细胞凋亡及机制检测课件

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1、细胞凋亡及机制检测 细胞细胞(xbo)凋亡凋亡（科普诗）（科普诗） apoptosis似秋叶的凋零，似秋叶的凋零，告别生命之辉煌；告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，轻启着道道程序，逼细胞步步走向逼细胞步步走向(zuxing)生命的末端；生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡线粒体把生命之光一点一点拧淡;第一页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测n危难中的细胞啊，危难中的细胞啊，n你沉稳不乱，你沉稳不乱，nDNA片片切割，片片切割，n化云梯直通天堂；化云梯直通天堂；n细胞体分团相聚

2、，细胞体分团相聚，n把生命的凝重浓集在小体上；把生命的凝重浓集在小体上；n分别了朝夕相处的伙伴，分别了朝夕相处的伙伴，n再见了快乐美好的时光；再见了快乐美好的时光；n这一切的一切又融入临近这一切的一切又融入临近(ln jn)的胞体，的胞体，n腾出的空间再写生命的篇章。腾出的空间再写生命的篇章。 第二页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测第三页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测第四页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测n典型的典型的凋亡小体（凋亡小体（apoposis boby）：）：由透亮空泡和不透光的浓密由透亮空泡和不透光的浓密(nngm)的核碎片两部分组成。的核碎片两部分组成。第五页，共七十二页。细

3、胞凋亡及机制检测第六页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测第七页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测 坏死坏死 凋亡凋亡1.性质性质病理性病理性,非特异性非特异性生理性或病理性，特异性生理性或病理性，特异性2. 诱导因素诱导因素强烈病理性刺激强烈病理性刺激,随机发生随机发生生理性或较弱病理性刺激，非随机发生理性或较弱病理性刺激，非随机发生生3. 生化特点生化特点被动过程被动过程,无新蛋白合成无新蛋白合成,不不耗能耗能耗能的主动过程，有新蛋白合成耗能的主动过程，有新蛋白合成4. 形态变化形态变化细胞结构全面溶解、破坏、细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀细胞肿胀胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核胞膜及细胞器相

4、对完整细胞皱缩，核固缩固缩,膜可发泡成芽膜可发泡成芽,形成凋亡小体形成凋亡小体5.DNA电泳电泳弥散性降解，电泳呈均一弥散性降解，电泳呈均一DNA片状片状DNA片段化（片段化（180-120bp）,电泳呈电泳呈“梯梯”状条带状条带6. 炎症反应炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应7.凋亡小体凋亡小体无无有有8.基因调控基因调控无无有有细胞凋亡与坏死细胞凋亡与坏死(hui s)的比的比较较第八页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测2002年年10月月7日英国人悉尼日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特布雷诺尔、美国人罗伯特霍

5、维茨和英国霍维茨和英国人约翰人约翰苏尔斯顿，因在细胞苏尔斯顿，因在细胞(xbo)程序性死亡方面的研究获诺贝尔生程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理与医学奖理与医学奖。Sydney BrennerH. Robert HorvitzJohn E. Sulston 第九页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞凋亡与疾病发生细胞凋亡与疾病发生(fshng)机制的机制的新认识新认识1.该该“死死”的细胞（如的细胞（如肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞）未未死死，是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制之一。，是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制之一。细胞凋亡不足细胞凋亡不足2.不该不

6、该(b i)“死死”的细胞（如的细胞（如神经元、心肌细胞神经元、心肌细胞）死死了了，这与老年性痴呆、心肌缺血，这与老年性痴呆、心肌缺血/再灌注损伤等发病有再灌注损伤等发病有关。关。细胞凋亡过度细胞凋亡过度第十页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测胸腺细胞胸腺细胞(xbo)正常正常(zhngchng)凋亡(dio wn)第十一页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测胸腺细胞胸腺细胞(xbo)正常正常(zhngchng)凋亡(dio wn)第十二页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞细胞(xbo)(xbo)凋亡的过凋亡的过程程1.凋亡信号转导凋亡信号转导2.凋亡基因凋亡基因(jyn)激活激活3.细胞凋亡的执

7、行细胞凋亡的执行4.凋亡细胞的清除凋亡细胞的清除第十三页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测凋亡(dio wn)过程及分期诱导期诱导期 执行期执行期 消亡期消亡期 凋凋亡亡诱诱导导因因素素受受体体cAMPCa2+神神经经酰酰胺胺死死亡亡信信号号凋凋亡亡相相关关基基因因激激活活Dnase激活激活(j hu)Capases激活激活巨噬细胞巨噬细胞吞噬细胞吞噬细胞凋亡凋亡(dio wn)细胞细胞第十四页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞细胞(xbo)凋亡的生化改变凋亡的生化改变1.DNA的片段化的片段化“梯梯”状条带状条带2.内源性核酸内切酶激活及其作用内源性核酸内切酶激活及其作用(zuyng)3.凋

8、亡蛋白酶（凋亡蛋白酶（caspases）的激活）的激活 及其作用及其作用第十五页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测1.DNA的片段化的片段化“梯梯”状条带为细胞凋状条带为细胞凋亡亡(dio wn)主要特征主要特征几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂 解，导致解，导致DNA 的断裂；的断裂；DNA降解过程的特异性：不伴有组蛋降解过程的特异性：不伴有组蛋 白和其它白和其它(qt)核蛋白的降解；核蛋白的降解；染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞 和形态改变的基础；和形态改变的基础；DNA fragmentation是凋亡的是凋亡的“golden

9、marker”。第十六页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测第十七页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测2.2.内源性核酸内源性核酸(h sun)(h sun)内切酶激活及内切酶激活及其作用其作用n由一系列胞内信号转导环节激活由一系列胞内信号转导环节激活(j hu)(j hu)，执行染色质执行染色质DNADNA切割切割第十八页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测3. Caspase 9 激活，需要通过激活，需要通过CARD（caspase-recruitment domain)、Apaf-1、细胞色素、细胞色素c、ATP等多个因等多个因子的参与子的参与Caspases在凋亡在凋亡(dio wn)中的主要作

10、用中的主要作用n1.灭活灭活细胞细胞(xbo)(xbo)凋亡的抑制物（如凋亡的抑制物（如Bcl-2Bcl-2）；）；n2.2.水解水解细胞的蛋白质结构，细胞的蛋白质结构，导致细胞解体，导致细胞解体，形成形成凋亡小体（凋亡小体（apoposis boby）；）；n3.在凋亡级联反应中水解在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白相关活性蛋白，使，使该蛋白获得或丧失某种生物学功能该蛋白获得或丧失某种生物学功能第十九页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞凋亡(dio wn)的调控（一）细胞凋亡(dio wn)相关因素1.诱导性因素诱导性因素2.抑制性因素抑制性因素 (二)细胞凋亡信号的转导第二十页，共七十二页

11、。细胞凋亡及机制检测1.细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的诱导因素的诱导因素.生理活性因子：生理活性因子：TNF家族家族(Fas-L,TNF)、 TGF、神经递质、神经递质(谷氨酸、多巴胺谷氨酸、多巴胺)、生长、生长 因子撤退、因子撤退、GC等等 .损伤相关因子：热休克、病毒感染、自由损伤相关因子：热休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射线等基、癌基因、抑癌基因、放射线等.化疗药物化疗药物(yow).毒素：乙醇、毒素：乙醇、 -淀粉样肽淀粉样肽第二十一页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测2.细胞凋亡的抑制细胞凋亡的抑制(yzh)因素因素.凋亡凋亡(dio wn)相关基因的抑制作用：相关基

12、因的抑制作用：p53、bcl-2、bcl-XL等。等。.生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、锌、生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、锌、雄激素、雌激素等雄激素、雌激素等.病毒基因：腺病毒病毒基因：腺病毒E1B、杆状病毒、杆状病毒p35、棒、棒状病毒状病毒IAP、牛痘病毒、牛痘病毒CrmA、EBV BHRF1等等.药物：药物：Calpain抑制剂、抑制剂、caspases抑制剂、抑制剂、促癌剂、佛波豆蔻乙脂促癌剂、佛波豆蔻乙脂(PMA)等等第二十二页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测( (二二) )细胞凋亡信号的转导细胞凋亡信号的转导凋亡信号转导系统凋亡信号转导系统(xtng)特点特点n 多样性：

13、不同种类的细胞系统不同多样性：不同种类的细胞系统不同n 偶联性：与增殖偶联性：与增殖(zngzh)(zngzh)分化的信号系统交分化的信号系统交叉偶联叉偶联n 同一性：多因素，共用同一系统触发同一性：多因素，共用同一系统触发n 多途性：同一诱导因素启动多条信号转导多途性：同一诱导因素启动多条信号转导途径途径第二十三页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞细胞(xbo)凋亡信号的转导凋亡信号的转导诱导诱导(yudo)信号信号cellR神经酰胺神经酰胺多途径多途径(tjng)RSAPK/JNKP53 基因基因NF-kB,JNK/AP-1途径途径激活激活bax or 下调下调bcl-2ROSmtDNA

14、第二十四页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞细胞(xbo)凋亡相关基因凋亡相关基因n抑制凋亡基因抑制凋亡基因(jyn)(jyn)：bcl-2bcl-2n促进凋亡基因：促进凋亡基因： fasfas，P53P53n双向调控基因：双向调控基因： c-mycc-myc，bclxbclxn研究较多的有研究较多的有c-myc、 bcl-2、 p53、Ice、Fas/APO-1等。等。第二十五页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测1. c-mycnc-myc诱导细胞增殖，也能诱导细诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡。胞凋亡。当生长因子存在当生长因子存在(cnzi)，bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之基因表达

15、时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。细胞凋亡。第二十六页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测n第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，存在于线粒存在于线粒体外膜、核膜及部分体外膜、核膜及部分(b fen)内质网中。内质网中。nbcl-2相当于线虫的相当于线虫的ced9。nBcl-2家族可分为两类，一类是抗凋亡的，如：家族可分为两类，一类是抗凋亡的，如：Bcl-2；一类是促进凋亡的，如：一类是促进凋亡的，如：Bax、Bad、Bid，以二聚体，以二聚体形体发挥作用。形体发挥作用。2.bcl-2第二十七页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测Bcl-2Bcl-2抗凋亡抗凋亡(dio w

16、n)(dio wn)机制机制n直接直接(zhji)(zhji)的抗氧化的抗氧化n抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质n抑制促凋亡的抑制促凋亡的BaxBax，BakBak细胞毒作用细胞毒作用n抑制抑制CaspasesCaspases激活激活n维持细胞钙稳态维持细胞钙稳态第二十八页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测n3.fas nfas又称作APO-1或CD95，属TNF受体和NGF受体家族。对细胞凋亡有促进作用n基因产物(chnw)为45KD的跨膜蛋白。nFas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合导致靶细胞走向凋亡。第二十九页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测n与线虫ced

17、-3同源，又称为Caspase。nICE是一种半胱氨酸蛋白酶，在人类，是一种半胱氨酸蛋白酶，在人类，ICE家族至家族至少有少有11个成员，每一成员均含有个成员，每一成员均含有(hn yu)与底物结合与底物结合及催化的保守序列，识别位点在及催化的保守序列，识别位点在Asp之后，故又称之后，故又称Caspases。n n 启动子启动子Caspases： Caspases8、9和和10n 效应子效应子Caspases： Caspases3、6、74.ICE蛋白酶家族蛋白酶家族(jiz)第三十页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测n5.Apaf-1n与线虫的ced-4同源；n在线粒体参与的凋亡途径中发挥作

18、用； n能激活Caspase3 ，这一过程(guchng)需要细胞色素c和Caspase9的参与。第三十一页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测6.p53 磷酸化磷酸化p53使细胞处于使细胞处于G1期，必要时诱导期，必要时诱导(yudo)细胞凋亡。细胞凋亡。 p21 CDK RB不被磷酸化不被磷酸化 G1DNA损伤损伤 p53 并磷酸化并磷酸化 Bax , Bcl apoptosis Gadd45 DNA修复修复野生型P53基因具有诱导细胞(xbo)凋亡的功能“分子警察”；第三十二页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞细胞(xbo)凋亡发生机制凋亡发生机制n（一）氧化损伤一）氧化损伤(snshng

19、)n（二）钙稳态失衡（二）钙稳态失衡n (三三) 线粒体损伤线粒体损伤第三十三页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测（一）氧化损伤（一）氧化损伤(snshng)机制机制n氧自由基可破坏机体正常的氧化/还原的动态平衡，造成生物大分子的氧化损伤，干扰正常的生命活动，形成严重的氧化应激状态后果：诱导(yudo)细胞凋亡。第三十四页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测氧化应激引起细胞凋亡的可能氧化应激引起细胞凋亡的可能(knng)机制机制n1.氧自由基引起的DNA损伤可激活P53基因引起细胞凋亡。n2.氧自由基引起的DNA损伤可活化多聚ADP核糖合成酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量消耗，引发细胞凋亡。n3.

20、氧自由在攻击(gngj)细胞膜上的不饱和脂肪酸，通过脂质过氧化作用直接造成细胞膜的损伤可诱导细胞凋亡；此外细胞膜上不饱和脂肪酸（如：花生四烯酸）的氧化产物过氧羟基24碳四烯酸有很强的诱发细胞凋亡的作用。第三十五页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测氧化应激引起氧化应激引起(ynq)细胞凋亡的可能机制（续）细胞凋亡的可能机制（续）n4.氧化应激可激活Ca2+/Mg2+依赖的DNase，也可产生膜的发泡现象。n5.氧化应激引起细胞膜结构的破坏，可改变细胞膜的通透性使Ca2+内流增加，诱导细胞凋亡。自由基对线粒体膜的损害导致其通透性和膜电位的变化也可诱导细胞凋亡。n6.氧化应激可活化核转录因子NF-B、

21、AP-1，可加速(ji s)细胞凋亡相关的一些基因的表达，诱发细胞凋亡。第三十六页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测（二）钙稳态失衡引起细胞凋亡的（二）钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能可能(knng)机制机制n1.激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶(DNase)，降解DNA链；n2.激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成；n3.激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录；n4.Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核小体之间的连接(linji)区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割DNA。第三十七页，共七十

22、二页。细胞凋亡及机制检测(三) 线粒体损伤(snshng)第三十八页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测第三十九页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞凋亡的恶性网络细胞凋亡的恶性网络(wnglu)假说假说线粒体线粒体 m PTP开放开放(kifng) Apaf+Cyt.C AIFCaspase抑制剂抑制剂+Caspase 9酶原酶原(mi yun)Caspase-9Caspase3酶原酶原Caspase-3蛋白质水解蛋白质水解无活性核无活性核酸内切酶酸内切酶内切酶激活内切酶激活DNA断裂断裂+Bcl-2Ca2+apoptosis？第四十页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测氧化氧化(ynghu)损伤损

23、伤钙稳态失衡钙稳态失衡(sh hn)线粒体损伤线粒体损伤(snshng)恶性网络假说恶性网络假说(deleterious network hypothesis)细胞凋亡 m AIF，ApafPTP open第四十一页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞细胞(xbo)凋亡的生物学意义凋亡的生物学意义 1.1.发育发育 从低等动物到高等动物的发育，都存在着程从低等动物到高等动物的发育，都存在着程序性细胞死亡的现象。序性细胞死亡的现象。 2.2.免疫系统免疫系统 淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终(shzhng)(shzhng)伴随着细胞凋亡。伴随着细胞凋亡。 3.3.

24、衰老衰老 细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接或间接细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接或间接的联系。的联系。 4.4.损伤与修复损伤与修复 5.5.肿瘤发生肿瘤发生 细胞增殖与死亡的速度平衡失调。细胞增殖与死亡的速度平衡失调。 6.6.病毒致病病毒致病 病毒表达抗凋亡蛋白。病毒表达抗凋亡蛋白。第四十二页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测Hutchinson-Gilford syndrome 第四十三页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测第四十四页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞细胞(xbo)凋亡与疾病凋亡与疾病（一）细胞（一）细胞(xbo)凋亡不足凋亡不足1.肿瘤2.自身免疫病第四十五页，共七十二页。

25、细胞凋亡及机制检测 1.凋亡与恶性肿瘤凋亡与恶性肿瘤 肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关，还与肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关，还与凋亡障碍凋亡障碍(zhng i)有关。有关。 Oncogenes “anti-apoptic”genes Cell division cell death 肿瘤治疗新思路：诱导肿瘤细胞的凋亡肿瘤治疗新思路：诱导肿瘤细胞的凋亡第四十六页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测 2.凋亡凋亡(dio wn)与免疫系统功能障碍与免疫系统功能障碍 凋亡对免疫系统功能有重要调节作用凋亡对免疫系统功能有重要调节作用 淋巴细胞：在发育过程中有凋亡发生；在淋巴细胞：在发育过程中有凋亡发生；

26、在晚期，当与抗原相互作用时亦发生凋亡。晚期，当与抗原相互作用时亦发生凋亡。 胸腺发育过程中的自然凋亡过程胸腺发育过程中的自然凋亡过程第四十七页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测（二）细胞（二）细胞(xbo)凋亡过度凋亡过度1.心血管疾病心血管疾病（1）心肌缺血）心肌缺血 与缺血与缺血-再灌注再灌注(gunzh)损伤损伤（2）心力衰竭）心力衰竭第四十八页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测（1）心肌缺血和再灌注损伤）心肌缺血和再灌注损伤 心肌缺血再灌注后可引起心肌细胞的凋心肌缺血再灌注后可引起心肌细胞的凋亡，由于心肌组织中吞噬细胞亡，由于心肌组织中吞噬细胞(tn sh x bo)数量有限，数量有限，故

27、而凋亡细胞可以激发性引起炎性反应，招故而凋亡细胞可以激发性引起炎性反应，招引中性粒细胞浸润，进而导致心肌组织坏死引中性粒细胞浸润，进而导致心肌组织坏死（心肌梗塞）。（心肌梗塞）。第四十九页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测 (2)凋亡与心脏病凋亡与心脏病 心脏传导障碍和心律失常心脏传导障碍和心律失常 心脏传导系统在胚胎早期就已形成。心脏传导系统在胚胎早期就已形成。新生儿窦房结主要有大量起搏细胞新生儿窦房结主要有大量起搏细胞(xbo)（P细细胞胞(xbo)）和少量胶原组成，而成人则为少量）和少量胶原组成，而成人则为少量P细胞细胞(xbo)和大量胶原构成，可能是和大量胶原构成，可能是P细胞细胞(xb

28、o)凋亡的结果。因此凋亡的结果。因此P细胞细胞(xbo)凋亡不足或过度凋亡不足或过度均可引起心律失常。均可引起心律失常。第五十页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测2.神经元退性疾病神经元退性疾病（1）阿尔茨海默病）阿尔茨海默病(AD)（2）帕金森病）帕金森病（3）多发性硬化症）多发性硬化症第五十一页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测(1)凋亡与神经退行性病变凋亡与神经退行性病变 神经元是神经元是non-proliferating, long-lived, terminally differentiated cell。神经元等非增殖细胞发生凋亡的意义：神经元等非增殖细胞发生凋亡的意义： 1、避免细胞

29、重新进入细胞周期，特别、避免细胞重新进入细胞周期，特别(tbi)是遇是遇 到致转化刺激信号时。如向终末分化的到致转化刺激信号时。如向终末分化的 细胞中转染细胞中转染oncogene可引起细胞凋亡，可引起细胞凋亡， 而非增殖。而非增殖。第五十二页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测(2)(2)为了器官为了器官(qgun)(qgun)生存的需要生存的需要 A deleted cell is more advantageous than a damaged cell, even when the cell is irreplaceable. This is analogous to what is fr

30、equently referred to as “better dead than wrong” for dividing cell第五十三页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测 3.病毒感染 人免疫(miny)缺陷病毒（HIV）感染引起的AIDS第五十四页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测(凋亡与免疫缺陷性疾病凋亡与免疫缺陷性疾病)典型例子是典型例子是AIDS1.HIV-1感染后可引起感染后可引起CD4+T淋巴细胞的淋巴细胞的 凋亡，且可能由病毒被膜蛋白复合体凋亡，且可能由病毒被膜蛋白复合体 gp120介导。介导。2.AIDS患者外周血淋巴细胞患者外周血淋巴细胞Fas/Apo水平水平 明显提高，可

31、迅速诱导细胞凋亡。明显提高，可迅速诱导细胞凋亡。 由此，通过控制凋亡过程由此，通过控制凋亡过程(guchng)是否可以预是否可以预防或延缓防或延缓AIDS的进展。的进展。第五十五页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测（三）细胞凋亡三）细胞凋亡(dio wn)不足与不足与过度并存过度并存动脉粥样硬化动脉粥样硬化(ynghu)即属于这种情况，对即属于这种情况，对内皮细胞而言是凋亡过度，对平滑肌细内皮细胞而言是凋亡过度，对平滑肌细胞来说则是凋亡不足胞来说则是凋亡不足第五十六页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)在疾病防治中的在疾病防治中的意义意义1.合理利用凋亡相关因素合理利

32、用凋亡相关因素(yn s)2.干预凋亡信号转导干预凋亡信号转导3.调节凋亡相关基因调节凋亡相关基因4.控制凋亡相关的酶学机制控制凋亡相关的酶学机制5.防止线粒体跨膜电位的下降防止线粒体跨膜电位的下降第五十七页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测n1. 1.合理利用凋亡合理利用凋亡(dio wn)(dio wn)相关因素相关因素n抑凋亡：抑凋亡：NGFNGF老年性痴呆老年性痴呆n急性急性T T细胞白血病：低剂量放射线、细胞白血病：低剂量放射线、TNFTNF 促凋亡：促凋亡：局部肿瘤热疗；高温局部肿瘤热疗；高温4343、30min30minn前列腺癌：前列腺癌：去势治疗去势治疗n2.2.干预凋亡信号转

33、导干预凋亡信号转导nFAS/FASL信号系统：阿霉素刺激信号系统：阿霉素刺激nSPP（神经酰胺信号系统的代谢产物）：转导增殖信号，（神经酰胺信号系统的代谢产物）：转导增殖信号，拮抗凋亡拮抗凋亡AIDS，AD第五十八页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测n3.调节凋亡相关基因调节凋亡相关基因n野生型野生型P53基因转染基因转染n4.控制凋亡相关的酶控制凋亡相关的酶n核酸内切酶核酸内切酶 ： Ca 2+/Mg 2+依赖性依赖性nCa 2+ Mg 2+激活；激活；Zn 2+ 抑制抑制nCaspases: Ca2+直接或间接激活直接或间接激活n5.防止线粒体跨膜电位的下降防止线粒体跨膜电位的下降n环胞霉素

34、环胞霉素A(cyclosporinA,免疫抑制剂）免疫抑制剂）阻抑阻抑(z y) m ，其衍生物无免疫抑制作，其衍生物无免疫抑制作用，但有稳定用，但有稳定 m 第五十九页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞细胞(xbo)凋亡的检测凋亡的检测 随着研究技术的提高和对凋亡的认识随着研究技术的提高和对凋亡的认识不断深入，检测凋亡的方法已从细胞、染色不断深入，检测凋亡的方法已从细胞、染色质到分子水平日趋完善和成熟。质到分子水平日趋完善和成熟。n1.1.形态学检测形态学检测n2.DNA2.DNA降解分析降解分析(fnx)(fnx)n3.3.凋亡酶学分析凋亡酶学分析n4.4.凋亡相关蛋白分析凋亡相关蛋白分

35、析n5.5.流式细胞分析流式细胞分析第六十页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测一细胞凋亡一细胞凋亡(dio wn)的形态学分的形态学分析析 细胞细胞(xbo)凋亡的形态学变化主要表现凋亡的形态学变化主要表现为：细胞为：细胞(xbo)皱缩皱缩(cell shrinkage)，失，失去细胞去细胞(xbo)连接连接(cell junction)，微绒毛，微绒毛(microvilli)消失，发泡消失，发泡(blebbing)，染，染色质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收缩色质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收缩的新月状体的新月状体(crescents)，形成凋亡小体，形成凋亡小体(apoptotic body)等。

36、等。第六十一页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测细胞凋亡细胞凋亡(dio wn)的形态学检测方法的形态学检测方法 检测方法检测方法 可鉴定凋亡细胞特征可鉴定凋亡细胞特征 光学显微镜光学显微镜 相差显微镜相差显微镜 透射电镜透射电镜 聚焦激光扫聚焦激光扫 描电镜描电镜 扫描电镜扫描电镜 流式细胞仪流式细胞仪 缩时摄影术缩时摄影术细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈细胞发泡、凋亡小体细胞发泡、凋亡小体微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、凋亡小体凋亡小体凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位细

37、胞膜表面泡状鼓起细胞膜表面泡状鼓起低前向散射光低前向散射光(FSC)、高侧向散射光、高侧向散射光(SSC)凋亡细胞的形成过程凋亡细胞的形成过程第六十二页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测二二. DNA降解降解(jin ji)分析分析nDNA降解过程的特点：降解过程的特点：n1. 发生于凋亡早期发生于凋亡早期(zoq)，由内源性核酸内，由内源性核酸内切酶激活引起切酶激活引起n2. DNA在核小体连接部位断裂，产生在核小体连接部位断裂，产生180200bp为最小单位的单体或寡聚为最小单位的单体或寡聚体片断体片断n3. DNA碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡小体小体第六十三页，

38、共七十二页。细胞凋亡及机制检测 n(一一) DNA凝胶电泳凝胶电泳n 原理：凋亡细胞降解产生一系列规原理：凋亡细胞降解产生一系列规则的则的DNA片断，其电泳结果呈典型的片断，其电泳结果呈典型的“ 梯状带梯状带”(ladder)；而坏死或凋亡后；而坏死或凋亡后坏死细胞的坏死细胞的DNA分解是随机的，产生的分解是随机的，产生的碎片分子量大小不一，在电泳时形成碎片分子量大小不一，在电泳时形成“ 涂片状涂片状”(smear)。n 普通琼脂糖凝胶电泳、普通琼脂糖凝胶电泳、Southern blotting、放射自显影、放射自显影(xin yng)(32PdATP或或32PdCTP连接到连接到DNA片断的

39、片断的3 端端)第六十四页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测n( (二二) )原位标记法原位标记法nTUNEL(TdT mediated dUTP nick end labeling) )终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记技术。标记技术。n原理：在原理：在TdT的作用下，带有标记物的的作用下，带有标记物的dUTP被连接被连接在断裂在断裂DNA3末端，然后通过相应的方法检测标记末端，然后通过相应的方法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生物，从而判断是否有凋亡发生(fshng)。n应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切片、应用范围：石蜡包埋的组织

40、切片、冰冻组织切片、培养细胞、组织中分离的细胞培养细胞、组织中分离的细胞 第六十五页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测n(三三) ELISA法法n 原理原理(yunl)：以抗组蛋白抗体包被微孔：以抗组蛋白抗体包被微孔板壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与板壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与抗体结合，再加入抗抗体结合，再加入抗-DNA片断片断-POD复复合物，与核小体中的合物，与核小体中的DNA片断结合，最片断结合，最后加入后加入POD显色底物，以酶标仪测定光显色底物，以酶标仪测定光密度以进行定量分析。密度以进行定量分析。第六十六页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测三三. 凋亡凋亡(dio wn)酶学

41、分酶学分析析n1. 内切核酸酶内切核酸酶(endonuclease, DNase)n 种类种类(zhngli)：DNase （内质网、高尔基体（内质网、高尔基体), DNase （溶酶体、胞核（溶酶体、胞核)，NUC18（胞核，胸腺细（胞核，胸腺细胞中胞中) 等等n 作用：作用：使使DNA断裂成断裂成180200bp或其倍数或其倍数的片断的片断n 激活机制：激活机制：CAD(caspase-activate DNase) n ICAD(inhibtor of CAD)n 检测：检测：Western Blotting第六十七页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测nCaspases的检测的检测n 1.

42、 Caspase-3活性测定活性测定(cdng)(FIENA法法)n 荧光测定免疫吸附法荧光测定免疫吸附法(flurometric immunosorbent enzyme assay, FIENA), caspase-3可作用于连接荧光素的特异底物乙酰化天冬氨酸可作用于连接荧光素的特异底物乙酰化天冬氨酸-谷谷氨酸氨酸-颉氨酸颉氨酸-天冬氨酰胺天冬氨酰胺(Ac-DEVD), 产生发荧光的裂产生发荧光的裂解产物解产物AFC，且，且caspase-3活性与活性与Ac-DEVD-AFC分解分解的量或自由荧光的量或自由荧光AFC产生荧光的强弱成正比，故可定量产生荧光的强弱成正比，故可定量检测检测n 2

43、. 蛋白印迹法蛋白印迹法n Caspases作用底物的检测作用底物的检测n PARP89kD的检测的检测第六十八页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测四四. 凋亡凋亡(dio wn)相关蛋白分析相关蛋白分析n1. Bcl-2家族家族n 促进凋亡：促进凋亡：Bax, Bal, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik, Bim, Hrk, Bok等等n 抑制凋亡：抑制凋亡：Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl-1等等n 均含有均含有BH(Bcl-2 homology)结构域，通过结构域，通过(tnggu)此结构域以二聚体形式调控凋亡。此结构域以二聚体形式调控凋亡。

44、n2. 其他相关蛋白其他相关蛋白n p53, Myc, Fas等等 第六十九页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测五、流式细胞分析五、流式细胞分析(fnx)（Flow Cytometry，FCM） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒动状态中的单细胞或生物颗粒(kl)进行多参数、进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。现代细胞分析技术。第七十页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测FCM分析细胞分析细胞(xbo)凋亡的方凋亡的方法法n一一. 细胞形态细胞形态(xngti)分析分析n二二. 细胞膜结构与功能改变分析细胞膜结构与功能改变分析n三三. 细胞细胞DNA含量分析含量分析n四四. TUNEL法法第七十一页，共七十二页。细胞凋亡及机制检测内容(nirng)总结细胞凋亡（科普诗） apoptosis。3.在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白，使该蛋白获得或丧失某种生物学功能。Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合导致靶细胞走向凋亡。1.氧自由基引起的DNA损伤可激活P53基因(jyn)引起细胞凋亡。3.激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因(jyn)的转录。6.病毒致病 病毒表达抗凋亡蛋白。肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关，还与凋亡障碍有关第七十二页，共七十二页。