以kdr为靶点的靶向超声微泡对裸鼠乳腺癌新生血管分子靶

《以kdr为靶点的靶向超声微泡对裸鼠乳腺癌新生血管分子靶》由会员分享，可在线阅读，更多相关《以kdr为靶点的靶向超声微泡对裸鼠乳腺癌新生血管分子靶（10页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、靶向超声微泡对肿瘤新生血管分子显像的研究 摘要 目的 探讨以KDR为靶点的靶向超声微泡对裸鼠结肠癌新生血管靶向显像效果。方法 “生物素-亲和素”桥接法将与VEGF的主要受体KDR特异性结合的小肽K237与脂质微泡偶联构建靶向微泡。以KDR阴性表达的人结肠癌LS174T细胞株建立人结肠癌裸鼠移植瘤模型。裸鼠经尾静脉随机注射靶向微泡、携随机序列对照肽的对照微泡，5min后行超声造影检查，观察各组微泡在肿瘤组织造影增强情况，测量肿瘤组织的声强度（VI）。另取6只裸鼠预先注射K237肽后再注射靶向微泡，观察微泡的显像效果。免疫组化技术检测KDR在肿瘤组织表达及分布规律。结果 成功制备了靶向微泡。注射超

2、声微泡5min显示靶向微泡组肿瘤组织显像明显增强，VI值与对照微泡组（VI）及封闭组(VI)比较均有显著差异（P0.05）；免疫组化显示，裸鼠结肠癌新生血管内皮细胞KDR表达较正常组织内皮细胞KDR表达显著增加。结论 以KDR为靶点的靶向超声微泡可以与肿瘤新生血管内皮特异性粘附并有效评价肿瘤新生血管形成。关键词 靶向微泡；超声造影；结肠癌；KDRMolecular imaging of tumor angiogenesis with targeted microbubbles 【Abstract】 Objective To evaluate effect of tumor neo-vascul

3、arization imaging in nude mice model of colon cancer by contrast ultrasound molecular imaging (UMI) of KDR expression.Methods A targeted microbubble（MBp）was builded by conjugding the small peptide K237 which has a high degree afffinity of KDR to liposome microbubbles through the bridging of biotin-a

4、vidin. A xenografted model of LS174T human colon cancer in nude mice was established.Twelve mice were injected intravenous of MBp and control microbubbles （MBc）in random order. MBp were injected in another six mice after K237-peptide blockage.After 5 minutes of intravenous injection of microbubble,

5、ultrasound imaging was performed in all mice to observe the imaging difference and measure the VI (video intensity) of tumor tissues in different MB groups.Immunohistochemistry was applied to detect the expression and distribution of KDR in breast tumor tissue and adjacent tumor tissues.Results K237

6、 peptide can be successfully conjugated to the surface of microbubbles through biotin-avidin mediation.Ultrasound imaging signal was significantly high in MBp group. And the VI of tumor tissues in MBp group showed remarkable difference compared to that in MBc group and K237-peptide blockage group (P

7、0.05).Immunohistochemistry showed KDR was highly expressed in tumor tissue and there was no significant expression of KDR in tissue surrounding tumor.Conclusion KDR-Targeted liposome contrast agent could specifically and efficiently combine with tumor vascular endothelial cells in vivo .It is a good

8、 method to assess tumor angiogenesis. 【Key words】Targeted microbubbles；Contrast-enhanced ultrasound；colon cancer；KDR实体瘤的生长和转移是血管依赖性的，以新生血管相关分子为靶点进行分子靶向超声显像以了解肿瘤血管生成状态，对评估预后、预测转移潜能、指导抗血管生成治疗及疗效监测有着重要意义。作为最重要的血管生长因子VEGF的主要受体,介导促进内皮细胞增殖、迁移、血管通透性增加等血管生成活性，在肿瘤血管生成过程尤其是早期阶段起着关键作用1-2。高表达于多数肿瘤新生血管内皮细胞，而在正常组

9、织血管内皮细胞中几乎不表达，提示KDR可能成为多数实体瘤新生血管特异性分子显像的靶标3-4。我们前期以生物素-亲和素桥接法将从噬菌体肽库中筛选到的与KDR有高亲和活性的12肽K237与脂质体微泡偶连，构建了靶向微泡，体外实验证实靶向微泡具有与靶细胞结合的高度特异性3。为进一步证实靶向微泡体内肿瘤新生血管靶向特异性，我们选择KDR阴性表达的人结肠癌LS174T细胞株【6-7】建立人结肠癌LS174T裸鼠移植瘤模型，探讨以肿瘤新生血管内皮为靶点进行靶向超声显像的可行性。材料与方法一、实验材料与仪器1实验动物与细胞 18只免疫缺陷型雌性小鼠，6-8周龄，由南方医科大学实验动物中心提供，饲养于SPF级

10、环境；人结肠癌细胞株LS174T，南方医院病理科实验室保存。2主要试剂 生物素化十二肽K237（杭州中肽公司）、二棕榈酰磷脂酰胆碱胆（DPPC，Sigma，美国）、聚乙二醇（PEG，Sigma，美国）、生物素化脂质体（DSPE-PEG-Biotin，Sigma，美国）、亲和素（Avidin，美国）、抗KDR抗体工作液（博士德）、新生小牛血清、0.25%胰蛋白酶、RIMP1640培养液。3实验仪器 荧光显微镜（Nikon Eclipe Ti-s，Japan）， Sequoia512超声诊断仪(Siemens，Germany)二、实验方法1超声微泡的制备将DPPC、PEG、DSPEPEGBioti

11、n交联物等按比例溶于蒸馏水，导入全氟丙烷气体，机械振荡处理，静置分层，弃下清液，纯化微泡3次，制备得到生物素化脂质微泡。参照文献【8】合成与KDR 有高亲和活性的氨基酸序列为“HTMYYHHYQHHL”的生物素化12肽K237及合成随机序列的对照肽（杭州中肽公司合成）。生物素化脂质微泡按比例加入链亲和素，纯化洗涤后再分别加入生物素化12肽或对照肽，制备出靶向微泡(MBp)和对照微泡(MBc)。按照我们之前建立的方法进行靶向微泡体外靶向性能鉴定【5,9】。2动物模型的建立 人结肠癌细胞株LS174T无菌培养于含10%新生牛血清的RIMP1640培养基中，37、5%CO2条件下的培养箱中培养。收集

12、处于对数生长期的细胞制成浓度为2.0x107个/ml的细胞悬液。6-8周龄雌性裸鼠18只，接种LS174T细胞，每鼠无菌条件下局部消毒，于裸鼠皮下第三对乳腺脂肪垫处缓慢注射0.2ml的瘤细胞悬液，见局部形成隆丘后退针，定期观察肿瘤生长情况。3超声造影检查瘤细胞接种10天行肿瘤超声造影检查。随机选取12只裸鼠以4%的戊巴比妥钠0.2ml腹腔麻醉，麻醉后裸鼠仰卧位固定于自制平台上，将探头放于支架上并调整探头使肿瘤能够良好显像后，固定探头，保证实验过程中探头位置不变。所有裸鼠经尾静脉分别随机注射2.0x108个/ml靶向微泡、对照微泡（各组微泡注射间隔30min【10】）。探头发射频率为10.0MH

13、z，机械指数（Mechanical Index, MI）为0.14，实验过程中各项参数保持不变。注入微泡5min后获取肿瘤声学造影第一帧图像，此后，以高MI连续超声发射23s破坏微泡后，继续存储图像3-4帧。取剩余6只瘤鼠，以0.2mlK237小肽（1mg/ml）预先注射30min封闭KDR结合位点后再注射2.0x108/ml靶向微泡0.2ml，造影方法及图像处理同前。4超声造影图像分析应用MCE软件对超声图像进行分析，测量实验裸鼠肿瘤显造影图像的声强度（video intensity, VI），其中第一帧图像的声强度值代表微泡在组织及循环中的总浓度，包括肿瘤组织的粘附和体内血液循环的微泡，高

14、机械指数超声波破坏后的声强度值为血液循环中的微泡浓度，前者减去后者即得到粘附在肿瘤组织中的微泡浓度。采用彩色编码技术制作肿瘤组织彩色编码图像。5免疫组化检查完成实验后处死裸鼠，所有标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，免疫组化检测肿瘤组织及距肿瘤2cm处正常组织内KDR表达及分布规律（SP法）。结果判定以胞浆或胞膜有明确棕黄色着色为阳性。6统计分析采用SPSS13.0分析软件进行统计分析，所有数据均以 x s表示。靶向微泡组、对照微泡组、小肽预先封闭组在肿瘤组织的VI值比较采用One-Way ANOVA，组间多重比较采用LSD检验。P0.05为差异有统计学意义。结 果1超声微泡理化性质制备得

15、到的靶向微泡(MBp)和对照微泡(MBc)光镜观察分布均匀，无聚集现象，单个微泡外观圆整。库尔特计数仪测得MBp浓度约为(5.171.0)x108个/ml，粒径为（2.010.93）m，MBc浓度约为（5.371.07）x108个/ml，粒径为（2.101.03）m。2动物模型情况注射肿瘤细胞10d左右，18只裸鼠均于注射部位形成肉眼可见的实体瘤，瘤体直径3-6mm，平均直径4.5mm。3超声造影检查彩色编码及VI值分析 彩色编码图像显示，注入微泡5min后可见MBp在肿瘤组织边缘及由边缘向内部延伸的显著超声造影增强，而MBc在肿瘤组织仅见轻度超声显影，K237小肽封闭后再注入MBp 5min

16、在肿瘤组织仅见轻度超声显影。注入微泡5min后MBp在肿瘤组织的VI值明显增高，而MBc在肿瘤组织的VI值未见明显增高，两者比较有统计学差异；经小肽预先封闭后，MBp在肿瘤组织的VI值明显降低，与未封闭组有显著差异（P0.05）。裸鼠肿瘤组织内彩色编码图见图1，声强度值见表1。 图1 裸鼠结肠癌移植瘤模型超声造影彩色编码图，A为注入微泡5min后，靶向微泡在肿瘤组织造影图像，为不均匀增强，以肿瘤周边为著；B为注入微泡5min后，对照微泡在肿瘤组织见轻度造影增强；C为小肽预先封闭后，注入靶向微泡5min后在肿瘤组织见轻度造影增强。 表1 裸鼠肿瘤超声造影检查声强度值分组 N MeanStd.Er

17、rorMBp1832.6811.28MBc188.284.74*Block+ MBp69.233.44*F33.120P0.00*与MBp组比较 P 0.054免疫组化结果同一肿瘤组织免疫组化结果显示，肿瘤组织边缘见大量新生血管，新生血管内皮细胞胞浆及胞膜呈棕色着色，可见KDR显著阳性表达，距肿瘤组织2cm处的正常组织内新生血管少，KDR呈阴性或弱阳性表达。见图2AB 图2A LS174T结肠癌肿瘤组织边缘见大量新生血管，新生血管内皮细胞胞浆及胞膜呈棕色着色，KDR呈阳性表达；图2B为距LS174T结肠癌肿瘤组织2cm处正常组织内新生血管少，KDR呈阴性或弱阳性表达。讨 论血管新生是指从微血管

18、床上芽生新生毛细血管为主的血管系统的过程，在肿瘤的生长、侵袭和转移过程中血管新生起着关键性的作用【11-12】。研究证实肿瘤内MVD及VEGF and/or VEGFR2的表达与乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤预后不良密切相关，是评价上述多种肿瘤预后的独立指标【13-14】。目前主要是通过检测组织学上微血管密度（MVD）、相关血管生长因子以及受体的表达来评价肿瘤新生血管，但是鉴于不同研究中采用的微血管标记抗体及计数方法不同,使MVD检测的临床病理意义缺乏可比性。加之肿瘤血管分布不均 ,呈明显异质性,这就增加了寻找 MVD“热点”区域的困难。此外上述指标的都是基于穿刺活检或术后获取标本的检测，

19、因此探索一种能够无创性客观、准确评估肿瘤血管生成状态而又方便实用的手段对于术前肿瘤治疗方案的选择，预后评价有着重要意义。运用靶向超声分子显像技术评价肿瘤血管生成已日益成为国内外超声领域的研究热点并取得初步成果。之前应用较多的肿瘤新生血管分子显像的靶目标是整合素v3，v3在新生肿瘤血管内皮细胞及部分高转移性肿瘤细胞呈高表达，在成熟的血管内皮细胞几乎不表达，主要在肿瘤侵袭性生长的边缘富集【15-16】。有学者将与整合素v3结合的含RGD识别序列的肽类配体或抗体与超声微泡连接，在小鼠神经胶质瘤型中实现了靶向显影。Leong-Poi【17】等构建了携带抗integrin v单抗（mAbs agains

20、t the integrin v chain，integrin v）的靶向超声微泡，体外实验发现该靶向微泡与基质胶新生血管的结合率明显高于正常血管内皮细胞，并可有效评价老鼠基质胶的血管新生；Ellegala【18】等构建携echistatin的靶向微泡证实该靶向微泡可以有效评价大鼠恶性神经胶质瘤模型的新生血管形成。由于抗v3单抗、echistatin以及含RGD识别序列的肽类配体除能与v3结合外，还可与整合素家族的其它分子结合，因此显像特异性欠佳。研究表明：同样作为肿瘤血管内皮细胞特异性靶点，KDR可能更适合于早期微小肿瘤血管的靶标显影【19-20】。Willmann21等构建携抗VEGF2单

21、抗的靶向超声微泡评价小鼠血管肉瘤新生血管，结果表明可使肿瘤显影强度明显增强并可用于抗肿瘤血管生成治疗疗效监测。我们选取KDR阴性表达的人结肠癌细胞株LS174T建立裸鼠皮下移植瘤模型，生物素-亲和素桥接法构建携与KDR有高亲和活性小肽K237的靶向微泡，裸鼠结肠癌移植瘤模型成功实现了肿瘤靶向显像。静脉注射微泡5分钟后靶向微泡在肿瘤组织可见显著的超声显像增强，而注射对照微泡及K237小肽预先封闭后再注射靶向微泡5分钟后肿瘤组织仅见轻度超声造影增强，靶向微泡组肿瘤声强度（VI值）与对照微泡组及预先封闭组比较有显著性差异，免疫组化检测提示LS174T结肠癌新生血管内皮细胞呈KDR高表达，同时LS17

22、4T结肠癌细胞本身呈KDR阴性表达，提示肿瘤靶向显像效果是通过小肽与癌组织内新生血管内皮特异性地结合而促使靶向微泡粘附于肿瘤血管床内实现的。小肽预先封闭实验进一步证实靶向微泡与靶点特异性结合具有可饱和性，从另一方面提示靶向微泡制备的步骤中，必须注意洗脱游离的小肽以纯化微泡，否则游离的小肽将会与靶向微泡外壳上连接的小肽竞争结合靶器官的相应靶点，从而降低靶向超声微泡在靶器官的黏附，导致靶向超声分子成像敏感性下降。我们研究过程中发现，同类肿瘤不同个体或同一肿瘤不同区域，都存在靶向超声造影效果的差异，实际上是肿瘤血管异质性的表现。肿瘤发生发展过程中，肿瘤血管异质性不仅表现为肿瘤新生血管与非肿瘤血管的差

23、异，还包括肿瘤演进阶段及不同肿瘤之间、同种肿瘤不同个体之间，同一肿瘤不同区域之间的血管异质性22-23。新近的研究24表明靶向超声微泡可有效评价不同肿瘤发生与演进的不同阶段新生血管分子标记物表达水平的差异，不仅有潜力用于肿瘤预后评价，更对肿瘤的早期诊断及疗效监测有着重要价值。本实验采用小肽作为与靶点连接的配体分子，与大分子抗体相比，以小分子肽作导向分子能明显降低免疫反应，且对受体的亲和性比抗体和抗体片段高，易于合成和修饰，能很快从血液中清除，具有分子质量小,制备简单、经济,抗原性弱,性能稳定，毒副作用小的优点【25-26】,在肿瘤分子影像领域具有广阔的应用前景。参 考 文 献1 Yakes F

24、M, Chen J, Tan J, Yamaguchi K，et al.Cabozantinib (XL184), a novel MET and VEGFR2 inhibitor, simultaneously suppresses metastasis, angiogenesis, and tumor growth. Mol Cancer Ther. 2011 Dec;10(12):2298-308.2 Horta BA, Sodero AC, de Alencastro RB.Investigating the differential activation of vascular en

25、dothelial growth factor (VEGF) receptors. J Mol Graph Model.2009 Oct;28(3):287-296.3 李颖嘉，文戈，杨莉.超声造影及其定量分析对乳腺癌恶性转化过程中血管生成作用的评价，中华医学杂志，2009，89（9）；587-5914 李颖嘉，文戈，杨莉，张雪林. 乳腺良恶性肿瘤微血管构筑的异质性及其血流动力学的功能变化，中华肿瘤杂志，2009，31(1);24-275 李颖嘉，何洁，孙学刚等.生物素-亲和素介导以KDR为靶点的脂质体超声造影剂体外靶向实验研究，中华超声影像学杂志，2010，19（5）：446-4496 Qu

26、ante M,Raskopf E,Stahl S,et al.No functional and transductional significance of specific neuropilin 1 siRNA inhibition in colon carcinoma cell lines lacking VEGF receptor 2.Oncol Rep.2009 May，21(5):1161-11687 Hansel DE, Wilentz RE, Yeo CJ,et al.Expression of neuropilin-1 in high-grade dysplasia,inva

27、sive cancer, and metastases of the human gastrointestinaltract. Am J Surg Pathol，2004 Mar;28(3):347-568 Lei HT,An P, Song SM.A novel peptide isolated from a phage display library inhibits tumor growth and metastasis by blocking the bingding of vascular endothelial growth factor to its kinase domain

28、receptor.Bio Chem.2002,45,43137-431429 何洁，杨莉，李颖嘉等，以短肽K237 为配体的靶向脂质体超声造影剂构建方法。中国医学影像技术，2011,27（1）：3-710 Willmann J K, Kimura R H, Deshpande N, et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides.J. J Nuc

29、l Med,2010,51(3):43344011 Rastelli L, Valentino ML, Minderman MC et al. A KDR-binding peptide (ST100,059) can block angiogenesis, melanoma tumor growth and metastasis in vitro and in vivo. Int J Oncol. 2011 Aug;39(2):401-408. 12 Saharinen P, Eklund L, Pulkki K, et al.VEGF and angiopoietin signaling

30、in tumor angiogenesis and metastasis. Trends Mol Med. 2011 Jul;17(7):347-6213 Ciurea R, Mrgritescu C, Simionescu C,et al.VEGF and his R1 and R2 receptors expression in mast cells of oral squamous cells carcinomas and their involvement in tumoral angiogenesis. Rom J Morphol Embryol. 2011;52(4):1227-3

31、2.14 Khosraviv Shahi P,Soria Lovelle A,Prez Manga G.Tumoral angiogenesis and breast cancer.Clin Transl Oncol 2009;11(3): 138-142.15 Li CH, Cheng YW, Hsu YT, et al.Benzoapyrene inhibits angiogenic factors-induced alphavbeta3 integrin expression, neovasculogenesis, and angiogenesis in human umbilical

32、vein endothelial cells. Toxicol Sci. 2010 Dec;118(2):544-5316 Brooks PC, Clark RAF, Cheresh DA. Requirement of vascular integrin v3 for angiogenesis. Science. 1994,264:569 571.17 Leong-Poi H, Christiansen J, Klibanov AL, et al. Noninvasive Assessment of Angiogenesis by Ultrasound and Microbubbles Ta

33、rgeted to v-Integrins. Circulation, 2003,107:455-460.18 Ellegala DB, Leong-Poi H, Carpenter JE, et al. Imaging Tumor Angiogen- esis With Contrast Ultrasound and Microbubbles Targeted to v3. Circulation,2003,108:336-341.19 李颖嘉，邓永键，文戈等.乳腺癌发生与演进过程中血管生成的评价，中华外科杂志，2009，47（7）：519-52220 Li ZL, Yao XJ, Liu

34、WF, Chen GJ. A fusion fragment from Flt-1 and KDR, acted as VEGF decoy receptor and exhibited anti-tumor function. Biotechnol Lett. 2010 Nov;32(11):1609-13.21 Jrgen K Willmann M. Targeted Microbubbles for Imaging Tumor Angiogenesis: Assessment of Whole-Body Biodistribution with Dynamic Micro-PET in

35、MiceJ. Radiology，2008，249（1）:212-21922 Bae YH.Drug targeting and tumor heterogeneity.J Control Release. 2009 Jan 5;133(1):2-323 Incassati A, Pinderhughes A, Eelkema R, et al.Links between transforming growth factor-beta and canonical Wnt signaling yield new insights into breast cancer susceptibility

36、, suppression and tumor heterogeneity.Breast Cancer Res. 2009;11(3):103.24 Deshpande N, Ren Y, Foygel K, et al. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imagingJ. Radiology,2011,258(3):80481125 Lee S, Xie J, Chen X.et al.Peptides and Peptide Hormones for Molecular Imaging and Disease Diagnosis. Chem Rev. 2010 May 12;110(5):3087-11126 Wall JS, Richey T, Stuckey A,et al.In vivo molecular imaging of peripheral amyloidosis using heparin-binding peptides. Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Aug 23，108(34):E586-94.