就包埋在载体中达到固定化。 酶本身不参与反应，所以较安全。但在聚合过程中有自由基产生及聚合时放出热，酶与试剂间可能发生化学反应，这些因素可能会使酶失效，或者降低酶活性。操作时注意条件的控制。（1）凝胶包埋法

11、 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ： 先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。 聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。聚丙烯酰胺凝胶包埋法： 1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加750mg丙烯酰胺(单体)和40mgN，N-甲叉双丙烯

12、酰胺 (交联剂)的3ml溶液加0.5ml 15的二甲氨基丙腈(加速剂)，加入1过硫酸钾 (引发剂)混合，于25保温10min，含酶凝胶将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒于低温储存或冷冻干燥为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。卡拉胶包埋法 卡拉胶是由角叉菜(鹿角菜)中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。 具体方法：将100g酶在37-50溶于水中，又将1.7g卡拉胶在40-60溶于34ml生理盐水中，二者混合后冷却到10，所成凝胶浸在0.3mol/L KCl 溶液中硬化，作成适当大小的颗粒，即为固定化酶。（2）微胶

13、囊包埋法 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。 用微胶囊包埋法制得的微囊型固定化酶的直径通常为几微米到数百微米，胶囊孔径为几埃至数百埃，适合于小分子为底物和产物的酶的固定化。如脲酶、天冬酰胺酶(治疗白血病) 、尿酸酶、过氧化氢酶等。 方法有界面聚合法、界面沉淀法等。微囊制备方法： 界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。如含有高浓度血红蛋白的酶溶液在与水

14、不互溶、沸点比水低的有机相中乳化，加入油溶性表面活性剂，形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物在搅拌下加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油-水界面上沉淀形成膜，最后移于水相，从而制成固定化酶。作为高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。含酶的10血红蛋白水溶液与己甲叉二胺的水溶液混合立即在1Span85的氯仿-环已烷中分散乳化加入癸二酰氯(有机相)后，便在油-水界面发生聚合反应弃除上清液，加入Tween-20去乳化洗除有机溶剂，除去未聚合单体后转入水相制得固定化酶界面聚合法是将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。此法曾用

15、来制备Asn酶、脲酶等。制备方法一般是：将酶水溶液与亲水单体(如乙二醇)用一种水不溶混的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同一有机溶剂疏水单体(如多异氰酸)溶液在搅拌下加入到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有机溶剂之间的界面发生聚合化，这样水相中酶便包埋在聚合体(聚脲)膜内。 尼龙膜界面聚合包埋(酶+己二胺水溶液）+庚二酰氯有机溶剂 混合乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯)在水相、有机相交界处聚合 形成包埋酶的尼龙膜珠粒 Tween 20破乳化，得到微囊包埋酶（三）共价键结合法通过载体的功能基团与酶侧链基团上非必需基团共价结合，制备成的固体酶的方法。 优点：应用最广，固定化结合牢、稳定而酶不丢失，可以

16、连续使用。共价键结合法 可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体1、载体要求： 亲水载体优于疏水载体（酶蛋白结合量，固定化后酶活性，稳定性方面都比较好），而且亲水基存在可以减少疏水基的有害影响。载体特点： 1 结构疏松 2 表面积大 3 机械强度大 4 带有在温和条件下可与酶侧链基团共价偶联的功能基团 5 没有或很少有非专一性吸附 6 载体来源容易，并能反复使用。一般与亲和层析所需载体的要求、标准一致 如: 天然纤维素或衍生物；葡聚糖凝胶；琼脂糖 亲和性好，机械性能差 合成的：聚

17、丙烯酰胺；多聚氨基酸；聚苯乙烯，尼龙 机械性能好，但有疏水结构2、偶联方法： 偶联成功与否取决于： 载体：功能基团，芳香氨基，羧基，羧甲基等 酶分子：侧链非必需基团（游离的-氨基，lys-NH2 ，Arg-胍基，C-COOH， Asp-羧基，Glu-羧基，酚羧基，巯基，咪唑基)载体、酶分子上的基团不会直接反应，其功能基团要活化。 在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶失去活性。3、载体活化的方法重氮法；异硫氰酸反应；溴化氰-亚氨碳酸基反应；芳香烃化反应；叠氮法；酰氯酰化反应；酸酐反应；缩合反应；巯基-二硫基交换反应；金属偶联反应重氮法

18、 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。 常用的载体有多糖类的芳香族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。芳香氨基载体方法特点： 载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，再在温和条件下和酶分子上相应基团直接偶联。 芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入蛋白质分子中Tyr等集中的疏水区并偶联化而导致失效。 a 当载体为电中性或疏水性时，这种倾向性越大。 b 当载体用亲水极性物质时，这种疏水区的特性就大大减小了。 如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶固定化，偶联到重氮化的电中性载体如对氨基苄基纤维素时，产生固定化酶无活性。偶联到重氮化的苯胺-多孔玻璃

19、时，得到固化酶都具很高酶活性。 异硫氰酸反应 含芳香氨基的载体先用硫芥子（或者光气）处理成异硫氰酸盐的衍生物，这种产物在温和条件下，优先与酶分子的氨基反应，在中性pH下优先与-氨基反应，可达到选择性偶联的目的。 溴化氰-亚氨碳酸基反应 带羟基的载体纤维素、葡聚糖、琼脂糖等是最常用的载体。在碱性条件下，载体的OH基和溴化氰反应，生成活泼的亚氨碳酸基，在弱碱中直接和酶的氨基进行共价偶联。 芳香烃化反应 含羟基的载体在碱性条件下，和三氯三嗪等反应，引入卤素基后直接与酶的氨基、酚羟基或者巯基等偶联。叠氮法载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都

20、可用此法活化。如CM-sephadex（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶，其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法。酰氯酰化反应含羧基载体（如羧酸树脂）通过氯化亚砜处理成活泼的酰氯衍生物，再与酶偶联。酸酐反应 乙烯等和顺丁烯二酸酐的共聚物，通过其活泼酸酐基直接与酶氨基偶联。生成的固定化酶一般有比较高的活力。 缩合反应利用羰二亚胺的活化作用，使氨基、羧基直接偶联，缩合为肽键的反应。载体成为活泼的酰基异胍衍生物。带羧基载体与环二已基二亚胺（DCCI）存在时，用N- 羟基琥珀酰亚胺活化，在温和条件下和酶的氨基反应，缩合反应控制pH6，反应限于氨基。巯基-二硫基交换反

21、应 巯基或二硫基载体通过巯基-二硫基交换反应和酶分子上的非必需巯基偶联，当功能基团为巯基，先用2，2-吡啶二硫化物处理，变成二硫基，生成的中间产物在酸性条件下与酶的巯基发生交换达到偶联。化合物在酸性条件下发生交换。在大量巯基化合物存在条件下逆转为载体和巯基酶。金属偶联反应 一些过渡态金属能使纤维素、尼龙、滤纸、酵母细胞等直接转化成固定化的载体。 方法：将上面这些材料浸入金属溶液中，过滤、洗涤后加酶而成。常用金属有钛、锡、锌、铁等氯化物，其机制目前还不清楚。偶联反应中的保护措施： 1、采用适宜的固定化材料和方法。如重氮化注意载体的亲水性和疏水性。 2、严格控制反应条件，提高反应专一性。如与-氨基

22、反应，保护其他氨基。 3、用抑制剂或者底物保护酶活性中心和必需基团避免影响酶的活性构型和相应基团。酶的偶联量: 单位载体上偶联酶的总量与“相对酶活力”之间的平衡。相对酶活力： 指固定化酶和相等蛋白量的原酶的活力比。 由于固定化时，受到载体、方法、条件、酶反应系统的影响，即使以上因素一定，还会受到酶偶联量的影响。 1、只有达到一定的偶联量，酶活性达到最高。 2、超过一定的偶联量，酶过多集中于载体的局部，造成空间位阻效应，部分酶无法表现活性。随酶偶联量上升酶活性反而下降。 寻找二者平衡点关系，才能使酶活性达到最高。 共价偶联法中的几个影响因素（1） 载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强度

23、和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。（2）偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。（3）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。（4）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。共价偶联法的优点、缺点（1）共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用。（2）共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。（四）交联法交联法（cross-linking）是使用双功能或多功能试剂使酶分子

24、之间相互交联呈网状结构的固定化方法。由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基和咪唑基参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。n 交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。n 能起交联作用的试剂很多，但目前常用的交联试剂是戊二醛和双耦联苯胺-2,2-二磺酸。交联法常与吸附法结合使用，或者与包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合于载体上。 戊二醛属于同型，还有异型：甲苯-2-异氰-4-异硫氰；交联可以在分子内，也可以在酶分子之间。 这是与酶量有关的一个问题。酶浓度低时，交联发生在分子

25、内，酶浓度高时，交联发生在分子间， 固定化后，酶与载体成为不溶态的颗粒。 缺点： 固定化后，往往颗粒小，机械性能差。酶直接交联法 在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。酶辅助蛋白交联当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。 这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。吸附交联法 先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。交联包埋法把酶液和双功能

26、试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。实验方法上的要点： 1)交联条件激烈，需要保护性措施。 2)交联剂的链长和功能基团的选择问题。 只要选择适当，有利于建立某些分子内交联，亚基固定和四级结构维持，增加酶的稳定性。但链过长，疏水性上升，疏水性升高，对固定化酶有害。各类固定化方法的特点比较：比较项目结合法吸附法交联法包埋法共价键结合物理吸附离子吸附制备难易难易易 较难较难固定化程度强弱中等 强强活力回收率低较高高 中等高载体再生不可能可能可能 不可能不可能费用高低低 中等低底物专一性可变不变不变 可变不

27、变适用性较广酶源多广泛 较广小分子底物、药用酶第三节 固定化酶的性质及其影响因素一、影响固定化酶性质的因素1、酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。2、载体的影响3、固定化方法的影响 固定化对酶活性和酶反应体系的影响是十分复杂的，常因酶的种类、反应系统的组成，特别是固定的方法及载体而显著不同。为了简化，通常作两个假设： (1)酶在载体表面或多孔介质内的分布是完全均匀的。 (2)整个系统各方同性。 在上述条件下，固定化对反应体系的影响，可以概括为三种类型。构象改变和屏蔽效应 构象改变是指：酶在固定化的过程中，出于酶与载体相互作用使酶的活性中心或变构中心的构

28、象发生变化从而导致酶活性下降。这种效应难以定量描写也难以预测。通常出现在吸附法和共价键结合法。 立体屏蔽效应是：由于载体对酶的活性中心或变构中心造成空间障碍，因而底物或效应物与酶无法接触，从而影酶的活性。若在酶和载体间加入臂，可以得到改善。微环境的影响 微环境是紧邻固定化酶的环境区域。微环境的影响是由于载体的亲水与疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化效应，或者是酶对效应物作出反应的能力的一种效应，通常可以通过改变载体和介质的性质作出判断和调节。分配效应与扩散效应 分配效应是由于载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物或其他效应物在微观环境和宏观体系间发生不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，

29、从而影响了反应速度。作为一般规律是： (1)如果载体与底物带有相同电荷，则酶的Km值将因固定化而增大；如果带有相反电荷则相反。 (2)当载体带正电荷时，固定化之后，酶活性-pH曲线向酸性方向偏移；相反，阴离子载体将导致该曲线向碱性方向偏移。 (3)以上效应可通过提高介质离子强度而削弱或消除。(4)采用疏水载体时，如底物为极性物质，或电荷物质，则酶的Km值将因固定化而降低，其他效应物亦然。 扩散限制效应是指：底物或其他效应物的迁移和运转受到限制的一种效应。它分内扩散效应和外扩散效应两种。外扩散限制，是指上述物质从宏观体系穿过包围在固定化酶周围近乎停滞的液膜层到固定化酶表面所受到的限制。可以充分搅

30、拌或混合而减小或消除。内扩散限制，是指上述物质从固定化颗粒表面来到颗粒内部酶活性位点受到的一种限制。 一般规律： 1）其效应对反应速度的影响取决于这个效应本身的大小，也取决于它与酶固有速度的相对大小；酶反应速度原来小，扩散限制影响也小；酶反应速度原来大，扩散限制影响也大。2）外扩散可以通过搅拌与混合，减轻或者消除。二、固定化后酶性质的变化1、 固定化对酶活性的影响：多数情况下酶活性下降，反应速度下降 酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合； 当酶与载体结合时，它的高级结构发生了变化，其构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变； 酶被固定化后虽不失活，但酶与底物间的相互作

31、用受到空间位阻的影响。也有在个别情况下，酶经固定化后其活力升高，可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高。2、固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高 （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高 （3） 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低 （4）对分解酶的稳定性提高 （5） 对变性剂的耐受力升高 （6）对酸碱稳定性 ，多数高于游离酶，少数降低3、pH的变化 pH对酶活性的影响：（1） 改变酶的空间构象（2）影响酶的催化基团的解离（3）影响酶的结合基团的解离（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。固定化酶pH的变化1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动

32、 载体带正电荷，pH向酸性方向移动。2）产物性质对pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低。4、最适温度变化 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。5、底物特异性变化 作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化6、米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化由于分配效应：=Si微环境/S宏观环境 Km=Km/(表观米氏常数)（1） 载体与底物带相同电荷，SiS，Km 固定化酶降低了酶的亲和力。（2） 载体与底物电荷相反，静电作用，SiS，则1，KmKm三、评价固定化酶的指标：1、酶活定义（I

33、U)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位计量单位 2、酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位品质的体现 3、固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位或单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。4、操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）。5、6、 固定化酶活力 酶活力回收率= X100% 溶液酶活力7、相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力 固定化酶活力 相对酶活力= X100% 溶液酶总活

34、力残留酶活力四、固定化酶的活力测定方法介绍1. 振荡测定法：称取一定量的固定化酶 加入一定量的底物溶液，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应 取出一定量的反应液进行酶活力测定2. 酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中 让底物溶液以一定的流速流过酶柱 收集流出的反应液 测定其中产物的生成量或底物的消耗量3、连续测定法 利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。第四节 微生物、植物和动物细胞固定化 利用胞内酶制作固定化酶时，先要把细胞破碎，才能将里面的酶提取出来，这就增加了工序和成本，且提取的酶往往不够稳定。因此人们设想直接固定那些含有

35、所需胞内酶的细胞，并且就用这样的细胞来催化化学反应。固定化细胞的优点如下：(1) 省去了酶的分离手续。为多酶系统，无须辅因子再生。(2) 细胞生长快、而且多、反应快。(3) 可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。(4) 保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。固定化细胞缺点：(1) 必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。(2) 必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性副产物的形成。(3) 细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。 固定在载体上并在一定的空

36、间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。固定化细胞的制备应该具有以下特点：1. 需要控制固定化细胞的空隙度和大小。2. 选择的固定化材料容易和便宜。3. 方法简单容易，操作温和，少损伤细胞。4. 有一定的网状结构，在操作温度和pH下不破坏。5. 有良好的机械稳定性和化学稳定性，对细胞不反应。6. 底物、产物可以自由扩散。7. 固定化材料应该是惰性的。8. 单位体积内尽可能固定化更多细胞，如是固定活性细胞，更加是如此。在大生产中，尤其需要考虑1、5、6点固定化细胞的分类按细胞类型分为三类：微生物；动物；植物按生理状态分为

37、两大类：n 死细胞：完整细胞、细胞碎片、细胞器 适用于一种酶催化的反应n 活细胞：增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞 适用于多酶反应，特别是需要辅酶的反应细胞固定化方法：吸附法 主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。 常见载体的材料：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、多孔陶瓷、离子交换树脂、塑料包埋法 包埋法是细胞固定化最常用的方法，可以分为：微胶囊法：利用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊；凝胶包埋法：是在无菌条件下，将生物细胞和胶溶液混合在一起，然后再经过相应的造粒处理，形成直径为1-4mm的胶粒。常用的包埋剂为：聚

38、丙烯酰胺、琼脂、海藻酸、卡拉胶、醋酸纤维、明胶等。2.4%左右的卡拉胶 70 溶解， 再冷却到42, +10%左右的细菌菌体(预热到42）迅速混合均匀4 冰箱放置大约30min取出后切成33mm的小颗粒共价结合法 利用细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基）与活化的无机或有机载体反应，形成共价键将细胞固定。用该法制备的固定化细胞一般为死细胞。交联法n 利用双功能或多功能试剂与细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基）反应，从而使细胞固定。n 常用的交联剂包括：戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双重氮联苯胺。n 由于交联试剂的毒性，这一方法具有一定的局限性。包埋与交联法 小颗粒戊

39、二醛浓度0.75% 多乙烯多胺浓度1.25%，作用30min 作用10min 戊二醛浓度0.75%作用30min 包埋与交联固定化 包埋与渗透交联固定化直接固定化 利用热、冰冻等手段固定化（如加柠檬酸、凝剂等） 1、使细菌菌体内proteinase变性，保护所需酶 2、使菌体内酶固定住，防止损失 3、颗粒增大防止酶损失 如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是个胞内酶50-80，10分钟 有直接用霉菌孢子固定化，或者用双功能试剂将同源和异源的酶固定于菌体的细胞壁上。如把淀粉葡萄糖苷酶偶联于含葡萄糖异构酶的链霉菌上去。这样的菌体可以直接 “联合”加工淀粉成为果糖。固定化方法的比较n 吸附法：条件温和、

40、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。n 共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。n 交联法：可得到高细胞浓度。但机械强度低，无法再生，不适于实际应用。n 包埋法：细胞和载体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。 但这类方法只适用于小分子底物。第五节 固定化原生质体和辅酶一、原生质体固定化的方法 制备原生质体将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液包埋法固定化原生质体 关键：原生质体如何制备？二、原生质体的制备 将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中去细胞壁分离纯化得到原生质体三、酶解注意要点 1、酶解前要预处理：主要是为了使酶

41、渗透到细胞器中去。 采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分合成，可以使酶插入。一般加入：巯基乙醇，Triton-100，甘氨酸，青霉素2、酶系选择： 溶菌酶、蜗牛酶、葡聚糖酶纤维素、半纤维素、和果胶酶3、酶浓度选择（0.5%-1%）4、酶解温度和pH5、酶解作用时间四、稳定剂（高渗溶液）要求1 加入的化合物对细胞和原生质体无毒性2 不会影响水解酶的活性 3 对代谢产物无不良影响稳定剂加入操作注意点1一定pH （酶和菌体活性最高） 2一定的浓度（过高浓度原生质体易脱水皱缩）3种类：无机盐-对细菌 有机物糖和糖醇-酵母4易于渗入质膜、易于被原生质体和菌体分解的物质不宜作为稳定剂五、原生质

42、体的固定包埋法 一般采用凝胶包埋：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、光交联树脂辅酶固定化有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应(递氢、递电子或递某些化学基团的作用） 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生辅酶固定化的特点： 1、与酶蛋白有亲和性 2、酶蛋白需要辅酶才具有最大活性 3、辅酶本身有弱的酶活性，一旦与酶结合，活性大增辅酶固定化的方法： 一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。 策略：先在辅酶的一定部位进行

43、修饰-引入功能团和间隔臂（形成辅酶衍生物）- 再与水溶性高分子结合辅酶与酶蛋白的亲和性进行固定 Trpase（色氨酸酶）有四个亚基，四个活性中心，需要磷酸吡哆醛，但是结合弱，容易解离，用K离子促进结合。磷酸吡哆醛偶联于琼脂糖上-利用吡哆醛四位甲基与酶蛋白的-NH2结合，形成Schiff而固定化。 由于辅酶与酶蛋白的结合后，很弱，固定化后经常需要加些辅酶，以补充不足。 第六节 固定化酶（细胞）的应用1、 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化 葡萄糖异构酶葡萄糖 果糖 果葡糖浆固定化酶在工业生产中的应用n 聚丙烯酰

44、胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体，制得固定化延胡索酸酶；工业化生产L-苹果酸n 利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶n 固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类固定化原生质体的应用 固定后化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞中的碱性磷酸酶，全部分泌到发酵液中，提高产率36%，可连续使用37天。固定化酶(细胞）应用实例固定化酶和固定化细胞应用生产时间氨基酰基转移酶DL-氨基酸的旋光度解析1969葡萄糖异构酶将葡萄糖异构变为果糖1973青霉素酰胺酶生产6-APA1973天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸1973延胡索酸酶生产L-苹果酸1974-半乳糖苷酶水解乳糖1977L-天冬氨酸-

45、脱羧酶生产L-丙氨酸19822、固定化酶在医药治疗上的应用溶液酶的应用缺陷：酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白质酶水解破坏由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度转入体内发挥作用口服：最初主要限于消化酶类，近年来也有人尝试将酶以口服方式用于尿中毒等疾患的治疗。口服的优点是药物通过粘膜吸收后能迅速进行扩散，进入体内，通常不会引起免疫反应。注入：是最有实用价值的一种方式，溶液酶的弱点集中于此方式。固定化酶可很好的地解决这一问题，办法是将药物酶包埋于半透膜中，可容许小分子底物自由出入包埋膜，而药物酶和破坏它的蛋白水解酶以及

46、其他免疫因子等不会直接接触，因而可延长酶在体内的半寿期和避免免疫过敏反应。如果选择载体适宜，或者在载体上偶联适当成分，还可使药物酶比较集中的送到靶细胞。通过“体外循环”做成人工脏器 q 用于除去有害的毒性物质及有潜在毒害作用的代谢产物q 除去氨基酸，使需要这些物质的病变组织“饿死”；治疗时只需将患者的血液引出体外，通过由固定化酶等构成的“人工脏器”加以处理，然后再回流体内。制造人工肾 利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。固定化脲酶由酶与离子交换树脂一起制成微小胶囊，尿酶可分解尿素为NH3和CO2，NH3被树脂吸附，CO2可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以外的代谢

47、废物。 3、固定化酶在分析化学中应用固定化酶在生化分析和临床检验中的应用也是一个十分重要的领域，它的发展非常迅速，这不仅因为它们比较稳定，可反复使用，能实行自动化、连续化等，而且因为它们对抑制剂和活化剂比较不敏感，因此可用于较复杂体系的检测。 分析化验中应用的固定化酶大体分为两类： 酶传感器(酶电极) 固定化酶柱检测器，包括固定化酶柱和检测器酶电极n 特点：快速、方便、灵敏、精确n 范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等n 要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。4、固定化酶与环境保护环境监测；污染物处理 固定化生长菌体在三废处理上

48、的应用应用内容菌 体固定化方法毒 物废水处理脱氮作用Candida tropicalisPsendomonas Putida各种微生物混合培养Pseadomonas sp Micrococcus deritrificans聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋皂土和Mg2或聚氨基甲酸乙酯海绵活性炭吸附液膜酚苯废水亚硝酸、硝酸5、新能源开发中的应用n H2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生H2，但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌连续产氢，稳定性比天然细胞好。 n 将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶原膜包被，可用于水的光介产生氢气和氧气。6、固定化酶在基础理论研究中应用阐明酶反应机理；揭示酶原激活机理用固定化酶研究亚基间关系： 在适宜的条件下将寡聚体酶的一个亚基和载体偶联固定，变性并除去其他亚基，复性及活性检测，亚基重组和酶性质的测定酶亚基性质的研究研究蛋白质-核酸分子结构 例：用N,N-亚苯基双马来酰胺交联的肌球蛋白，手臂长度推算出活性中心两个必需巯基间的距离是1.2-1.4 nm22