邓道文毕业论文

《邓道文毕业论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《邓道文毕业论文（25页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、 本科毕业论文（设计）论文（设计）题目：拮抗菌Gzf-2固态发酵产孢条件的 筛选及优化 学 院： 生命科学学院 专 业： 生 物 技 术 班 级： 091班 学 号： 0907040157 姓 名： 邓 道 文 指导教师： 葛 永 怡 2013 年 6 月 8 日 贵州大学本科毕业论文（设计）诚信责任书本人郑重声明：本人所呈交的毕业论文（设计），是在导师的指导下独立进行研究所完成。毕业论文（设计）中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。特此声明。论文（设计）作者签名： 日 期： 贵州大学毕业论文（设计）目录摘要.Abstract.第一章 前言. 1 木霉的概述. 2

2、 木霉发酵的影响因素. 3 我国木霉发酵的研究状况. 4 研究的目的及意义.第二章 材料与方法. 1 实验材料. 1.1 实验菌株. 1.2 实验试剂. 1.3 实验器材. 1.4 培养基. 2 实验方法. 2.1 菌株的活化. 2.2 孢子悬浮液的制备. 2.3 产孢量的测定方法. 2.4 单因素条件的优化. 2.4.1 温度的筛选. 2.4.2 接种量的筛选. 2.4.3 pH值的筛选. 2.4.4 碳源的筛选. 2.4.5 氮源的筛选. 2.4.6 其他添加量的筛选. 2.4.7 光照的筛选. 2.4.8 搅拌的筛选.第三章 结果与分析. 1 单因素优化结果. 1.1 温度对绿色木霉产孢

3、量的影响. 1.2 接种量对绿色木霉产孢量的影响. 1.3 pH值的筛选对绿色木霉产孢量的影响. 1.4 碳源对绿色木霉产孢量的影响. 1.5 氮源对绿色木霉产孢量的影响. 1.6 其他添加量对绿色木霉产孢量的影响. 1.7 光照对绿色木霉产孢量的影响. 1.8 搅拌对绿色木霉产孢量的影响. 2 Plackett-Burman（PB）试验 3 最陡爬坡试验 4 中心复合试验 4.1 中心复合试验结果 4.2 二次回归模型的建立及检验 4.3 响应曲面的拟合 4.4 最优条件的确定 5 最优条件的验证试验第四章 小结与讨论.参考文献.致谢.拮抗菌Gzf-2固态发酵产孢条件的筛选及优化摘要本实验运

4、用Minitab软件，将Plackett-Burman试验设计与响应面分析法相结合，采用麸皮固态发酵，对绿色木霉Gzf-2菌株的产孢条件进行优化，结果表明，光照及搅拌对提高Gzf-2菌株产孢量有较大的显著效应。优化后的培养条件为，在麸皮培养基的基础上，加入MgSO4 1.6、葡萄糖10%、（NH4）2SO4 1、CaCO3 1.6%、CaSO4 0.8%，每日光照12.17h，培养47.36h后进行搅拌，在此条件下，Gzf-2菌株产孢量达到5.93109 个/mL，比优化前提高了2.34倍。关键词：绿色木霉；固态发酵；Plackett-Burman试验设计；响应面分析法Screening an

5、d optimization of antagonistic bacteria GZF-2 solid-state fermentation conditions of sporulationAbstractIn this study, the use of Minitab software, the Plackett-Burman experimental design and response surface analysis combined bran solid-state fermentation of Trichoderma viride Gzf-2 strains sporula

6、tion conditions to optimize the results show that the light and stir to improveGzf-2 strain sporulation significant effect. Optimized culture conditions, on the basis of the bran medium, add MgSO4 1.6 , glucose 10%, (NH4) 2SO4 1 , CaCO3 1.6%, CaSO4 0.8% daily illumination 12.17h culture 47.36h stirr

7、ing, in this condition, Gzf-2 strain sporulation reached 5.93 109 / mL and 2.34 times higher than before.Keywords:Trichoderma viride;solid-state fermentation; Plackett-Burman experimental design; Response Surface Methodology.第一章 前言1 木霉（Trichoderma spp）的概述 木霉菌(Trichoderma spp)为丝状真菌，属于半知菌类，丝孢纲, 丝孢目, 丛

8、梗孢科, 它的有性阶段为子囊菌亚门,核菌纲,肉座目, 肉座科的肉座菌属；广泛存在于植物叶面、根际种子、球茎和土壤等生态环境中。木霉菌落生长速度很快，棉絮状或致密丛束状，菌落表面多数是绿色的，有一些是黄色的。菌丝透明，有隔，分支多。厚垣孢子有些有，有些无，间生或顶生，无色，壁光滑。分生孢子梗是菌丝的短侧枝，分生孢子梗上对生或互生分支，分支上又可继续分支，形成二级和三级分支，分支角度成锐角或几乎成直角，分支的末端即为小梗。分生孢子由小梗相继生出而靠黏液把它们聚集成球形的孢子头，分生孢子近球形或椭圆形，壁光滑或粗糙，透明或亮黄色。木霉菌有很多种类，如绿色木霉（T.viride）、钩状木霉（T.ham

9、atum）、康氏木霉（T.koningii）、哈茨木霉（T.harzinum）长枝木霉（T.longibrachiatum）、深绿木霉（T.atroviride）、顶孢木霉（T.fertile）1等。绿色木霉（T.viride）菌株在PDA平板上生长快速，初期菌丝成白色致密的基质菌丝，；4d左右菌丝成蜘蛛网状的气生菌丝，绿色，菌落反面为无色，产生大量孢子，孢子为厚垣孢子。菌丝透明，壁光滑，有隔，分枝多；厚垣孢子间生于菌丝中或顶生于短侧枝上，多数为球形，极少数为椭圆形，瓶梗对生或轮生，次级分枝多，3-5个轮生，基部收缩，中间膨大，终极瓶梗不收缩，基部延长。孢壁具有明显的小疣状突起，在显微镜下单个

10、孢子为淡绿色。木霉菌的适应性强，生长迅速，能产生大量的孢子和抑菌代谢产物，在植物病原真菌如烟草黑胫病菌、镰刀菌、链格孢菌、丝核菌、毛盘菌、轮枝孢菌、腐霉菌、肉座壳菌等病害的生物防治中有广泛的研究，是世界公认的高效生防菌株。木霉是一种重寄生真菌，其菌丝与寄主的菌丝平行、趋向生长、识别、接触、缠绕、附着、插入寄主菌丝内等方式进行寄生，直接从寄主菌丝体内吸取营养物质，从而影响寄主的生长与发育。木霉在寄生过程中还分泌产生一些抑菌代谢产物和细胞壁降解酶类，如木霉素、抗菌肽、绿胶霉素、胶毒素、绿毛菌醇、绿粘帚霉毒素、绿毛霉素及孢壁降解酶（纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶、葡聚糖酶等）等抑制其他病原菌的生长，以达

11、到防治的目的。2 木霉发酵的影响因素2.1 碳源木霉利用碳源能力很强，不仅能够利用葡萄糖、蔗糖，而且对多糖（纤维素、半纤维素）和相关多聚物（如几丁质）有较强的降解能力。不同碳源物质对木霉的生长及产孢有一定的影响，多数木霉对葡萄糖的利用率较高；有研究发现，不同碳源物质还影响木霉的生物防治效果。2.2 氮源木霉可以利用简单和复杂的氮源，如铵盐、硝酸盐、蛋白胨、氨基酸等。在有碳水化合物作碳源的培养基中，木霉优先利用铵盐类。氮源能促进菌丝生长，在提高木霉产孢量的发酵培养基中应控制其氮源用量，不能过多。2.3 矿质元素多数木霉可以利用无机磷酸盐和硫酸盐作为磷和硫的来源，还有一些矿质元素对木霉的营养生长和

12、产孢也产生影响，如K、Ca、Fe、Mn、Cu、Zn、Mo等。2.4 生长因子和维生素生长因子和维生素对于大多数野生型木霉不是必须营养成分，但生物素和维生素B1能够促进木霉的生长。2.5 二氧化碳和氧气木霉是专性需氧菌，氧气的供应及线粒体的活性对纤维素酶的产生有一定的影响，低于最适氧分压的条件有利于纤维素酶的产生。二氧化碳会影响木霉的生长和产孢，二氧化碳分压的升高能促进木霉菌丝的生长。2.6 其他因素接种量、pH值、初始含水量、培养温度、光照、培养时间等因素对木霉的生长和产孢也有极大的影响，在进行发酵试验的过程中应考虑到这些因素的影响。3 我国木霉发酵的研究状况孙斐2等以麸皮和玉米芯为固态发酵培

13、养基主要的原料，筛选拟康氏木霉SDTP1菌株的最大产孢量。采用单因素试验法，对麸皮与玉米芯的比例，培养基含水量，接种量，其他添加剂进行筛选优化。结果表明，麸皮与玉米芯按8:2，含水量为55%-60%，加入0.1%KNO3，1%CaSO4,1%蔗糖，接种量为10%；在28，以3m/s速度通无菌空气的发酵条件下培养120h，其产孢量达到1109以上。他们还采用浅盘式固态发酵在优化的单因素条件下模拟大规模发酵过程，结果表明，每克发酵产物产孢量达到1.34109个。夏斯琴3等以绿色木霉T4为菌株，以麸皮作为固态发酵基质，通过单因素试验和正交试验，研究碳源、氮源、初始接种量、培养温度及初始含水量及微量元

14、素对该菌株产孢的影响。结果表明，在麸皮培养基的基础上，加入10%葡萄糖，1(NH4)2SO4，2KH2PO4，4MgSO4，6CaCO3，初始接种量1105个.(g干基质)-1，初始含水量60%，28发酵培养7d，产孢量达到4.471010个.(g干基质)-1。肖龙龙4等对绿色木霉的发酵条件进行筛选，以察氏培养基为基础培养基，对其碳源、氮源、生物激活剂、培养温度、发酵时间进行筛选。结果表明，加入3硝酸钠,1%蔗糖，2生物激活剂，在30下培养4d，该绿色木霉的产孢量较高。刘霞5等研究不同发酵条件对绿色木霉抑菌的效果的影响，考察了不同碳源、氮源、初始pH值、接种量、装样量、发酵天数等因素。结果表明

15、，最适发酵条件为：3%葡萄糖，0.2%(NH4)2SO4，初始pH为6，接种量为6%，装样量为60mL/250mL，发酵5d，在此条件下其抑菌效果最佳。申屠旭萍6等在单因素试验的基础上，采用Plackett-Burman试验设计与响应面分析法，对哈茨木霉生产木霉素的发酵条件进行优化。结果表明，葡萄糖浓度42.8g/L，牛肉膏15g/L，蛋白胨50g/L，MnCl0.5g/L，NH4Cl0.1g/L，接种量1.39mL，发酵时间102.88h，pH6.0，温度28，转速180r/min，在该发酵条件下，木霉素的产量可达147.44mg/L。黄雪莲7等采用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化，

16、在前期试验的基础上，对葡萄糖、丙氨酸、磷酸二氢钾3个显著因素的添加量进行中心组合试验，通过试验建立二次回归方程，运用软件对试验数据进行处理和分析，应用响应面分析法进行优化。结果表明，葡萄糖、丙氨酸、磷酸二氢钾三者添加量分别为2.11g/dL、0.15g/dL、0.30g/dL时，绿色木霉菌菌落直径达到78.00mm，与预测值77.87mm较接近。李淑瑞8等对绿色木霉液体培养基发酵产壳聚糖酶的培养基利用响应面方法进行优化试验，筛选得到了最佳产酶培养基组成：麸皮0.5%、棉籽饼粉4.79%、 Avicel 2.56%、玉米芯1.03%、KH2PO4 0.2%、MgSO4 0.03%、(NH4)2S

17、O4 0.2%、CaCl2 0.03%, pH自然,在此条件下，绿色木霉的最大产壳聚糖酶活为2.00IU/mL。4 研究的目的及意义多数对木霉发酵的研究仅限于其单因子法和正交试验设计法进行培养基的优化。单因素筛选只能考察一种因素的影响，而考察的因素间会存在交互作用，该方法并非总能筛选出最优条件。正交试验注重如何合理安排试验，可以同时考察几种因素，寻找最佳因素水平组合，但不能以一个明确的函数表达式体现因素和响应值之间的关系，从而不能得到最佳试验优化条件12。而运用Minitab软件，将Plackett-Burman试验设计与响应面分析法相结合，对筛选出的单因素进一步优化。在其他微生物发酵的优化中

18、，已广泛运用PB试验和响应面法相结合进行发酵培养基的优化，得到了良好的效果。麸皮是农副产品，来源丰富、价格低廉，且富含纤维素和半纤维素，是微生物生长的优良碳源。以麸皮作为木霉发酵的基础培养基，大大降低了成本，产品干孢子形式存在，相对液体发酵，能长时间储存和运输，并具有较高的活力，作为固体制剂，在大田试验使用上比较方便。因此，今后在木霉发酵中，以麸皮作为基础培养基，进行单因素试验筛选后，将Plackett-Burman试验设计与响应面分析法相结合，对筛选出的单因素进一步优化，这一方法将得到广泛运用。贵州省毕节烟叶产区烟草赤星病比较严重，绿色木霉对赤星病有较好的拮抗效果。本实验室筛选出Gzf-2菌

19、株对该烟区的赤星病有较好的拮抗作用；为了获得大量Gzf-2菌株的生防菌剂，本试验对其固态发酵产孢条件进行筛选。经过单因素的筛选优化麸皮培养基，Gzf-2菌株的产孢量有所提高，但任然有提高的空间，试验通过Plackett-Burman试验设计与响应面分析法相结合对其进一步优化，得到了较好的效果。绿色木霉对烟草赤星病的生物防治减少农药的使用，从而降低了对环境的污染和人体健康的危害；本试验为今后的大田试验生防菌剂的大量制备奠定基础。第二章 材料与方法1 实验材料1.1 实验菌株 实验所用菌株绿色木霉由微生物实验室从毕节地区烟地分离保藏，保种编号为Gzf-2。1.2 实验试剂试剂名称 产地葡萄糖 成都

20、金山化学试剂有限公司蔗糖 成都金山化学试剂有限公司淀粉 天津市协和昊鹏色谱科技有限公司（NH4）2SO4 成都金山化学试剂有限公司蛋白胨 上海盛思生化科技有限公司大豆蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司KNO3 成都金山化学试剂有限公司NaNO3 重庆茂业化学试剂有限公司CaSO4 成都科龙化工试剂厂MgSO4 重庆茂业化学试剂有限公司CaCO3 成都金山化学试剂有限公司NaCl 重庆川东化工（集团）有限责任公司KCl 重庆川东化工（集团）有限责任公司1.3 实验器材仪器 型号 产地高压灭菌锅 LDZX50KBS型 上海申安医疗器械厂光学显微镜 ECLIPSE E100 NIKON公司超净工

21、作台 SWCJIFD型 蘇州净化有限公司精密电子天平 BS110S 北京赛多利天平公司电热恒温培养箱 HH.B11.420 上海跃进医疗器械厂光照培养箱 SPX-300B-G 上海博讯实业有限公司海尔冰箱 BCD-215196TJ 青岛海尔股份有限公司托盘天平 HC-TP11-5 上海精科天平公司血球计数板 XB.K.25 上海市求精生化试剂仪器有限公司其它常用仪器：移液枪、试管、培养皿等。1.2 培养基马铃薯培养基：简称PDA ，马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000mL、pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖及琼脂，溶化后补水至1000mL，121

22、灭菌30min。麸皮培养基：麸皮30g、水30mL、pH自然。称取麸皮30g，按含水率50%比例加水30mL，拌匀，静置6h-8h，115灭菌30min。2 实验方法2.1 菌株的活化从4保存的冰箱中将Gzf-2菌株接种于PDA培养基上，于28恒温培养箱进行培养活化。2.2 孢子悬浮液的制备将活化培养5天后的Gzf-2菌株用10mL无菌水将孢子洗下，倒入90mL烧杯中，取其中1mL孢子悬浮液稀释10倍于、100倍，用血球计数板计数，记录数据，贴好标签，将孢子悬浮液保存于4冰箱中待用。2.3 产孢量的测定方法血球计数板测定产孢量：计数公式：以25个中方格的计数板为例，设5个中方格的总菌数为A，菌

23、液稀释倍数为B，则1mL菌液中的总菌数=2510B。计数步骤：a、将血球计数板用自来水冲洗干净，用洗耳球或吹风机吹干；b、取干净的盖玻片盖在计数室上，用移液枪将摇匀的稀释菌液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，再用镊子轻压盖玻片，以免菌液过多将盖玻片顶起而改变了计数室的容积，加样后静置5min，使菌体自然沉降；c、显微镜下观察计数：计数原则，计上不由下，计左不由右；d、清洗计数板。2.4 单因素条件的优化2.4.1温度的筛选麸皮培养基：麸皮与自来水按1：1的比例拌匀，静置6-8h，灭菌（本实验用培养皿装麸皮，每个实验处理三个重复，共称麸皮30g，加水30mL，分装到

24、三个培养皿中）。灭菌前后麸皮含水量可能改变，经检验，灭菌前后麸皮培养基含水量变化不大（减少0.2g左右），可忽略。将保存在冰箱中的孢子悬浮液稀释为1107个/mL2mL接种于麸皮培养基上，在5、10、15、20、25、28、30、35、40恒温培养5天（每个处理3个重复），用血球计数板测定产孢量。 2.4.2接种量的筛选将麸皮按含水率为50%拌湿，静置6-8h，灭菌；按接种量为1108个/mL、1107个/mL、1106个/mL、1105个/mL、1104个/mL、1103个/mL、分别接种到麸皮培养基中，28恒温培养，5天后测定产孢量（每个处理三个重复）。2.4.3初始pH值得筛选称取一定量

25、的麸皮，含水率为50%；将水的pH值用1mol/LNaOH、1mol/LHCl调为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0后与麸皮拌湿，静置6-8h，灭菌；接种（1107个/mL2mL），28恒温培养，5天后测定产孢量。2.4.4碳源的筛选 2.4.4.1 不同碳源的筛选 向麸皮培养基中分别加入10%淀粉；10%蔗糖；10%面粉；葡萄糖 10%；对照组只加麸皮；每个处理三个重复，含水率为50%；搅拌静置灭菌，接种，28恒温培养，5天后测定产孢量。2.4.4.2 碳源添加量的筛选得到最佳碳源葡萄糖，其添加量分别为5%

26、、10%、15%、20%，方法同上。2.4.5氮源的筛选2.4.5.1 不同氮源的筛选有机氮源：蛋白胨 1%；大豆蛋白胨 1%；豆粉10%；无机氮源：(NH4)2SO4 1:；NaNO3 1；KNO3 1 ；对照组只加麸皮；每个处理三个重复，将所加药品溶于水中再与麸皮拌湿（含水率为50%）静置6-8h，灭菌；接种（1107个/mL2mL），28恒温培养，在第5天测定产孢量。2.4.5.2 氮源添加量的筛选得到最佳氮源(NH4)2SO4，其添加量分别为0.5 、1 、5 、1% ，方法同上。2.4.6其他添加量的筛选2.4.6.1 MgSO4 的添加量 向麸皮培养基中分别加入1、2、3、4的Mg

27、SO4；含水率为50%；搅拌静置，灭菌；接种，28恒温培养，5天后测定产孢量。2.4.6.2 CaCO3 的添加量向麸皮培养基中分别加入1%、2%、3%、4%的CaCO3，方法同上。2.4.6.2 CaSO4的添加量向麸皮培养基中分别加入1%、2%、3%、4%的CaSO4，方法同上。2.4.7 光照的筛选将麸皮按含水率为50%加水拌匀静置，灭菌；接种，一组光照培养，另一组无光照培养，5天后测定产孢量。2.4.8 搅拌的筛选将麸皮按含水率为50%加水拌匀静置，灭菌；接种，分别培养24h、48h、72h、96h搅拌一次后继续培养，5天后测定产孢量。第三章 结果与分析1 单因素优化结果1.1 温度对

28、绿色木霉产孢量的影响温度的影响温度()51015202528303540产孢量（109个/mL)000.10.171.52.751.81.30培养温度在5、10、40下，没有观察到菌丝的生长，可能是温度过低和过高，抑制了菌丝的生长；培养温度在15到20之间，菌丝生长缓慢，产孢时间比较晚，产孢量都比较低；培养温度在25到30之间，菌丝生长快速，产孢时间较早；在30到35之间，菌丝生长逐渐缓慢，产孢量降低。由表可以看出，培养温度在28时，产孢量最高。1.2 接种量对绿色木霉产孢量的影响接种量的影响接种量（个/mL）110811071106110511041103产孢量（109个/mL)1.752.

29、92.552.53.22.4接种量在1104个/mL和1103个/mL时，菌丝生长相对较慢，其余接种量菌丝生长较快，由表可以看出，接种量在1107个/mL时，产孢量最大，由此可知接种量的多少也可影响菌丝生长速度和产孢量。1.3 pH值的筛选对绿色木霉产孢量的影响 初始 pH值的影响pH值1234567891011121314产孢量（109个/mL）2.652.93.33.64.54.34.554.053.653.552.92.6201.4 碳源对绿色木霉产孢量的影响 碳源的影响碳源淀粉10%蔗糖10%面粉10%葡萄糖5%葡萄糖10%葡萄糖15%葡萄糖20%对照产孢量（109个/mL)3.053

30、.33.352.053.62.851.72.851.5 氮源对绿色木霉产孢量的影响 氮源的影响氮源蛋白胨大豆蛋白胨豆粉硫酸铵硝酸钠硝酸钾对照产孢量（109个/mL)2.22.51.53.51.72.052.751.6 无机盐对绿色木霉产孢量的影响无机盐离子的影响无机盐（5%）硫酸铵碳酸钙磷酸二氢钾硫酸镁氯化钾氯化钠对照产孢量（109个/mL)1.152.152.32.450.140.192.351.7 光照对绿色木霉产孢量的影响1.8 搅拌对绿色木霉产孢量的影响2 Plackett-Burman（PB）试验Plackeet-Burman试验设计方法是一种两水平的试验设计方法，它能以最少的试验次

31、数体现出各因素的主效应，能快速地从中筛选出最重要的几个因素3。根据绿色木霉生长所需的营养，结合前期的单因素试验，本试验选用试验次数N=13的试验设计，对MgSO4 、葡萄糖、（NH4）2SO4 、CaCO3 、CaSO4、光照、搅拌共7个因素进行试验，筛选出影响绿色木霉产孢的重要因素，确定最佳试验条件。试验设计和各因素效应及评价见表1和表2。表1 PB试验因素水平水平因素X1X2X3X4X5X6X7MgSO4 搅拌次数有无光照葡萄糖（NH4）2SO4 CaCO3 CaSO4-11.60无10%0.81.6%0.8%121有12.5%12%1%PB试验设计及结果如表2，用Minitab软件对试验

32、数据进行分析，得到各因素对响应值Y（绿色木霉产孢量，个/mL）的影响效果分析如表3。表2 PB试验设计及结果序号X1X2X3X4X5X6X7Y(个/mL)1-11-1-1-1111.3410921-11-1-1-111.8410931-1-1-11118.481084-1-1-1111-17.361085-1111-1112.371096-1-1-1-1-1-1-13.011097111-111-12.141098-1-1111-111.951099-111-11-1-11.011091011-111-112.37109111-111-11-12.321091211-11-1-1-12.881

33、09表3 各因素效应及评价变量代码变量 统计分析效应标准误TP重要性X1MgSO4-5.2331071.264108 -0.21 0.8466X2搅拌次数8.2101081.264108 3.250.0312X3有无光照1.0511091.264108 4.16 0.0141X4葡萄糖1.8031081.264108 0.710.5154X5（NH4）2SO49.7001071.2641080.380.7215X6CaCO3 -9.6671061.264108-0.040.9717X7CaSO42.611091.2641081.030.3603由表3的各因素效价评价可知，MgSO4 、葡萄糖、

34、（NH4）2SO4 、CaCO3 、CaSO4对Gzf-2产孢量无显著影响，搅拌和光照对Gzf-2产孢量有显著影响。3 最陡爬坡试验根据Plackeet-Burman试验结果分析，确定主效应因素，对主效应因素进一步梯度筛选，进行最陡爬坡试验。搅拌和光照为主效应因素,根据搅拌和光照两个因素效应的大小设定变化方向和步长进行最陡爬坡试验，其设计及结果见表4。表4 最陡爬坡试验设计及结果序号光照/h搅拌/h产孢量(个/mL)14123.7110928243.75109312485.70109416724.66109520963.611094 中心复合试验根据最陡爬坡试验结果，得到中心点，按方程Z=X1

35、-X2/X（其中，Z为水平值，X1为水平值对应因素的求值，X2为中心点因素对应值，X为因素阈值）4设定中心组合试验自变量水平及中心组合试验设计。4.1 中心复合试验结果根据表4试验结果设计中心组合试验，有两个自变量，为使拟合响应方程具有旋转性和通用性，选择中心试验数为5，星号臂长为1.4145。试验设计及结果如表5、表6。表5 中心组合试验变量及其水平因素水平-1.414-1011.414x1，光照/h9.210121414.8x2，搅拌/h3136486065表6 中心组合试验设计及结果序号 因素产孢量x1x21-1-14.7210921-15.381093-114.771094114.93

36、1095-1.41404.9610961.41404.8310970-1.4145.04109801.4145.131099005.7510910005.9810911005.8810912005.9410913005.971094.2 二次回归模型的建立及检验根据Minitab软件得到拟合二阶模型公式：Y=5.90109+7.95107X1-3.41107X2-5.15108X12-1.25108X1X2-4.20108X22 ；根据此公式预测得到，当X1=0.08373，X2=-0.05311时Ymax=5.911097.54107 ；即每日光照12.17h，47.36h搅拌时，绿色木霉G

37、zf-2的最大产孢量为5.911097.54107 个/mL。4.3 响应曲面的拟合应用Minitab软件响应面分析可作出光照和搅拌的三维空间响应面图和二维等高线图，如图1、图2。图1图24.4 最优条件的确定5 最优条件的验证试验为了验证试验模型的可行性，在初始条件和最佳发酵条件（MgSO4 1.6、葡萄糖10%、（NH4）2SO4 1、CaCO3 1.6%、CaSO4 0.8%，每日光照12.17h，培养47.36h后进行搅拌）下进行验证试验。培养7天后，测得初始条件下的产孢量为2.53109 个/mL；优化后的产孢量为5.93109 个/mL，与模型预测值相近。优化后比优化前的产孢量提高

38、了2.34倍。第四章 小结与讨论参考文献1 孙军，段玉玺，吕国忠.辽宁木霉属真菌的形态分类研究J.菌物研究，2006，4（2）：38-44.2 孙斐，陈靠山，张鹏英.固态发酵麸皮和玉米芯生产拟康氏木霉孢子的研究J.中国农学通报，2010,26（6）：236-239.3 夏斯琴，王伟.绿色木霉T4的固体发酵工艺及其制剂稳定性的研究J.化学与生物工程，2008,25（12）：52-56.4 肖龙龙，张崇玉，付责中.绿色木霉产孢条件的优化J.山地农业生物学报，2012,31（1）：036-039.5 刘霞，王燕，安磊等.绿色木霉发酵条件的优化J.中国食品添加剂试剂研究，2009，（3）:100-103.6 申屠旭萍，石一，俞晓平.哈茨木霉发酵产木霉素的培养条件优化J.中国生物防治，2009,25（4）：348-354.7 黄雪莲，于新.响应面法优化绿色木霉菌培养基J.食品与生物技术学报，2011,30（5）:740-744.8 李淑瑞，余晓斌，孙婷.绿色木霉产壳聚糖酶培养基J.食品工业科技，2009,30（10）：178-180.致谢