【精品论文】白细胞介素17A 在大鼠急性胰腺炎胰腺损

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1、精品论文白细胞介素-17A 在大鼠急性胰腺炎胰腺损伤中的作用倪建波1，胡国勇2，熊杰1，万荣1，王兴鹏25（1. 同济大学附属第十人民医院消化内科，上海 200072；2. 上海交通大学附属第一人民医院消化内科，上海 200080） 摘要：【目的】研究促炎因子白细胞介素-17A 在急性坏死性胰腺炎模型中的表达及其参与 胰腺腺泡细胞坏死的分子机制。【方法】利用基因芯片、实时荧光定量 PCR、Western-blot、 ELISA 和免疫组化等方法检测白介素-17A 在 3%牛磺胆酸诱导的大鼠急性坏死性胰腺炎模10型中的表达变化及定位。用重组大鼠白介素-17A 细胞因子分别刺激大鼠胰腺腺泡细胞及星

2、 状细胞，检测白介素-17A 的下游靶基因包括促炎因子白介素-6、白介素-1 以及 C-X-C 家族 趋化因子在 mRNA 水平的表达变化，及其对腺泡细胞坏死的作用。【结果】在 3%牛磺胆酸诱导的急性胰腺炎模型中，白介素-17A 的表达显著上调且主要表达于间质炎性细胞、损伤的腺泡细胞和导管样复合体中；重组大鼠白介素-17A 刺激大鼠腺泡细胞及星状细胞表达白15介素-6、白介素-1 以及趋化因子 CXCL1、CXCL2 以及 CXCL5，并诱导腺泡细胞发生坏死。【结论】白介素-17A 在 3%牛磺胆酸诱导的大鼠急性坏死性胰腺炎模型中表达显著上调，并 通过诱导腺泡细胞及星状细胞表达促炎细胞因子白介

3、素-6、白介素-1 和趋化因子 CXCL1、 CXCL2 及 CXCL5 放大炎症反应，促进胰腺腺泡细胞坏死。关键词：急性胰腺炎；白介素-17A；坏死；炎症20中图分类号：R576Involvement of Interleukin-17A in pancreatic damage in rat experimental acute necrotizing pancreatitisNI Jianbo1, HU Guoyong2, XIONG Jie1, WAN Rong1, WANG Xingpeng225(1. Department of Gastroenterology,Shanghai

4、Tenth Peoples Hospital, Tongji University Schoolof Medicine, ShangHai 200072;2. Department of Gastroenterology,Shanghai First Peoples Hospital, Shanghai JiaotongUniversity School of Medicine, ShangHai 200080)Abstract: 【Objects】 Interleukin (IL)-17A is a pro-inflammatory cytokine, which has recently3

5、0attracted much interest due to its pathogenic role in various inflammatory conditions such as ischemia/reperfusion injury, chronic inflammation and autoimmune diseases, but the role of IL-17A in acute pancreatitis remains unclear. This study aimed to investigate the role of IL-17A inexperimental ac

6、ute necrotizing pancreatitis (ANP). 【Methods】 We analysed the expression ofIL-17A during the pathogenesis of ANP in vivo induced by 3% sodium taurocholate (NaTc), by35microarray test, qRT-PCR, Western blotting, ELISA, and immunohistochemistry. The effects ofIL-17A on pancreatic acinar cells and panc

7、reatic stellate cells (PSCs) were further investigated in vitro using recombinant rat IL-17A (rIL-17A). 【Results】Expression of IL-17A was significantlyincreased following experimental AP. In addition, rIL-17A induced rat pancreatic acinar cell necrosis and promoted expression of several target genes

8、, including IL-6, IL-1, CXCL1,40CXCL2, and CXCL5, in acinar cells and PSCs. 【Conclusion】 These findings suggest thatIL-17A may be involved in pancreatic damage by regulating the expression of inflammatory cytokines and chemokines during experimental acute pancreatitis.Keywords: Interleukin-17A; acut

9、e pancreatitis; necrosis; inflammation基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（编号 20090072110022）作者简介：倪建波，（1987-），男，博士研究生，急性胰腺炎的基础研究。通信联系人：王兴鹏，（1965-），男，教授，胰腺疾病的基础与临床研究。E-mail: wangxp1965- 5 -450引言急性胰腺炎是一个常见的炎症性疾病，其发病率正在逐年上升1。急性胰腺炎的主要病 理过程包括胰腺及胰腺外器官的炎症、水肿和坏死。急性胰腺炎的严重程度可能与胰腺腺泡 细胞损伤后的一系列事件有密切关系2。胰腺腺泡细胞自身能够合成和释放炎症因子，包

10、括 炎症性细胞因子和趋化因子，它们能够招募炎症细胞诸如中性粒细胞和巨噬细胞3, 4。炎症50细胞的募集和激活可进一步引起腺泡细胞损伤和炎症因子如 TNF-，IL-1和 IL-65。随着 炎症因子产生和释放的增加，局限在胰腺的炎症反应可进一步发展为全身炎症反应综合症 (SIRS)，后者是决定该疾病死亡率的重要因素1, 3。白细胞介素（IL）-17 家族由 6 个成员组成，即 IL-17A-F6。其中，IL-17A 被认为是 Th17细胞的标志性细胞因子7。除了 Th17 细胞，激活的单核细胞、成纤维细胞和中性粒细胞都55能合成 IL-17A8。IL-17A 在自身免疫性疾病和炎症性疾病，如类风湿

11、性关节炎、炎症性肠 病、心肌缺血/再灌注损伤以及肾移植排斥反应的病理过程中扮演着重要的作用9-12。IL-17A 能刺激成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞及白细胞合成表达炎症细胞因子如 IL-6，TNF- 和 IL-1以及趋化因子 CXCL1，CXCL2，CXCL5，MCP-1 和 IL-8 等13, 14。此外，IL-17A 也能够协同 TNF-，IL-1和 IFN-以增强其促炎反应15。已有研究表明 IL-17A 的过度表60达在急性胰腺炎的病理过程中可能扮演着重要作用16。IL-17A 能通过诱导激活 NF-B 和 MAPK 途径，刺激人胰腺成纤维细胞分泌 IL-617。然而，目前对于 IL

12、-17A 参与急性胰腺炎 病理生理过程的机制仍不清楚。本研究建立了 3%牛磺胆酸钠诱导的大鼠实验性急性坏死性 胰腺炎动物模型，发现 IL-17A 在急性胰腺炎中的表达显著升高，并能促进炎症介质的表达 诱导胰腺腺泡细胞坏死。651实验材料与方法1.1急性胰腺炎模型的建立雄性 SD 大鼠购自上海 SLAC 实验动物中心。60 只体重 200-250g 的清洁级 SD 大鼠， 分为对照组、和 SAP 组 1 天、3 天、5 天、7 天和 21 天，每组 10 只大鼠。所有关于动物的 操作得到上海市第十人民医院动物安全委员会许可（2011-RES1）及上海市科学技术委员许70可（ID: SYXK 20

13、07-0006）。在进行实验前，大鼠禁食不禁水 12 小时。大鼠用 2%戊巴比妥钠(0.25 mL/100 g)腹腔注 射麻醉。开腹，找到十二指肠和胰管后，用动脉夹夹闭胆总管近肝段。SAP 组大鼠通过微 量注射泵逆行胰胆管注射 3%牛磺胆酸钠(0.1mL/100g, Sigma)，速度控制在 0.10 mL/min。注 射完毕，胰管十二指肠开口端用动脉夹夹闭十分钟以维持胰管内压。对照组大鼠用生理盐水75代替牛磺胆酸钠逆行注射。关腹，大鼠在 37 度衬垫中进行麻醉复苏。在急性胰腺炎模型建 立后 1 天，3 天，5 天，7 天和 21 天分别麻醉后心腔取血后处死各组大鼠，快速取出胰腺， 称重后部分

14、冻存于液氮或-80 度冰箱，部分固定于 4%多聚甲醛。血标本于 4 度冰箱保存过 夜后，离心 3000g15 分钟，取上清并保存于-80 度冰箱待用。死亡的大鼠用新的大鼠替代 入组，以维持每组 10 只。801.2原代胰腺腺泡细胞及星状细胞分离参照胡国勇等18胶原酶法分离大鼠胰腺腺泡细胞。原代腺泡细胞用含 20%血清的DMEM/F-12 培养基(Gibco)培养。用不同浓度（0，10，100，200，500ng/ml）重组大鼠 IL-17A（Peprotech）处理原代腺泡细胞 12 小时。参照沈等密度梯度离心法分离原代大鼠胰腺星状细胞19。新鲜分离的星状细胞培养与85含 10%血清及 1%双

15、抗（Gibco）的培养基中，三天后用重组大鼠 IL-17A（200ng/ml）处理 星状细胞 6 小时。1.3血清淀粉酶及脂肪酶检测利用 Roche/Hitachi（Roche）仪器检测血清淀粉酶、脂肪酶活性。1.4胰腺组织学评估90胰腺组织样本固定于 4%多聚甲醛，不同浓度酒精梯度脱水后进行石蜡包埋，将胰腺组 织切成 5um 切片，二甲苯脱蜡后酒精梯度水化，用伊红及苏木素染色。1.5实时荧光定量 PCR利用盐酸胍/苯酚/氯仿方法抽屉胰腺组织总 RNA。利用 SuperScript II 试剂盒（Fermentas） 把 RNA 逆转录成 cDNA，引物序列见表 1。实时荧光定量 PCR 用

16、ABI Prism 7900HT 系统检95测(Applied Biosystems)。GAPDH 作为内参。利用CT 值计算基因表达水平变化的倍数。表 1 实时荧光定量 PCR 引物序列Table 1. Primer sequences used for qPCR analysisGenes Primers Size (bp) Annealing Temperature, CIL-17AF: 5-AGGCCCTCAGACTACCTCA-3 R: 5-TCTCAGGCTCCCTCTTCAG-3IL-17RA F: 5-GGGTGTATGGCCTCATCAC-3 R: 5-ACAGGCAGTGA

17、TCAGGAACT-3IL-17RC F: 5- CTGGGAAGAGCCCGAAGA-3 R: 5- GTACCTGGGTTTGGTGTAGG-3IL-1 F: 5-TGTGATGTTCCCATTAGAC-3R: 5-TTCATCTCGAAGCCTGCAGTG-3 IL-6F: 5- CCACTGCCTTCCCTACTT-3R: 5- TTGCCATTGCACAACTCTT-3 CXCL1F: 5- TCGCCAATGAGCTGCGCTGT-3R: 5-GGGACACCCTTTAGCATCTT-3 CXCL2F: 5-CGCCCAGACAGAAGTCATAG-3 R: 5-TCCTCCTTT

18、CCAGGTCAGTTA-3CXCL5 F: 5- GCTCAAGCTGCTCCTTTC-3R: 5- GTGGGTCAAGACAAACATTA-3 GAPDHF: 5 -GCAAGTTCAACGGCACAG-3R: 5-CGCCAGTAGACTCCACGAC-3199 52260 51247 52131 51154 50205 54132 51187 50141 521001051.6蛋白质免疫印迹（Western blot）液氮或-80保存的大鼠胰腺组织迅速用 RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂及 PMSF）在液 氮中研磨后超声裂解，然后于 4 度 10000g 离心 15 分钟后，保留上清

19、，用 BCA 试剂盒测 定蛋白浓度(Pierce)后加 1/5 体积 5蛋白上样缓冲液后，100 度水浴煮沸 5-10 分钟。按 60ug 蛋白上样，浓缩胶电压 80V，分离胶电压 120V 进行 SDS-PAGE 分析(Bio-Rad)。用 PVDF 膜（0.22um）200mA 恒流湿转 40 分钟后，常温下用 5%牛奶封闭一小时。兔抗 IL-17 多克 隆抗体（Santa Cruz，1:500 稀释）或小鼠 -actin 单克隆抗体(Sigma，1:2000 稀释)于 4 度孵 育过夜。TBS-T 洗膜 5 分钟4 次后，用羊抗兔或羊抗鼠 IgG-HRP 二抗(Santa Cruz，1:

20、2000 稀释)，室温孵育一小时。TBST 洗膜 5 分钟4 次后，用 ECL 检测系统（Santa Cruz）于暗 室显影、定影，观察实验结果。1101151201251301.7酶联免疫吸附（ELISA）大鼠血清中的 IL-17A 含量用 ELISA 试剂盒检测（eBioscience）。1.8免疫组化石蜡包埋的胰腺组织切成 5um 厚度切片，用二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，用 EDTA (1 mM; pH 8.0)微波修复 15 分钟。3%过氧化氢室温孵育 20 分钟，以去除过氧化物酶活性。5%BSA 封闭半小时，IL-17A 一抗于 4 度孵育过夜，PBS 洗涤 5 分钟3 次，用 DAB

21、 试剂盒检测抗 体结合。苏木素复染。阴性对照组用 PBS 替代一抗。显微镜观察 IL-17A 染色情况(CTR 6000； Leica)。1.9细胞活力检测用 8mg/ml Hoechst33258 和 1mg/ml PI(Sigma)双染检测大鼠胰腺原代腺泡细胞凋亡和坏 死20。细胞核顾锁或染色质片段化被认为发生凋亡，细胞质膨胀、细胞膜被破坏且细胞核 被 PI 染色被认为发生坏死。同时检测释放到培养基中 LDH 的浓度以反映细胞坏死程度21。 细胞 ATP 水平用 Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega) 检测

22、22。1.10 统计学处理实验数据首先进行方差齐性检验。方差齐性的数据用 one-way ANOVA 方法处理，并用 SNK 方法进行两两比较。方差不齐的数据用非参数检验 Kruskal-Wallis 方法处理。P 值0.05 被认为差异具有显著统计学意义。2实验结果2.1IL-17A 及其受体在大鼠急性胰腺炎模型中的表达2.1.1血清淀粉酶、脂肪酶及胰腺组织学改变在 3%牛磺胆酸钠逆行灌注后，与正常组相比，血清淀粉酶及脂肪酶（图 1 a）水平在第 一天显著升高，在第三天达到最高水平并一直维持在高水平至第五天，随后逐渐降低。135140145图 1 血清淀粉酶、脂肪酶及胰腺组织学改变。a：血清

23、淀粉酶和血清脂肪酶水平在 3%牛磺胆酸钠诱导的大鼠急性坏死性胰腺炎过程中的变化；b：胰腺组织在正常组及诱导急性胰腺炎后 1 天、3 天、5 天、7 天及14 天后的病理学改变（400）。*代表与对照组相比，p0.05Fig. 1 Serum Amylase and Lipase Activities and Histological Alterations of the Pancreas. a: Changes in serum amylase activity and serum lipase activity during ANP in rats. b: Representative li

24、ght micrographs from control rats and 3% NaTc treated rats at 1 day, 3 days, 5 days, 7 days and 21 days after induction of ANP are presented. (magnification 400). *p0.05 compared with the saline group急性坏死性胰腺炎模型建立后一天，胰腺组织出现显著间质水肿、出血、腺泡细胞的空 泡化以及炎症细胞的浸润（图 1 b）。随着时间的进展，腺泡细胞进一步被损伤。第三天， 腺泡细胞的退行性变及坏死进一步发展。

25、第五天，大部分胰腺小叶被导管样复合体替代。第 七天，发现腺泡细胞的再生以及间质的纤维化。到第二十一天，导管样复合体数量减少，胰 腺组织结构基本修复。相反，生理盐水组的胰腺组织仅在第一天出现轻度的间质水肿及炎症 细胞浸润，在第七天的时候胰腺组织已经完全修复正常。- 13 -1501551601652.1.2IL-17 家族及其受体在 SAP 中的表达为了寻找调控胰腺损伤的关键节点，我们对 3%牛磺胆酸钠诱导的急性胰腺炎模型进行 了基因芯片分析。芯片结果显示，IL-17A 基因在第一天变达显著升高，在第三天至第五天 升至最高水平，在第七天逐渐降低（图 2 a）。IL-17F 是 IL-17 家族中

26、与 IL-17A 结构最相近 的成员，其表达水平在芯片中于第一天降低，后逐渐恢复至正常水平。而其他 IL-17 家族成 员 IL-17B，IL-17D，IL-17E 没有明显变化（表 2）。有研究表明，IL-17A 通过 IL-17RA 及 IL-17RC 的复合体激活下游信号通路。本研究显示，IL-17RA 及 IL-17RC 在 SAP 过程中均 发生明显上调。图 2 IL-17A 及其受体在急性坏死性胰腺炎中的表达。a：IL-17 家族基因表达的急性坏死性胰腺炎基因芯片 中的结果；b：IL-17A 蛋白在急性坏死性胰腺炎中的表达；c：IL-17A 在急性坏死性胰腺炎大鼠血清中的表 达；d

27、-f：IL-17A 及其受体 IL-17RA 和 IL-17RC 的 mRNA 水平在急性坏死性胰腺炎过程中的表达。*代表与 对照组相比，p0.05Fig. 2 Expression of IL-17A and its receptors during ANP. a：mRNA levels of IL-17 family during ANP weredetected by the microarray test. b:Western blot analysis of IL-17A showed an increase of IL-17A at protein level in 3% NaTc

28、 induced pancreatic tissues. c: Concentrations of serum IL-17A during ANP. d-f：Quantitative real timeRT-PCR confirmed the increased mRNA levels of IL-17A, IL-17RA, and IL-17RC in pancreatic tissues after induction of ANP. * p0.05 compared with the saline group.根据基因芯片结果，我们进一步用 real-time PCR 的方法验证了 IL

29、-17A 及其受体在体内 及体外的表达。急性胰腺炎过程中胰腺组织 IL-17A 的表达变化与基因芯片一致，与第一天 开始发生上调，于第三天达到最高水平后逐渐下降（图 2 b，d）。此外，IL-17RA 及 IL-17RC精品论文170175在 mRNA 水平也显著上调（图 2 e，f）。同时，我们运用 ELISA 方法检测了 IL-17A 在大鼠血清中的浓度。在正常大鼠血清中，IL-17A 的浓度为 46.815.51 pg/L，但是在 SAP 第一天 的大鼠血清中，IL-17A 的浓度上升至 73.44 8.57 pg/ L。而到第三天增加至 152.45 21.48 pg/L)(图 2 c

30、)，随后逐渐下降。而在对照组大鼠的血清中，IL-17A 的浓度并未出现显著性改 变。表 2 IL-17 家族基因在 3%牛磺胆酸胰腺炎中的表达Table 2 Gene expression of IL-17 family during 3% NaTc-induced ANPGenescontrol1d3d5d7dIL-17A19.9 7.157.0 8.2*66.0 9.4*58.7 5.7*25.4 10.1IL-17B217.2 13.195.1 7.4*27.9 3.5*50.6 5.9*38.8 6.5*IL-17C893.9 55.3572.0 65.2*1225.8 76.9*79

31、2.4 35.3*842.5 37.1IL-17D205.4 15.7217.0 14.6211.7 17.9265.5 32.3*200.7 28.4IL-17E217.8 29.6149.6 17.4*113.4 22.6*227.6 26.782.3 9.8*IL-17F538.9 36.6305.3 41.6*504.5 46.1541.3 54.7288.6 33.8*IL-17RA163.0 35.0256.2 27.7*434.9 29.1*308.1 48.5*183.3 35.2IL-17RC396.2 40.8564.9 34.6*513.0 45.2*488.9 27.5

32、*395.1 31.2*代表与对照组相比，p0.05*p0.05 compared with the control group1801852.1.3IL-17A 的表达定位如图 4 a 所示，IL-17A 在正常胰腺组织中几乎未检测到表达。在胰腺炎后第一天，IL-17A 免疫组化阳性发现于间质浸润炎性细胞（图 3 b）。随着腺泡细胞的损伤，IL-17A 在坏死的 腺泡细胞和导管复合体中表达强阳性（图 3 c）。另外，在血管内皮细胞中也检测到免疫原 性。在第五天，除了导管复合体外，在间质炎性细胞中也观察到到 IL-17A 强阳性（图 3 d）。 到了第七天，导管复合体上 IL-17A 的表达较

33、前减弱（图 3 e）。190195200图 3 IL-17A 在 ANP 中的表达定位。a：IL-17A 在正常胰腺组织中罕有表达；b：ANP 后第 1 天 IL-17A 主要表达与浸润的炎性细胞中；c：ANP 后第 3 天 IL-17A 主要表达于发生损伤的腺泡细胞（箭头）和导管样 复合体（星标）；d：ANP 后第 5 天 IL-17A 在导管样复合体（星标）上表现为强阳性；e：ANP 后第 7 天IL-17A 在导管复合体上仍见微弱表达；f：阴性对照组图片（400）。Fig. 3 Immunohistochemical analyses of IL-17A on rat pancreas

34、during ANP. a：In control pancreas, IL-17A immunoreactivity was hardly observed. b：On day 1, IL-17A protein immunostaining was mainly detected in infiltrated interstitial inflammatory cells (arrows). c：On day 3, IL-17A was observed in injured acinar cells withvacuolization (arrowhead) and tubular com

35、plexes (asterisk). d：Immunoreactivity for IL-17A was stronglyexpressed mainly in tubular complexs (asterisk) on day 5；e：Immunoreactivity for IL-17A became weaker on day7；f：Negative control. (magnification 400).2.2重组大鼠 IL-17A 体外诱导腺泡细胞坏死目前已证实，炎性细胞的募集和炎症介质的产生可导致腺泡细胞的损伤4。为了证明 IL-17A 能调节腺泡细胞的活力，我们用重组大鼠 I

36、L-17A（rIL-17A）细胞因子处理大鼠原代 胰腺腺泡细胞。高浓度的 IL-17A（500ng/ml）可诱导体外腺泡细胞发生形态学改变。如图4a 所示，原代分离的大鼠胰腺腺泡细胞呈高度极化，基底膜光滑、完整（左图）。高浓度IL-17A 处理 12 个小时候，腺泡细胞从基底膜发泡，发生空泡化，并失去了细胞膜的完整性（右图）。205210215220225图 4 重组大鼠 IL-17A 诱导胰腺腺泡细胞坏死。a：重组大鼠 IL-17A（500ng/ml）作用 12 小时诱导腺泡细 胞发生坏死样形态学改变图片（400）；b：Hoechst/PI 双染标记腺泡细胞坏死及凋亡图片（200） c：不

37、同浓度重组大鼠 IL-17A 致腺泡细胞 ATP 水平下降；d：重组大鼠 IL-17A 处理腺泡细胞致腺泡细胞降 LDH 释放。*代表与对照组相比，p0.05Fig. 4 rIL-17A induced pancreatic acinar cells necosis. a：Treatment with 500ng/ml rIL-17A for 12 hours inducedacinar morphological changes in rat pancreatic acinar cells. Arrowheads denote the damaged acinar cells. (magni

38、fication 400). b：Hoechst 33258/PI double staining. Arrowheads indicate apoptotic cells and arrows indicate necrotic cells (magnification 200). c：Treatment with rIL-17A resulted in a dose-dependent depletion of the cellular ATP levels；d：Treatment with rIL-17A resulted in increased percentage of LDH r

39、elease into theextracellular medium. *P 0.05 compared with PBS-treated group因为 ATP 耗竭被认为腺泡细胞坏死相关23。结果显示，rIL-17A 处理腺泡细胞后，细 胞内 ATP 耗竭显著高于对照组，且 ATP 水平的耗竭程度随着 rIL-17A 浓度的增加而增加（图4 c）。此外，血清 LDH 水平也是一个细胞损伤和坏死的分子标记21。LDH 释放依赖于作 用活细胞的 rIL-17A 浓度。在 1000ng/ml rIL-17A 刺激腺泡细胞 12 小时后，仅残存 66.75% 细胞活力(图 4 d)。500ng/

40、ml rIL-17A 作用于腺泡细胞 12 小时后，Hoechest 33258/PI 双染进 一步证实 IL-17A 主要诱导胰腺腺泡细胞发生坏死（图 4 b）。2.3IL-17A 诱导 IL-17RA/C 及炎症介质表达为了进一步研究 IL-17A 诱导腺泡细胞坏死的分子机制，首先，我们发现 IL-17RA 及 IL-17RC 随着 rIL-17A 的刺激均发生上调（图 5 a），表明 IL-17A 介导的信号通路被激活。 同时，我们进一步检测了 IL-17A 的靶基因在大鼠胰腺腺泡细胞及星状细胞的表达。在 IL-17A 的刺激下，腺泡细胞及星状细胞合成炎症细胞因子如 IL-1、IL-6

41、以及 C-X-C 家族趋化因子 包括 CXCL1，CXCL2 和 CXCL5）增加（图 5 b-g）。该结果表明 IL-17A 可能通过触发炎 症反应而诱导胰腺腺泡细胞坏死，进而诱导急性胰腺炎的发生。230235240245图 5 rIL-17A 诱导胰腺腺泡细胞及星状细胞表达炎症因子及趋化因子。a-b：rIL-17A（200ng/ml）处理 6 小 时诱导腺泡细胞及星状细胞表达其受体 IL-17RA 及 IL-17RC；c-g：rIL-17A 促进腺泡细胞及星状细胞表达 炎性细胞因子 IL-1、IL-6 及趋化因子 CXCL1、CXCL2 和 CXCL5。*代表与对照组相比，p0.05Fig

42、. 5 rIL-17A upregulated expression of induced various cytokines and C-X-C-Chemokines in pancreatic acinar cells and pancreatic stellate cells. a-b：rIL-17A upregulated expression of IL-17RA and IL-17RC；c-g：rIL-17Ainduced its downstream targets IL-1, IL-6, CXCL1, CXCL2 and CXCL5 in pancreatic acinar c

43、ells and pancreatic stellate cells (PSCs). Isolated rat acinar cells and PSCs were treated with 200 ng/ml rIL-17A for the 6 hours. *P 0.05 compared with PBS-treated group.3讨论在本研究中，我们发现 IL-17A 在 3%牛黄胆酸钠诱导的实验性急性重症胰腺炎中的表 达水平显著上调。此外，高浓度的 IL-17A 通过促进下游促炎靶基因包括细胞因子如 IL-1， IL-6 和 C-X-C 家族趋化因子的表达，进而促进胰腺腺泡细胞的

44、坏死。IL-17A 细胞因子家族是与清除细胞外病原体高度相关的炎症因子24，并且是多种炎症 性疾病的驱动因素。目前关于 IL-17A 在心脏、脑、肾脏、小肠及肺组织缺血/再灌注损伤中 的证据越来越多10, 25-28。然而，IL-17A 在急性胰腺炎中扮演的角色却仍不清楚。目前有研250255260265270275280285究证实，多种固有免疫细胞包括 CD4+ T 细胞、 T 细胞、巨噬细胞、颗粒细胞、树突样 细胞、自然杀伤细胞以及激活的单核细胞、成纤维细胞及中性粒细胞均可产生 IL-17A 细胞 因子29。相反，IL-17 受体家族的五个成员，即 IL-17RARE 在结构上与其他细胞

45、因子受体 的结构同源性较低30。IL-17RA 是最早被发现的 IL-17A 受体，它广泛地表达与各种不同的 细胞如造血细胞、多种骨髓细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及造骨细胞。此外， IL-17RC 可以与 IL-17A 结合成异二聚体，成为 IL-17A 共同受体进而激活下游信号通路6。我们运用基因芯片筛选发现 IL-17A 及其受体 IL-17RA 和 IL-17RC 均在 3%牛黄胆酸钠 诱导的实验性急性胰腺炎模型中显著升高。然而，IL-17 家族其他成员的表达变化却没有类 似 IL-17A 的趋势。我们进一步运用 real-time PCR 方法验证了 IL-17A 及其受体在

46、 mRNA 水 平的表达与芯片结果基本一致，这表明 IL-17A 介导的信号途径在急性胰腺炎模型中被激活。 此外，我们发现 SAP 大鼠血清中 IL-17A 的浓度较对照组亦显著升高。如上所述，过量的 IL-17A 可介导多种器官的损伤，因为我们推测 IL-17A 血清水平的增高跟急性重症胰腺炎发 生全身炎症反应综合症和远隔器官的损伤相关。此外，IL-17A 的表达水平与血清淀粉酶和 脂肪酶的表达水平和胰腺损伤程度相平行，而后者是衡量急性胰腺炎严重程度的常用指标。 这提示着 IL-17A 可能参与急性胰腺炎的急性损伤。因此，我们进一步用免疫组化方法对 IL-17A 进行表达定位，发现其表达于炎

47、性细胞以及损伤的腺泡细胞中。有趣的是，IL-17A在导管样复合体中呈强阳性表达。导管复合体常见于急性胰腺炎损伤和修复期，有研究认为 其中有一部分导管复合体来源于急性胰腺炎早期受损腺泡细胞的转化31。此外，导管复合 体也见于慢性胰腺炎及胰腺癌中31, 32。IL-17A 是否参与急性胰腺炎向慢性胰腺炎的转化需 要进一步的研究。然后，我们聚焦于研究 IL-17A 在介导胰腺腺泡细胞损伤及炎症反应中扮演的角色高剂 量 rIL-17A 作用 12 小时诱导腺泡细胞发生空泡化，伴随腺泡细胞 ATP 发生耗竭及 LDH 释 放入培养液。此外，Hoechst/PI 双染进一步证实 rIL-17A 诱导的腺泡

48、细胞死亡方式以坏死为 主。IL-17A 能诱导多种炎症介质的表达，因为被归为促炎细胞因子30。急性胰腺炎的发生 触发强烈的炎症反应，产生多种细胞因子、趋化因子和粘附分子4。在本研究中，我们发现 rIL-17A 能刺激胰腺腺泡细胞和星状细胞表达 IL-1 和 IL-6。有研究报道，IL-17A 能诱导 IL-6 通过 NF-B 和 ERK1/2 MAP 激酶途径而促进并稳定人胰周成纤维细胞表达 IL-6 的 mRNA17,33，并能与其他细胞因子如 TNF-，IL-1，和干扰素- 促进 IL-6 的表达与合成33。而 IL-6 被认为是急性胰腺炎病理生理过程中的关键调节因子，并与疾病的严重程度正

49、相关34。IL-6 也是第一个被发现的 IL-17A 的靶基因，它能通过 RORt 依赖的途径促进 Th17 细胞的分化 35，这提示可能存在一个对 IL-17A 的正反馈应答环路。除了炎性细胞因子，C-X-C 家族趋化因子，包括 CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL8 (IL-8) 和 CXCL10 等也是 IL-17A 的靶基因15。在本研究中，我们发现在 rIL-17A 刺激腺泡细胞和 星状细胞后，CXCL1、CXCL2 和 CXCL5 的 mRNA 水平发生上调。这些 IL-17A 下游趋化 因子也参与中性粒细胞的增殖、成熟和趋化过程14, 15。如上所述，中性粒细胞本身也能合

50、 成表达 IL-17A。IL-17A 诱导的中性粒细胞募集参与多种疾病的病理生理过程。比如，IL-17A 在中性粒细胞介导的脑缺血/再灌注损伤中扮演着重要作用25。最近研究报道，中性粒细胞 及巨噬细胞也能通过诱导腺泡细胞胰酶激活剂腺泡细胞坏死而加重急性胰腺炎36, 37。因此，IL-17A 可能通过参与中性粒细胞的趋化和激活来决定急性胰腺炎的严重程度。 综上所述，本研究表明 IL-17A 信号通路的激活参与急性胰腺炎过程中的腺泡细胞的坏死和炎症反应。IL-17A 促进 C-X-C 家族趋化因子成员 CXCL1、CXCL2 及 CXCL5 在腺泡细290胞和星状细胞的表达，后者可能在中心粒细胞的

51、趋化和组织浸润中扮演重要作用。然而，阻断 IL-17A 信号通路是否能够减轻实验性急性胰腺炎仍待进一步研究。本研究可能为将来针 对重症急性胰腺炎的治疗提供新的思路。参考文献 (References)2953003053103153203253303353403451 Pandol SJ, Saluja AK, Imrie CW, Banks PA. Acute pancreatitis: bench to the bedsideJ. Gastroenterology.2007, 132(3):1127-51.2 Bhatia M. Apoptosis versus necrosis in ac

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