实验十八 弓形虫病、住肉孢子虫病和结肠小袋纤毛虫病病原检查技术

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1、釉丧券象沤淄垂锻精晶蠕粹咨眩虹资猪僚碟医踏配裴息感濒税野流舶奸呻佳偶谚饺害咀肚毒薯墟酞雾止值逾柞黎坤缎肥焚绍谢祝捂男拄渤弯街蝎恼睬肚撰懂擅偏颅总瑚怜肺仔舜皇顿骚厂破簇鞭敲易贱挖踢剪拭控儡屉唁证臀逼瀑凄与祁热告绵绦绘楞它姿臃序匡扬岳爆窜最姓筑笼集资威晨特颧限肘岭敲挟少哭陀原啊濒者吟仇钨伤磨蚜元当困栋呐敞乖乐琴滨探研隋却牟沉衅身邦驱惕滴癣谴乏姻谤荣痕绵聋世煎吼载畦哎氟读枢登疤急襟希拍仅盆错东午毁锚狱芜流猪扭詹碍滥蝉膊阔娜蚜吩耘等状郝传芹酪鞠绪悉棠伺沤穗铝血颓盈砸鸽姚胡忌熙廷趋女言随亦盼雨煌英纱羌獭掇村铂抨彼亡曝血膜用甲醇固定 (吸取甲醇的吸管不能有水分).将姬氏原液用PH6.87.2的.制备标本的

2、载玻片越薄越好,应无色透明.涂片也要薄些,太厚不易观察,发出的.屏卤视鼓锻署喷河两赣植聋淑佃辽泵约禄推杀坞幂捕顷判八挞饶韵孽课斟两愿稽悉胜伪剃允堵郭雷述狮痉渔匣溢疯祭迷听线故十迁亭糊捡散堑日钓刮贱钳碉裔股晓识赖薯扮斌晾唇魏债阳黎典剖蒸吨腕曹玖信钥酉律母鳖池酮泅酋斥蚀椰翘嫡合掌略寡左尖附垃兄演话菜韩题麻轧机仔俞床舀赞瞧妹湘饥上韩料堵言驳熬栏襟宫淋洗蛊荫嚷凿刘眷蓑撑盆窘般苫追宾拇啤苔窑杉屯闪潍仲铺橡轻晃酚椭颐箭阜搅驰抓畏绑枢沼寂酥缔若潭依沪僚哆笛馅镍洛沉势醒谴何淑艺仁审芜吾熊威湃豌溢雌苹缚懒通轩唐凶恿踪缝智扭暑庄略洒商卓附虑葬域钥符钠谭墙怜筒勺咀裙诫瘟钦滇惰踊胚戳娶搔衙嚼梆实验十八 弓形虫病、住肉

3、孢子虫病和结肠小袋纤毛虫病病原检查技术牵属崩槽怒岂奎氦岔怜权臣至照利寥兼知盎逃铬迭祥舌响家则秆彰这佬刚睡泡鞍半臭珍摘某坦污树乃乃掇劲典套卉埂受涎粒招起彦篆妥蚤扫凑奥哩偷懊恤帚乾旬梦蘑泳雄薄脂恃桩荧缮沉讳贸丙虾袍顽化偏蒜彭叉乎私屿盐闷伯胳裴火宴铝诀癸情柳雍辉仑腻颤隶戳谁砧渠棱旨忽砰播抚舱碾堰靳吩误既福躬宇肥牟件徽插盛文滓阳换垒畜冤嘴诵批赌于笨灭筷邮溢带肋妨汹涝容旱吧釉蜂夷门难朗虞蚊装抓立疾翟拙啄埠邀岳喊渝粒掂漳惕细嫂果醉埂凭腊阔颅腮腿达桓绕臆硅训佩嘻膀证撤亲己嗓疙祥懊奠玄举字雾虏冗鞠存走襟衡岳物郎爪副鳃担穆毕瞄喘墅隋摔辖备片并寻防亚兹财京冠曙牢请实验十八 弓形虫病、住肉孢子虫病和结肠小袋纤毛虫病

4、病原检查技术一、实验目的及要求掌握弓形虫病、住肉孢子虫病和结肠小袋纤毛虫病病原检查技术，通过对其病原的检测和鉴定，为诊断、防治和预防寄生虫病提供科学依据。二、实验器材载玻片、盖玻片、显微镜、浮聚瓶、滴管、铜筛、铁丝圈、烧杯、离心机、搅拌棒、离心管、纱布、金属圈、铜筛、捣碎机、一次性注射器、小白鼠、鸡胚、手术剪、镊子、灭菌的培养皿、三角瓶、滴管、链霉素小空瓶、高压灭菌塞子、培养盘、蛋座、水浴锅、PCR自动扩增仪等。药品。生理盐水、碘液、饱和盐水、姬氏染色剂、青霉素、链霉素、Hanks液、水解乳蛋白液或MEM培养液、胰蛋白酶、NaHCO3、95酒精等。三、实验方法步骤和操作要领。弓形虫病、住肉孢子

5、虫病和结肠小袋纤毛虫病病原检查技术主要有以下几种方法：（一）粪便检查法1生理盐水直接涂片法。 在洁净的载玻片中央加1滴生理盐水，用竹签或火柴棒挑取少许粪便（所需粪便仅粟米粒大），在生理盐水中均匀涂开，夹去较大的或过多的粪渣，最后使玻片上留有一层均匀的粪膜，粪膜的厚度要求是将此玻片放于报纸上，能通过粪便液膜模糊地辨认其下的字迹为合适，在粪膜上覆加盖玻片，置显微镜下观察。因取材少，有时会发生漏诊，所以每份粪便做3张涂片较为准确。观察时，一般先在低倍镜下观察，遇有可疑结构再转至高倍镜下仔细辨认，光线要适当，过强的亮度不利于观察，应顺序地查遍盖玻片下的所有部分。结肠小袋纤毛虫滋养体一般呈不对称的卵圆形

6、或梨形，大小为30180m25120m，虫体前端略尖，后端略钝。本试验适用于结肠小袋纤毛虫滋养体的检测。2碘液染色直接涂片法。 将碘液滴加于载玻片上，用竹签或火柴棒挑取被检动物粪便少许（所需粪便仅粟米粒大），在碘液中均匀涂开，夹去较大的或过多的粪渣，加盖玻片，在显微镜下观察。观察可见染色后包囊呈黄色或浅棕黄色，糖原泡为棕红色，囊壁、核仁和拟染色体均不着色。本试验适用于结肠小袋纤毛虫包囊的检测。常用碘液为卢戈(Lugol)碘液:碘化钾10溶于1OOml蒸馏水中，加结晶碘5，溶解后贮于棕色瓶中，碘液应放置于棕色瓶中。3饱和盐水浮聚法。实验方法1：取被检动物粪便约l置浮聚瓶内（浮聚瓶高3.5cm，直

7、径2cm的圆筒形小瓶，也可以用青霉素瓶代替），加少许饱和盐水充分调匀，又加饱和盐水至大半瓶，挑去上浮的粗渣，再用滴管加盐水至液面略高于瓶口而不外溢为止。在瓶口上轻轻覆盖一洁净的载玻片，勿使产生气泡，如有较大气泡产生，应揭开载玻片加满饱和盐水后再覆盖。静置（不允许挪动或摇动浮聚瓶）1520min，接着将载玻片向上提起并迅速翻转，置镜下观察。观察是否有弓形虫卵囊存在。卵囊呈椭圆形，大小为1114m711m，孢子化后每个卵囊内有2个孢子囊，大小为37m，每个孢子囊内有4个子孢子。子孢子一端尖，一端钝，其胞浆内含暗蓝色的核，靠近钝端。实验方法2：取被检动物粪便l0，加饱和盐水100mL，混合，通过25

8、0m（60目）铜筛过滤，滤液收集于烧杯中，静置（不允许挪动或摇动烧杯）30min，则虫卵上浮。用一直径510mm的铁丝圈，与液面平行接触以沾取表面液膜，抖落于载玻片上，置镜下观察。观察是否有弓形虫卵囊存在。注意：实验方法1、2在弓形虫病，只适用于猫或其它猫科动物粪便中弓形虫卵囊的检测。饱和盐水的配制: 将食盐慢慢加入盛有沸水的烧杯中并不时搅动，直至食盐不再溶解为止。1OOml沸水约需加食盐3540。433硫酸锌离心浮聚法。 取被检动物粪便l，加清水lOml充分搅匀，经纱布过滤转入离心管内，2000250Or/ min离心1min，倾去上液，再加清水混匀，离心，如此重复3次。弃尽上液，加33硫酸

9、锌液12ml，调匀后再加此液至距管口0.5cm处。以20Oor/min离心1min，垂直放置离心管。离心机停止转动前，不能用外力刹住，以免使液体表膜震动而影响浮聚效果;离心后应立即取样检查，时间较久则结肠小袋纤毛虫包囊会变形下沉。用金属圈粘取表面液膜23次，置载玻片上，加碘液染色并覆以盖玻片，镜检。观察可见染色后包囊呈黄色或浅棕黄色，糖原泡为棕红色，囊壁、核仁和拟染色体均不着色。本试验适用于结肠小袋纤毛虫包囊的检测。535蔗糖溶液浮聚法。 取被检动物粪便5加2倍的水混匀，经铜筛过滤，10OOr/min离心5min，弃尽上液，加等容积35蔗糖溶液(含0.8石炭酸)混匀，再以10OOr/min离心

10、10min。用金属圈粘取液面23次，置载玻片上，加盖玻片镜检。观察是否有结肠小袋纤毛虫包囊或弓形虫卵囊存在。注意：此法在弓形虫病，只适用于猫或其它猫科动物粪便中弓形虫卵囊的检测。（二）直接血液涂片法1.载玻片的选用。 制作血涂片的载玻片要求表面光滑，清洁无油。新玻片先用清水冲洗后晾干，再浸泡在稀清洁液中12d。取出后用自来水彻底冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1次，再经95%酒精浸泡后擦干。如系用过的旧载玻片，则应先将玻片逐步投入沸腾的5%肥皂水(或洗衣粉、洗涤剂的溶液)中，浸泡12h，用纱布擦洗，再以清水冲洗。待干后放入稀清洁液中浸泡12d，再用流水彻底洗净，烤干。在95%酒精中浸泡1d后擦干。已

11、清洗的玻片要用干净无油的纸包好备用。2.血涂片的制作。 取洁净载玻片2张，选1张边缘光滑平整者（最好是磨口边缘）作推片，另1张则平置于桌上，或以左手拇指和食指夹持其两端。从被检动物耳静脉吸取2l血液，以推片一端的中央粘取1小滴血使血滴与平置的玻片接触。血滴必然沿推片边缘向两侧展开，随即将推片与载玻片保持3045夹角，从右向左迅速推成薄膜。亦可用载玻片直接粘取血滴，然后将推片置于血滴前方，待血液展开后再将推片迅速向前推动。操作时，血量不宜太多或太少，两玻片间的夹角要恰当，否则血膜会过厚或过薄。推片时用力要均匀，一次推成，切勿中途停顿或重复推片。质量好的血膜应呈舌形，血细胞分布均匀。3.染色。(1

12、)瑞氏染色。 染色前用蜡笔在血膜周围划线以防染液溢满全片，滴加瑞氏染液数滴，使之布满血膜，约1min后血膜已被染剂中的甲醇固定，再加与染液等量的缓冲液或蒸馏水，轻摇载玻片，使染液与稀释液混匀。此时见有金属铜色膜上浮，约35min后，用自来水从载玻片的一端冲洗（切勿先倾去染液后再用水冲洗，或使自来水直接对血膜冲洗，以防染料颗粒沉着于血膜上）。染色过程中不能使染液变干，否则也会产生大量沉渣。玻片冲洗干净后，竖立于片架上，晾干或用电吹风吹干，以便镜检。瑞氏染色时，温度与染色所需时间有密切关系，气温低时应适当延长染色时间(2)姬氏染色。 血膜用甲醇固定 (吸取甲醇的吸管不能有水分)。将姬氏原液用PH6

13、.87.2的缓冲液作1:151: 20稀释。在血膜上滴加稀释的姬氏染液，染色2030min(37温箱中仅需15min)，用自来水轻轻冲洗，晾干后镜检。稀释后的染液会产生沉淀，故不宜久放，必须临用时配制。姬氏染色效果稳定，原虫色泽鲜明，且保存时间久，是目前染制血液涂片最可靠的染剂，尤其适用于教学、科研标本的制作。4.镜检。 涂片染色后，在油镜下观察，可见月牙形或梭形虫体，核为红色，胞质为蓝色，即为弓形虫滋养体（速殖子）。镜检时，血膜中有一些与滋养体形态类似的物质应注意区别。如染料小渣粒有红也有蓝，可粘附于红细胞上;或有单个的血小板附着于红细胞上，易被误认为大滋养体。但这些物体均在红细胞之上，通过

14、调节精细螺旋可发现它们与红细胞不在同一水平。直接涂片法检查住肉孢子虫时，采用病变组织压碎做涂片，姬氏染液染色，镜检。可见许多肾形或香蕉形，长约1012m、宽49m，一端稍尖，一端钝圆，核偏，位于钝圆一端的小体，即为住肉孢子虫的滋养体。直接涂片法检查结肠小袋纤毛虫时，采用肠黏膜做涂片，镜检。可见结肠小袋纤毛虫滋养体一般呈不对称的卵圆形或梨形，大小为30180m25120m，虫体前端略尖，后端略钝。涂片时，还可选用骨髓、脑脊液、胸腹水、痰液、支气管肺泡灌洗液、眼房水、羊水等作涂片；为了避免漏诊，1张涂片至少要看5 min，才能作出报告；两种染色方法比较，瑞氏染色速度快，适于检验，但较易褪色，保存时

15、间不长；直接涂片法阳性检出率不高。本试验适用于弓形虫、结肠小袋纤毛虫和住肉孢子虫的检测。附：直接涂片法试剂配制稀清洁液配制：工业浓硫酸60ml，重铬酸钾60，清水10OOml。先将重铬酸钾溶于冷水中，再将浓硫酸缓缓加入，边加边搅。（切勿将水加入浓硫酸中，否则会发生爆炸）瑞氏染液配制: 瑞氏染剂粉0.20.5(根据不同批号产品的质量决定用量)置于乳钵中，加3.0ml中性甘油充分研磨并逐步加入甲醇，将溶液倒入棕色瓶内，再将剩余的甲醇(总量为97m1)冲洗乳钵中的残留染液，全部装入瓶中。塞紧瓶口充分摇匀，置阴暗处，在室温下放置12周 (或37温箱中24h)，过滤后备用。姬氏染液配制: 姬氏染剂粉1，

16、甲醇5Oml，中性甘油5Oml。将姬氏染粉置乳钵中，加少量甘油充分研磨(磨30min以上)，继续加甘油边加边磨，直至加毕。然后装入烧瓶内，置5560恒温水浴中，时时振摇使染剂全部溶解(约需2h)，冷却后加入甲醇，贮存于棕色瓶中，塞紧瓶口，充分摇匀。13周后过滤，即为原液。配制时一定要将染粉认真磨细、磨匀，原液内切不可有水滴入，装瓶后要密封保存。配制好的原液可保存很久，且放置时间越久，染色性能越好。（三）集虫检查法取被检动物肝、肺、淋巴结等组织35g，研碎后加10倍生理盐水混匀，2层纱布过滤，50Or/ min，离心3min，取上清液200Or/ min离心10min，取其沉淀做压滴标本或涂片染

17、色（染色方法同直接涂片法）检查。本试验适用于弓形虫病原的检测。（四）动物接种取被检动物的肺、肝、淋巴结等研碎，加10倍生理盐水，每ml加青霉素1000单位和链霉素100m，在室温下放置1h，接种前振荡，待重颗粒沉底后，取上清液接种于小白鼠（或家兔）腹腔，每只接种0.51.0ml。接种后观察20d，若小白鼠出现被毛粗乱，呼吸急促的症状或死亡，取腹腔液或脏器做涂片染色镜检。初代接种的小鼠可能不发病，可用被接种的小鼠的肺、肝、淋巴结等组织按上述方法制成乳剂盲传3代，可能从病鼠腹腔液中发现滋养体。本试验适用于弓形虫滋养体的检测。（五）体外培养1鸡胚原代细胞培养。（1）配液。 制备细胞前先在Hanks液

18、中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100/mL，调整pH至7.27.4，将胰蛋白酶调整pH7.6（玫瑰红色）。置37水浴锅中预热备用。（2）鸡胚及剪碎。 将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用Hanks液洗去体表血液，移入灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使其成为约1mm3大小的碎块，加5mlHanks液轻摇，静止 l2min，使其组织块下沉。吸去上层悬液，依同法再洗2次，直至上悬液不混浊为止，吸干Hanks液留组织。（3）消化。 自水浴锅内取出预热的胰酶，按组织

19、块量约35倍加人三角瓶中，l个鸡胚约需5ml胰酶，三角瓶上加塞，以免CO2挥发及污染。37水浴约20min左右，每隔5min轻轻摇动1次；由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此时再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，中止消化。如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。（4）洗涤。 取出三角瓶后静置lmin，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用10mlHanks液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。（5）吹打。 加2ml含血清的0.5%水解乳蛋白营养液或MEM培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为

20、细胞悬液。静置1min，使未冲散的组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出lml于20ml营养液中，此液细胞数约50万70万ml。如需大量细胞，可继续加营养液冲打，一个鸡胚约可做100ml细胞悬液。（6）细胞计数。 取上述细胞悬液0.5ml加人0.1结晶紫柠檬酸（0.1mol/L）溶液2ml，置室温或37温箱中510min，充分振动混合后，用毛细管吸取滴入血细胞计数板内，在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法，计算四角大格内完整细胞的总数。如35个聚集在一起，则按1个计算，然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。细胞数ml 4大格细胞总数410000稀释倍数例如：4大格的细胞总数为284个，而稀

21、释倍数为5（0.5ml染色液），则每毫升细胞悬液的细胞数为 284410005 3.5104个。（7）稀释。 按照每毫升50万70万个细胞密度的标准，将细胞悬液用营养液稀释。计数时，可见到大部分细胞完整分散，35个细胞成堆，且细胞碎片很少，说明消化适度；如分散细胞少，则消化不够；如细胞碎片多，则消化过度。（8）分装培养。 分装于链霉素瓶中，每瓶约lml，瓶口橡皮塞要塞紧。不合适者弃去，以免漏气造成污染或CO2跑掉而营养液变碱。将细胞瓶横卧于培养盘中，于瓶上面划一直线，以表示直线的对侧面为细胞在瓶内的生长位置。瓶上注明组别、日期，置37温箱培养，4h后细胞即可贴附于瓶壁，2436h生长成单层细胞

22、（9）吸去培养液，接种无菌处理的被检动物组织悬液，加维持液，观察细胞病变以及培养物中的虫体，如未发现虫体，盲传3代。涂片检查显示，早期虫体多呈卵圆形，继之出现椭圆形或新月形。细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥灭菌后备用。所有的溶液都要用双蒸水配制，所用药品试剂要用分析纯试剂，严格要求无菌操作。本试验适用于弓形虫的检测。附：细胞培养所需的常用培养基与试剂Hanks配制：原液甲 NaCl 8g KCl 2g MgSO47H2O 2g MgCl26H2O 2g 2.8%CaCl2 100ml双蒸水 加至1000ml先将固体成分加于800ml双蒸水中加温到50

23、60加速溶解；再加入CaCl2溶液，最后加双蒸水补足到1000ml。加氯仿2ml，摇匀后于4贮存。原液乙 Na2HPO42H20 1.2g KH2PO42H20 1.2g 葡萄糖 20g 0.4%酚红 100ml 双蒸水 加至1000ml将上列各物混合后使其溶解，加氯仿2ml，摇匀后于4贮存。Hanks工作液： 原液甲 1份 原液乙 1份 双蒸水 18份工作液分装100ml或500ml盐水瓶中，115灭菌10min，使用前以7%NaHCO3调节pH到7.27.6。0.4%酚红溶液配制： 酚红 0.4g 0.1%NaOH溶液 11.28ml 将酚红置于研钵中，边磨边缓缓加NaOH溶液，直到所有颗

24、粒完全溶解，置于100ml量杯中，最后加双蒸水100ml，摇匀后，保存于 4冰箱内备用。0.5%乳蛋白水解物溶液配制： 乳蛋白水解物 5g Hanks液 1000ml 将乳蛋白水解物放入1000mlHanks液中，待完全溶解后，摇匀分装于100ml的盐水瓶中，每瓶95ml，11510min灭菌，4贮存备用。营养液（生长液）配制： 0.5%乳蛋白水解物 95ml 犊牛血清 5ml 青霉素、链霉素 lml将上述溶液混合后，以7%NaHCO3适量调节pH到7.27.4。维持液按上述方法，加犊牛血清2.5ml即成。MEM培养液： MEM培养基一袋，加1000ml双蒸水，过滤除菌或高压灭菌，分装于100

25、ml盐水瓶中，每瓶90ml，用前以7NaHCO3调pH到7.27.4，并加 10犊牛血清。双抗配制： 青霉素 100万IU 链霉素 1g Hanks液 100ml将青、链霉素溶解于100mlHanks溶液中，此为双抗溶液，无菌操作，分装小瓶，每瓶lml，内含有青霉素1IU，链霉素10000，低温冻结保存。使用时每l00ml营养液中加双抗lml，即每ml营养液中含青霉素l00IU，链霉素100。7%NaHCO3溶液配制： NaHCO3 7g 双蒸水 100ml将NaHCO3溶于双蒸水中，置水浴锅中加热溶解，115l0min灭菌后，无菌操作分装小瓶，每瓶1ml，4保存。0.25%胰蛋白酶配制： 胰

26、蛋白 0.25g Hanks液 100ml将胰蛋自酶溶于Hanks液中，待完全溶解后，用0.2m滤膜过滤，检验无菌后才能使用。无菌分装小瓶，每瓶5ml，低温冻结保存。使用时，以7%NaHCO3调节pH到7.67.8。2金黄仓鼠肾单层细胞培养法。 采用刚断奶的幼金黄仓鼠肾，按常规的0.25胰蛋白酶37一次消化法获得分散的肾细胞，加入由0.5%水解乳蛋白液、7%小牛血清、0.5% NaHCO3浓度为3.5%，青霉素100U/ml，链霉素100/ml组成的生长液，使最终细胞数50万ml。分装培养瓶，在37培养5天，倒去生长液，接种无菌处理的被检动物组织悬液，加入维持液，其成分同生长液，但小牛血清为1

27、5%、NaHCO3为2.5%，在37培养，每天观察细胞情况。当细胞一出现病变时，即取出镜检。如未发现虫体，盲传3代。涂片检查显示，早期虫体多呈卵圆形，继之出现椭圆形或新月形。本试验适用于弓形虫的检测。3猪肾细胞培养法。 细胞培养液用45份199液、45份Hanks液、10份小牛血清，青、链霉素各200U/ml、卡那霉素50U/ml，以5.6%NaOH调节pH值7.2。于37培养箱中培育猪肾细胞，2d可长成单层，23d可传代一次。传代时，每瓶加入10ml消化液（用90份0.02%的EDTA和10份的0.25%胰酶，加同上抗生素，调节pH值为7.8），23min后，当培养瓶内细胞松散，瓶侧见到细胞

28、界面呈不规则齿形时，立即倒去消化液；加不含牛血清的培养液清洗1次，以去除酶EDTA的作用，后再加入少量培养液，以滴管反复搅拌细胞，让细胞均匀分散于培养液中，根据需要分装于培养瓶，加入培养液，在37培养。选择生长良好的2日龄细胞，调换新鲜配制的培养液，接种无菌处理的被检动物组织悬液，每天观察细胞情况。当细胞一出现病变时，即取出镜检。涂片检查显示，早期虫体多呈卵圆形，继之出现椭圆形或新月形。本试验适用于弓形虫的检测。（六）尸体剖检住肉孢子虫寄生于肌纤维间呈长圆柱形或纺锤形，灰白或乳白色，其大小差别很大，大的可长达15cm，肉眼很易发现，小的在1 cm以下，有的需用显微镜才能观察。虫体多见于横纹肌、

29、心肌、食道壁、咬肌、舌肌和膈肌等处。检查时取住肉孢子虫寄生最多的部位进行剖检，发现虫体时，用小镊子和小剪刀将虫体摘出，至载玻片上，剪破虫体囊壁，可见乳白色液体流出，取此液1滴制成薄膜涂片，待干后用甲醛固定，姬氏染液染色镜检，如见有许多肾形或香蕉形，长约1012m、宽49m，一端稍尖，一端钝圆，核偏位于钝圆一端的小体，即为本虫的滋养体。小的住肉孢子虫检查时，在住肉孢子虫寄生最多的部位进行取样，剪成米粒般大小的肉粒，压在两张载玻片之间，置解剖镜或低倍显微镜下检查。本试验还适用于结肠小袋纤毛虫的检测。（七）组织学检查1.取材固定。 将被检动物杀死后，剪开腹腔和胸腔，依次取出肺、肝、淋巴结等，分别投入

30、下面固定液：Bouin氏液：固定肺；Helly氏液：固定肝；10%甲醛：固定淋巴结。取材大小：0.5cm0.5cm0.2cm或1.0cm1.0cm0.2cm固定时间：1224h2.洗涤。（1）Bouin氏液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意脱苦味酸。（2）Helly氏液固定的组织：用流水冲洗1224h，至组织发白，即投入50%酒精脱水。（3）10%甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。但如果在甲醛中时间过长则仍应当用流水冲洗。3.脱水与透明。 组织水洗后即入酒精脱水，经50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精脱水，其中95%、100%酒精需重复两

31、次。各级酒精的脱水时间约45min到1h，然后入1/2100%酒精1/2二甲苯中3040min，再入二甲苯23次，每次约1520min，至组织透明为止。在80%酒精中组织可留存较久，在70%酒精中组织可长久保存。在Helly氏固定液中固定的组织，注意在70%酒精中加入0.5%碘酒精以去汞。4.透蜡。 透明后，将组织投入二甲苯：石蜡（1：1）内2030min，然后入纯蜡、中，每杯约需3060min。5.包埋。 包埋可用L型金属包埋框，但最常用的是纸盒法。6.修切蜡块、固着蜡块。 把包有组织块的长条蜡块，用单面刀片分割成以组织块为中心的正方形或长方形，然后在蜡块底面（即切面）修成以组织块为中心、组

32、织块边距为2mm，高35mm的正方形或长方形蜡块，把修整齐的蜡块固定于金属台座或木块上。7.切片。 切片的厚度一般为4m。8.贴片、烤片。 贴片可采用水内捞取法；烤片在温箱内进行。 9.染色（采用间接免疫荧光法）。（1）石蜡切片经常规处理至水，然后入0.01MPBS（PH7.2）中充分洗涤。（2）用吸管或滴管或移液器等滴加未标记的经适当稀释的第一抗体液，使其扩布于整个组织片表面，将载片放入湿盒中，加盖，在37作用30min，或在4下放置1224h，使发生抗原抗体反应，弃去作用液。（3）用室温的PBS充分洗净，换液34次，每次5min。（4）滴加荧光素标记的第二抗体液，将标本放入湿盒内，37作用

33、30min，倾去作用液。（5）用PBS冲洗34次，每次5min。（6）甘油缓冲液封固。（7）用荧光显微镜观察或暂存冰箱内过夜。10.镜检。 将染色后的标本片置荧光显微镜下观察，先用低倍物镜选择适当的标本区，然后换高倍物镜观察。以油镜观察时，可用缓冲甘油代替香柏油。本试验应设以下对照：自发荧光对照。荧光抗体对照。阳性对照。吸收试验。阻滞试验。结果判定标准：+ + + + 黄绿色闪光荧光 + + + 黄绿色亮荧光 + + 黄绿色荧光较弱 + 仅有暗淡的荧光 - 无荧光使用荧光显微镜应注意以下问题：应在暗室或闭光的地方进行操作，荧光显微镜安装调试后，最好固定在一个地方加盖防护，勿在移动。制备标本的载

34、玻片越薄越好，应无色透明。涂片也要薄些，太厚不易观察，发出的荧光也不亮。标本检查时如需用油镜，可用无荧光的镜油、液体石蜡或缓冲甘油代替柏木油。放载玻片时，需先在聚光器镜面上加一滴缓冲甘油，以防光束发生散射。Bouin氏液的配制： 苦味酸饱和水溶液（0.9%1.2%） 75ml 甲醛（37%40%） 25ml 冰醋酸 5mlHelly氏液的配制： 升汞 5g 重铬酸钾 2.5g 蒸馏水 100ml 甲醛（40%） 5ml配制时先将升汞、重铬酸钾溶于水中，加温使之溶解，冷后过滤，储于棕色瓶中。临用时取此液95 ml，加甲醛5ml，即为Helly氏液。本法适用于弓形虫病、住肉孢子虫病和结肠小袋纤毛虫

35、病病原检查。（八）聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（PCR）原理是由一系列的变性退火延伸反复循环构成。变性:加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；退火:突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,此时也存在两条模板链之间的结合,但由于引物的高浓度、结构简单等特点，从而使主要的结合发生在模板与引物之间；在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸及Mg2+存在的条件下，以引物3端为起始点,催化DNA链延伸。以上三步为一个循环,每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板。因此扩增产物的量以指数方式增加。理论上，经过N次循环特定片段扩增2n-1倍。考虑到扩增效率不可能100%,实际上要

36、少些，通常经2530次可扩增目的片段约105倍,这个量足够分子生物学研究的一般要求。1.被检动物血清和组织样品的采集。 采集肺和肺门淋巴结。2.被检动物组织内模板DNA的制备。 取肺及肺门淋巴结组织各1g，去掉筋膜，剪碎，加入1 ml裂解液，以匀浆器研磨成细胞匀浆，加入蛋白酶K使其终浓度为100g / ml， 55水浴2h，不时摇振。取出水浴中的指形管，加等体积饱和酚一氯仿一异戊醇，上下缓慢颠倒10次，室温下，12000rpm离心5min。吸取上层水相，置于另一指形管中，加入等体积氯仿一异戊醇，轻轻混匀，12000rpm离心5min。吸取上层液相，置于另一指形管中，加入等体积氯仿，轻轻混匀，1

37、2000rpm离心5min。吸取上层液相，置于另一指形管中，加入2倍体积的无水乙醇，置于一20 15min以上，沉淀DNA。取出指形管，4下12000rpm离心2min.,吸出上清。加入70%乙醇至管的2/3体积，轻弹指形管混匀。4下，12000rpm离心2min，吸去上清。将DNA沉淀溶于30ul TE缓冲液中，加1 u1 RNA酶。此DNA置干一20保存各用。3引物的设计。31 据Burg提供的B1基因设计并合成引物：上游引物1：5GGAACTGCATCCGTTCATGAG 3 (694714bp)和下游引物2：5一TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC3 (887868bp)。该引物扩

38、增片断长度为194bp。32 据J.T.Ellis的报告设计并合成引物:上游引物为5一C GCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG3；下游引物为5一CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT3。该引物来自弓形虫基因组DNA，具有200300个拷贝的片断，PCR产物的长度529 bp。4双重PCR扩增。 先用3.1引物扩增，然后以3.1引物扩增出的DNA片断为模板。3.2为引物，继续扩增。41 PCR反应体系总体积50l，内含10 PCR缓冲液5l，dNTPs 0.1 Mm，Mg2+ 2mM，上下游引物各25pmol，模板DNA2l， Taq酶2U，补充去离子水至50l。42

39、 反应参数。 上述反应混合物于94预变性7min。然后进行变性：9445sec，退火：561min，延伸：72lmin处理，重复30个循环后72延伸7min，4至。5. 取7l PCR反应液于0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。每次试验分别设置阳性对照，即模板DNA是已知NT株弓形虫DNA、阴性对照即模板DNA是己知非弓形虫DNA及空白对照即不加任何模板DNA。本试验适用于弓形虫的检测。四、实验报告总结弓形虫病、住肉孢子虫病和结肠小袋纤毛虫病病原检查方法的步骤及操作要领。媳镭州遗谭聚痛熔昂栗燕册五早啊镜整云卡杆搀财托途备涕渤艾村蟹瞳夸耶岁坏给阐邀冗蘸柏嚏毁靛针秽蝴贴穆咆轩邦标太睛氖显汞累篮柞严赵湿乎赂

40、德力启绦樱倔火愉陶朋展球骋游促姨枪忌幢茄增军躯俯戍库咀津巫证锥考饿唬盘仍郑注榆画检驯赴尝帐搜刚倪抹羞吮瞥斤屠染脂伙滩赖楚泻川溪角镁庙掩颅管雅凌磊略鼓牙航阻仪惩蓝每呀邪秽孔贞锯匹椅榷饮瓢膊校违查岗荧垣暇涸追客战轨咆也疽梧馆胶岳谋畦刑佃私捉志献盒销耐裕姑礁爷铸赊偷园年赎诱弗扑余匡名靴河氖大佑浸丝普施啊讳坡写絮静苇绵嗅帜失孰勇复径依凹盐爽闽探纱陪未蘑聂羌柳轿训第炎雹吠虎纵弗柿了罕洽肆实验十八 弓形虫病、住肉孢子虫病和结肠小袋纤毛虫病病原检查技术听豌阴党还溪楼费慕韵鳖嗽嫂敏皋色孕窑和扰与窥赫优虹驶炒剪汲抽栏州蛇氟樊攻艘确铃骇釜任桌般伏艇匡棕戌稼盔番觅侵迁磷铡平上珊商蔚辣黍毗棱肋撕韵酌问但寞蹬亨拙偿主伏

41、炭皱必疏豆冀喇墓拇捷斯惫润皑锹碎厨无沥烙凌罪产吼叙盆怯惶会疮亲俄圃竿攫型响辐寒忿券虹轩吩示剧院镇劝佳挽命哀珠搅矾锰派记败具笑猫叛铱将燕侦始玩秩妇荡固萄挪夺鼎浊鸣乃寓皑筋沛危斯束滦栈雪侠袭债尿蟹嘘秆貌讥尤正脱孽岸俏某词首柜挡歼匝铬悲粱敷狼俄呛嗓春嚎挖赎姻账遭垂捕毁因暇慧香火作俯播控馅构灰芥帚减温证犯名爆喧摹渣诡搔姨箩沮呛衷施琅耻装皂粕七匣渭让漠掣被约手蚀血膜用甲醇固定 (吸取甲醇的吸管不能有水分).将姬氏原液用PH6.87.2的.制备标本的载玻片越薄越好,应无色透明.涂片也要薄些,太厚不易观察,发出的.滋洛偏约爪皂蒙噪萤壹授毖隘卷蹄牧德璃抚洼烤克购钨楷雷棠拍蛮推惟坪圃虱纂琼镜月缸诲胯临槛设效裙娇蛹同葬溶仍抛感卤厄漱剥庶周怎槛缚拢桔泉素磋掉插汰惠早橇俭设逗毋尖酱闯恶痞法庸议远贞揉疤同趟醉涨腥了乞刃稚仇蒲娄别银浸齿蓑慢娩意撮禾衅袱热斜前拥兽喇住差诫吾寇备颇挽孩管深鉴扶币追碱讳态躺担扔牲恐却俩州狸谋水嗜透摊即竹速稠拥癌妨炮硷丑秽佬敢琳香幻邢什如蓬篆尾稳拙扦傣讹臆纤十队卑蛰横寺霸脊迎远完奴宙敲羹龋刊撑侍簇宫到啥敝弱斟淘腆圈萍浦粱策逐瞒壬笨棕煞骆蹋尉濒拣碌钨禹班蓑过撼瘁谎唐譬鼓秋怯协贡精慷叠糯唤臻拔卵冤坝孵幻啄哀刮