维生素类药物分析讲义PPT课件

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1、维生素： 是维持人体正常代谢机能所必需的 微量营养物资。 人体不能合成维生素。脂溶性 VitA、D、 E、K1 等 水溶性 VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺VitPP第1页/共88页CH3CH3CH2ORCH3CH3CH3-H 维生素A醇-COCH3 维生素A醋酸酯-COC15H31 维生素A棕榈酸酯R :第一节 维生素A的分析一、结构与性质具有共轭多烯醇侧链的环己烯123456789第2页/共88页第3页/共88页v 具有UV吸收v 存在多种立体异构化合物v 易发生脱氢、脱水、聚合反应v 易被氧化性质VitA紫外线、O2、氧化剂环氧化物OVitA醛或酸第4

2、页/共88页维生素维生素A 全反式全反式 325.5 100% 新维生素新维生素Aa 2-cis 328 75%新维生素新维生素Ab 4- cis 320.5 24%新维生素新维生素Ac 2，4-dicis 310.5 15%异维生素异维生素Aa 6-cis 323 21%异维生素异维生素Ab 2,6-dicis 324 24%max 相对生物效价结构第5页/共88页CH2OHCH2去氢脱水VitA2VitA3CH2OHCH2OHCH3聚合鲸醇CH3CH3CH2ORCH3CH3CH3VitA第6页/共88页环氧化物OCH2OHVitA醛HOCVitA酸COOH第7页/共88页（一）三氯化锑反应

3、CHCl3二、鉴别试验条件 无水、无醇VitASbCl3蓝色紫红色（二）UV法BPVitA无水乙醇HCl去水VitAmax为326nm一个吸收峰max为350390nm三个吸收峰第8页/共88页CH3CH3CH2ORCH3CH3CH3CH2VitA去水VitA（VitA3）第9页/共88页第10页/共88页BP、 USP 对照品法 显色剂 磷钼酸（三） TLC法第11页/共88页三、含量测定（一） UV法立体异构体氧化产物及光照产物合成中间体去氢维生素A（ VitA2）去水维生素A（ VitA3）三点校正法第12页/共88页VitA的含量表示-生物效价（IU/g）1IU = 0.344ug全反

4、式VitA醋酸酯 = 0.300ugVitA醇VitA醋酸酯VitA醇1IU0.344ug0.300ug效价（1IU/g ）2.907 1063.33 1061900328nm1530325nm18201830(换算因子)International Unit第13页/共88页结果计算公式为：效价 = 换算因子第14页/共88页第一法 等波长差法 测定对象 VitA醋酸酯 328 - 316 = 340 - 328第二法 等吸收度法(皂化法) 测定对象 VitA醇6/7A1 = A2 = A3波长的选择三点校正法第15页/共88页三点校正法 第一法 等波长差法 316328340第16页/共88

5、页第二法等吸收比法A2=A3=6/7A1第17页/共88页(nm)300316328340360Ai/A3280.5550.9071.0000.8110.299测定方法1、第一法 维生素A醋酸酯按表中各波长分别测定吸收度，计算Ai/A328规定吸收度比值第18页/共88页判断方法（1）若max=326329nm, (Ai/A328)测- 规定值 0.02 则用A328处的测得值计算。 供试品中效价（IU/g）=1900（2）若max=326329nm, 有(Ai/A328)测- 规定值 0.02 则用校正公式校正后计算f值再判断： A328（校正）=3.52（2A328-A316 - A340

6、 ）第19页/共88页若f值在3%以内，仍以未校正的A328计算。若f值在-15%-3%以内，用校正后的A328（校正）计算。 供试品中效价（IU/g）=1900若f值3%或 0.73 ，则用色谱法测定。max 第27页/共88页（二）三氯化锑比色法 标准曲线法蓝蓝色色 3SbClVitA优点 简便 快速max 618nm620nm SbOClSbClOH32缺点呈色不稳定 （5 10s内）水分干扰与标准曲线温差1专属性差三氯化锑有腐蚀性第28页/共88页（三）HPLCRP-HPLC同时测定人血清中Vit A和Vit E含量色谱条件 色谱柱：C18 流动相：甲醇-水 流速：1.2ml/min

7、检测波长与AUFS： 08min(330nm,0.25AUFS); 8min后(292nm,0.05AUFS) 内标：Vit A 酯Vit AVit E第29页/共88页苯并二氢吡喃环，带有脂肪侧链R1、R2和乙酰化酚羟基，又称生育酚醋酸酯。一、结构与性质第二节 维生素E的分析CH3CO*OR1OR2CH3第30页/共88页名称R1R2相对活性-生育酚-生育酚 -生育酚 -生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1第31页/共88页性质：1、苯环-UV法2、酯键 -易水解，水解产物生育酚易被氧化。3、有手性碳原子 -有立体异构体。天然产品一般是d型（右旋），合成品是消旋体（

8、dl型）CH3COOCH3CH3CH3CH3CH3CH3H3CH3COVit E (dl-Tocopheryl Acetate)第32页/共88页7515（一）硝酸反应橙红色二、鉴别试验VEHNO3生育红CH3HOOCH3C16H33CH3H3C生育酚HNO3OOCH3C16H33H3CCH3O生育红（橙红色）第33页/共88页（二）三氯化铁联吡啶反应VEKOH生育酚Fe3+对-生育醌Fe2+2，2-联吡啶血红色CH3HOOCH3C16H33CH3H3C生育酚OOH3CCH3OHCH3C16H33CH3Fe3+对-生育醌第34页/共88页红色+23Fe3+2FeNNNN（三） UV法0.01%

9、无水乙醇中max = 284nm min = 254nm = 41.045.5%cmE11第35页/共88页维生素EUV图第36页/共88页薄层板 硅胶G展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1）显色剂 硫酸（105 5） VitE Rf = 0.7TLC法（四）第37页/共88页无水乙醇2Ce4+ 2Ce3+ 利用生育酚的易氧化性（一） 三、杂质检查VitE醋酸酯中生育酚的检查：铈量法滴定剂：硫酸铈滴定液 Ce(SO4)2 （0.01mol/L）终点指示：二苯胺（亮黄灰紫）二氢吡啶类药物：邻二氮菲-亚铁吩塞嗪类药物：自身指示法第38页/共88页 取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液

10、1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过 1.0ml。例%100WTV% 限限量量2.15%15. 2%1001 . 0002154. 00 . 1% 限量限量规定限量第39页/共88页若硫酸铈液浓度不是0.01000mol/L，应重新计算硫酸铈的消耗量（二）注意设：应消耗硫酸铈液 V ml0.011.0 实际浓度 V硫酸铈实际浓度硫酸铈实际浓度）（0 . 101. 0mlV 第40页/共88页四、含量测定GC法 加校正因子内标法 ChP（一）1、1、VitE测定的色谱条件载气：N2固定相：硅烷化硅藻土上涂布硅酮（OV-17）柱温：265检测器：氢火

11、焰离子化检测器(FID)内标：正三十二烷 n 500 R2第41页/共88页内标物是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的量接近ChP和BP 内标 正三十二烷USP 内标 十六酸十六醇酯第42页/共88页第43页/共88页2 测定供试液：样品+内标对照液：对照+内标（1）系统适用性试验 对照液（对照+内标）进样 理论塔板数N应不低于500，VE与内标峰分离度应大于2。tR N = 5.54 W1/2H( )2 R =2(tR1- tR2)Wb1+ Wb2第44页/共88页（2）校正因子的测定 对照液（对照+内标）进样（3）样品测定 供试液（样品+内标）进样 f = A

12、s/ms Ar/mr f = As/ms Au/mumu = f Au As/mss -内标r -对照第45页/共88页样品： dl生育酚固定相：十八烷基硅烷键合硅胶流动相：甲醇-水（49 ：1）检测波长：292nm（二）RP-HPLC法（外标法）JP用峰高计算含量：W生育酚 = W对 H对H样第46页/共88页（三）FLD同步荧光扫描法血清中维生素E的测定：维生素E和溶剂的拉曼光谱重叠激发波长295nm第47页/共88页氨基嘧啶环氨基嘧啶环CH2 噻唑环噻唑环(季铵碱季铵碱)第四节 维生素B1的分析一、结构与性质NSCH3CH2CH2OHNNH3CNH2CH2+HClCl-第48页/共88页

13、1、共轭双键：UV （max = 246nm）性质:可与酸成盐；非水碱量法4、嘧啶环N原子可与生物碱沉淀剂反应（鉴别和硅钨酸重量法）3 、 碱性N原子：嘧啶环上伯氨基 噻唑环上季铵2、噻唑环含S原子：硫色素荧光法 分解产物与Pb(AC)2反应第49页/共88页荧光消失蓝色荧光硫色素正丁醇提取NaOHVitB 1（一）硫色素反应 ChPK3Fe(CN)6 + 4NaOHH3K4Fe(CN)6 + Na4Fe(CN)6 + O2+ 2H2O二、鉴别试验K3Fe(CN)6第50页/共88页CH2NNH3CNH2CH3NNaSC2H4OHONNH3CNH2HClNSCH3C2H4OHCH2NaOHNN

14、H3CNNNaSCH3C2H4OH-H2O第51页/共88页硫色素SCH3C2H4OHNNH3CNNH 环环合合NNH3CNNSCH3C2H4OH(O)-2H第52页/共88页 4242HgIHBHgIK 淡黄淡黄H+ 2KIIIHIB2 红红色色H+白白色色硅硅钨钨酸酸 H+ OH4WO12OHSiOB23222 白白色色扇扇形形苦苦酮酮酸酸 H+（二）沉淀反应VitB1第53页/共88页 OHNHAgNOAgCl白白3HNO蓝蓝淀淀粉粉试试纸纸 KIMnOCl H S元素反应Cl-反应（三）其他反应VitB1NaOHNa2SPb(AC)2PbS(黑色) 第54页/共88页三、含量测定加入醋

15、酸汞消除盐酸盐的干扰。指示剂：喹那啶红亚甲蓝（紫红天蓝）（一）非水溶液滴定法 ChP BP第55页/共88页（二）UV法中国药典中VitB1片剂和注射液均采用本法测定含量。max = 246nm 第56页/共88页（三）硅钨酸重量法 ChP（90年版）以前用2C12H17ClN4OSHCl + SiO2 12WO326H2OH+(C12H17ClN4OS)2SiO2(OH)212WO34H2O + HCl+ 4H2O白色 第57页/共88页2337.273479.22VitB1% = W沉淀 0.1939W供100%2VitB1硅钨酸（VitB1)2硅钨酸 换算因数 = 2MVitB1M沉淀=

16、2 337.273479.22=0.1939第58页/共88页 取本品约50mg，精密称定，加水50ml溶解后，加盐酸2ml，煮沸，立即滴加硅钨酸试液4ml，继续煮沸2分钟，用80恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀先用煮沸的盐酸溶液（120）20ml分次洗涤，再用水10ml洗涤1次，最后用丙酮洗涤2次，每次5ml，在80干燥至恒重，精密称定，所得重量与0.1939相乘，即得2、第59页/共88页（1） 硅钨酸用量：过量 VB1 :硅钨酸 =1:8（2） 沉淀反应在HCl中进行，增大沉淀颗粒（3） 煮沸：2-3分钟。太长，沉淀易附着于器壁而损失。（4） 洗涤：热的稀HCl、水、丙酮洗。（5） 干燥：

17、80 保持4个H2O第60页/共88页（四）硫色素荧光法1、+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇+ NaOH + 异丁醇Sd（空白）对照液供试液+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇+ NaOH + 异丁醇b （空白）AC样A-bC对=S-dC样 = C对 A-bS-d第61页/共88页(五) 高效液相色谱法例如：甲硫氨酸维B1 注射液中甲硫氨酸和维B1的含量测定方法：色谱柱：C18流动相：( A )0. 005 molL 庚烷磺酸钠溶液(磷酸调pH 至3. 0)与(B)乙腈为流动相，梯度洗脱检测波长为210 nm;甲硫氨酸VB1第62页/共88页(六)流动注射化学发光法 维生素 B1在碱性

18、介质中被铁氰化钾氧化，产生微弱化学发光, 罗丹明B 可快速吸收反应释放的能量而跃迁至激发态，以光辐射的形式返回基态，十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB) 可敏化其发光强度，使光强度大大增强。A 样品+ CTMAB B 罗丹明BC 铁氰化钾+ NaOH P 蠕动泵 F 流通池1、罗丹明B-CTMAB化学发光法可用于测定维生素B1 片和注射液V 进样阀 PMT 光电倍增管第63页/共88页 VB1 和KIO4 在酸性介质中的反应为常规的氧化-还原反应,不产生化学发光。反应剩余的KIO4 注入到Luminol流路中,KIO4 与Luminol 在混合管中发生化学发光反应,但因反应灵敏,在未到达检测器之

19、前反应已经完成,故此发光强度未被检测,然后剩余的Luminol 继续与Na2 SO3发生化学发光反应而在发光流通池中被检测, 其发光强度与维生素B1 的浓度在一定的范围内呈良好的线性关系。 2、FI-化学发光法间接测定第64页/共88页（七）分光光度法 维生素B1 在pH 2的盐酸溶液中以分子状态存在,稳定性良好,但pH大于5时,将会分解。在pH 7 时维生素B1 完全分解。利用光谱差异测定。测定波长：249nm1、差示分光光度法2、动力学光度法 在氢氧化钠介质中,维生素B1能灵敏催化高碘酸钾氧化苯并红紫4B 使之褪色,在一定范围内,苯并红紫4B 褪色程度与维生素B1浓度成正比3、酸性染料比色

20、法 利用维生素B1 与酸性染料溴麝香草酚蓝成盐,在420 nm波长处测定吸收度第65页/共88页(八) Fe ( )- 2 ,2 联吡啶分光光度法(九) 电位滴定法 用银电极为指示电极,甘汞电极为参比电极,AgNO3 标准溶液为滴定剂第66页/共88页第五节 维生素C的分析654321OOHHOO C OHHCH2OHL抗坏血酸一、结构与性质*第67页/共88页1、多羟基化合物：具糖的性质 性质:2、2，3-烯二醇结构：强还原性氧化还原滴定法3 、C3-OH : 酸性,一元酸，可与Na2CO3成盐CCOHOH(O)CCOO第68页/共88页5、水解反应 ：与碱反应6、UV特征4、手性C原子（C

21、4、C5）：具旋光性，L(+)抗坏血酸活性最强max = 243nm 第69页/共88页（一）与氧化剂的反应二、鉴别试验Cu2O （红色）VitCAgNO3Ag （黑色）2，6-二氯靛酚钠兰色消失KMnO4紫红色褪去Felling试剂第70页/共88页（三） UV BP0.01mol/L HCl（二）糖类的反应 USPVitC三氯醋酸或盐酸戊糖脱水糠醛吡咯50 max = 243 nmE1cm1%= 545-585蓝色第71页/共88页指示剂 淀粉指示液原理1、三、含量测定OHOO C OHHCH2OHHO IH+OO C OHHOOCH2OHHI2+（一）碘量法 ChP第72页/共88页（1

22、）溶解：加新沸的冷H2O，减少水中溶解氧对测定的影响（2）酸性环境：HAC，减慢VitC被O2氧化速度（3）立即滴定：减少O2的干扰（4）附加剂干扰的排除片剂 滑石粉 过滤注射剂 抗氧剂 丙酮甲醛Na2SO3 ,NaHSO3，Na2S2O3 ,Na2S2O52、讨论第73页/共88页（二）2，6-二氯靛酚钠滴定法 USP 、JP原理1、NClHOClOVitC +NClHOClOHH去氢VitC +（玫瑰色）（无色）自身指示终点法以出现玫瑰色为终点缺点： 滴定液不稳定，需经常标定干扰多 氧化力较强第74页/共88页（三） HPLC法HPLC法测定制剂、生物样品、果汁中维生素C方法 离子交换色谱

23、法 离子对色谱法 分配色谱法（正、反相）血、尿、组织、细胞等检测器：紫外、安培检测器例如：RP-HPLC测定多维软咀嚼片中维生素C 含量色谱柱:Hypersil C18柱;流动相:0. 005molL - 1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH 至3. 6) ; 检测波长:246nm。第75页/共88页1、2 ,4-二硝基苯肼比色法（四）分光光度法例如：不同产地枸杞子中维生素C 含量测定2、胶束增溶分光光度法 维生素C 还原氯化硝基四氮唑蓝(NBT)为蓝色化合物,蓝色化合物被溴代十六烷基吡啶(CPB)在水溶液中形成的胶束增溶,使显色反应灵敏度显著提高。第76页/共88页3、紫外分光光度法4、邻二氮菲分

24、光光度法 利用抗坏血酸与0.05% Fe () - 1, 10 - 二氮杂菲溶液在pH = 26的盐酸介质中生成Fe ( ) , Fe ( )与啉菲罗啉形成有色络合物,其吸光值与抗坏血酸的浓度成正比, 测定药剂中维生素C 含量。5、流动注射光度法（五）荧光法第77页/共88页快速循环伏安法 采用L- 赖氨酸修饰玻碳电极，以磷酸盐缓冲溶液 为支持电解质（六）电极法第78页/共88页第五节 维生素D的分析HO-2HHOBUVHOHOBUVHO胆甾醇7-脱氢胆甾醇维生素 D3麦角甾醇维生素 D2第79页/共88页HOHCH2H H HHHHCH3CH3CH3CH3CH3HOHCH2H H HHHCH

25、3CH3CH3CH3 维生素D2 维生素D3 溶解性 不稳定性 旋光性 显色反应 紫外吸收第80页/共88页二、鉴别三、杂质检查1、麦角醇的检查90乙醇溶解后，加洋地黄皂苷溶液，放置18h，不得发生浑浊。2、前维生素D的光照产物280nm320nm第81页/共88页四、含量测定（一）NP-HPLC Ch.P 2005u 固定相：硅胶u 流动相：正己烷正戊醇（997：3）u 检测波长：254nm第一法：用于无维生素A醇及其他干扰的供试品第二法：(1)皂化提取 ;(2)净化用色谱柱系统分离收集维生素D，得供试品溶液B;(3)按第一法进行测定。第三法：当样品经皂化提取及净化用色谱系统分离收集后，前维

26、生素D峰仍受干扰时，采用此法。第82页/共88页（二）RP-HPLC例如：钙加维生素D 胶丸中维生素D3的含量测定 由于胶丸中含有植物油,通常采用的前处理方法为皂化后提取测定，操作不但繁琐,而且在皂化及提取中有部分损失,因而影响结果。 本法则采用正己烷2乙醇(6 3) 混合溶剂,可以同时溶解维生素D3 和植物油,无须皂化和提取色谱条件Diamond C18 色谱柱; 流动相:甲醇2水(90 10) ; 检测波长:265 nm。第83页/共88页思 考 题 根据VB1的结构,综述其性质,设计鉴别试验方法和含量测定方法。NSCH3CH2CH2OHNNH3CNH2CH2+HClCl-第84页/共88

27、页CH2NNH3CNH2CH3NNaSC2H4OHONNH3CNH2HClNSCH3C2H4OHCH2NaOHNNH3CNNNaSCH3C2H4OH-H2O第85页/共88页硫色素SCH3C2H4OHNNH3CNNH 环环合合NNH3CNNSCH3C2H4OH(O)-2H蓝色荧光第86页/共88页1、维生素B1的分析2、维生素C的分析3、维生素D的分析4、复方制剂中多种维生素的分析作 业要求：7-8人/组，准备PPT，下次课堂讲授，每组不超过30分钟。内容包括：结构、性质与分析方法；鉴别试验方法；药典含量测定方法及原理等；其他方法及原理或方法进展等第87页/共88页感谢您的观看。第88页/共88页