进出口食品中沙门氏菌快速检测方法

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1、进出口食品中空肠弯曲菌药物敏感性的测定编制说明1 任务来源本标准是根据国家认证认可监督管理委员会国认科函2009132 号文下达的任务，计划项目编号为2009B170 ，计划项目名称为 进出口食品中空肠弯曲菌的测定。本标准由江苏出入境检验检疫局牵头，江苏省动物卫生监督所、中国检验检疫科学研究院、福建出入境检验检疫局、山西出入境检验检疫局、天津出入境检验检疫局、扬州大学参与起草。2 编制本标准的目的和意义空肠弯曲杆菌( Campylobacter jejuni，C.jejuni) 。空肠弯曲菌属于螺旋菌科弯曲菌属，为革兰氏染色阴性的弧菌，是一类微需氧菌，该菌相对脆弱，对周围环境敏感，如对干燥、加

2、热、消毒、酸性和 21%氧气的空气都敏感。培养适宜温度为25-43，最适宜温度为42。最适 pH7.2 ，被认为是人类主要食源性病原菌之一。弯曲菌是一种重要的人兽共患病原菌，尽管大多数弯曲菌感染是自限性的，通常的治疗方法是补液，抗生素治疗只用于严重、病程长或全身感染病例或高风险人群 1 。常用的抗生素治疗主要是氟喹诺酮类和大环内酯类2 ， 3 ，四环素是备选，实际临床上很少应用。在严重病例或全身感染时，也常用氨基糖苷类静脉途径给药4 。抗生素在抗微生物感染中的作用是显而易见的，但不正确的大规模使用已经导致了人兽共患病原菌多重耐药性的产生5 。耐药性的产生已经成为WHO和多国权威机关公认的公共卫

3、生问题。弯曲菌耐药菌株主要来自动物，但对人弯曲菌病的治疗带来威胁，耐药性已经导致人和动物临床治疗的挑战。耐药菌株引发弯曲菌感染病例病程增长、发病重，尤其是临床常用的红霉素和氟喹诺酮类抗生素，因此制定食品中的空肠弯曲菌药物敏感性的测定标准具有十分重要的意义。传统空肠弯曲杆菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感且适用的空肠弯曲杆菌检测方法。3 国内外相关检测方法及人源和动物源的耐药监测3.1 空肠弯曲菌抗生素敏感性测定方法纸片扩散法、肉汤微

4、量稀释法、琼脂稀释法和E-test等多种方法用于弯曲菌抗生素敏感性测定 6-8 ，尽管美国临床实验室标准化研究所(NCCLS)对药敏实验的程序等做详细说明，但国际上没有一个弯曲菌公认的抗生素敏感性测定标准。2002 年 6 月，NCCLS推荐琼脂稀释法测定弯曲菌耐药性。但欧洲人兽共患病参考实验室仍没有明确测定方法3 ，这也导致在测定方法和结果上存在差异6 。一些研究者对上述测定方法进行了比较。Frediani-Wolf和 Stephan 9 应用纸片扩散法、 E-test和微量稀释法分析了空肠弯曲菌分离株的抗生素敏感性和耐药性，发现纸片扩散法是一种可信度高、简单易行的方法，E-test和琼脂稀

5、释法适合于小规模、单一地区分离株的分析，微量稀释法是大规模耐药性分析的首选方法7 。与这些研究不同的是，Ge等认为不同抗生素的评价指标应多样化6。现代分子技术的应用为细菌分离株耐药性测定提供了又一方法，但这一技术依赖于对相关耐药基因的分析。错配扩增突变分析PCR法（ MAMA-PCR）和荧光定量突变法5 ， 10等分子技术已成功应用于环丙沙星耐药性空肠、结肠弯曲菌的检测， 弯曲菌 gyrA 基因 Thr-86-Ile位的突变与环丙沙星耐药性相关。多列探针检测法（line probe assay ）也被应用于空肠、结肠弯曲菌对苯二酚和大环内酯类耐药性的同时检测11 。分子生物学方法的最大优势是不

6、需要培养微生物可直接从样品中检测到突变基因，尤其对困难的微生物和大规模耐药性分析；主要缺点是对新的突变基因无法检测，及对每一个抗生素要分开检测。因此，通常将表型和基因型方法结合来测定耐药性。3.2人弯曲菌临床分离株的耐药性监测欧洲2005 年 9 月，弯曲菌和幽门螺杆菌等相关病原微生物国际会议在欧洲召开，会上交流了最新的细菌耐药研究进展。Gallay 开展了较为详细的弯曲菌耐药性研究12 ， 417家研究机构共分离了4090 株，总体耐药性以下：红霉素少于5%、四环素31%、氨苄青霉素 39.2%，结肠弯曲菌耐药均高于空肠弯曲菌，萘啶酮酸耐药率分别为39.9%和 27.2%，庆大霉素没有耐药性

7、。在德国也有类似研究，Krausse和 Ullmann 对 367 株空肠、结肠分离株进行耐药性分析13 ，抗生素包括6 种氟喹诺酮类、2 种大环内酯类和四环素，加替沙星、莫西沙星最敏感（MIC90 4mg/l ），环丙沙星MIC90 32mg/l ，另外，研究显示， 38%的分离株至少对一种氟喹诺酮类抗生素耐药，14.4%的分离株对所有对苯二酚类抗生素耐药，四环素耐药明显增加，从 1999 年的 22.3% 到 2004 年 41.9%。3.2.2 新西兰弯曲菌感染是最常见的指定监测的疾病，但在抗生素监测方面的信息相对较少。奥克兰的一项研究在对 202 株肠道分离株（多种微生物）耐药性的分析

8、显示14，对庆大霉素无耐药性，对强力霉素、红霉素和环丙沙星的耐药性分别为1%、 1.5%和 2.5%， 3 年后，对同一地区的200株分离株的研究显示，红霉素耐药性空肠弯曲菌较非空肠弯曲菌要低，15 株空肠弯曲菌分离株中3%的产生了红霉素耐药性，而非空肠弯曲菌达到40%。3.2.3澳大利亚Korolik 等 15 收集了 1989-1990年和 1994-1995年期间的人源空弯分离株81 株和 79 株、结肠8 株和 6 株，在 2 次实验中，空肠弯曲菌红霉素耐药从44%下降至5%、结肠从50%下降至33%，强力霉素耐药率分别从10%下降至2.5%、25%至 16%，恩诺沙星没有产生耐药性。

9、Huysman 和 Tumidge 16对 100 株分离株的分析表明，所有菌株耐药性较轻，敏感的有红霉素、庆大霉素、萘啶酮酸和环丙沙星，9 株分离株对四环素耐药。日本Itoh等分离了245 株空肠弯曲菌17 ，其中，111 株来自1979年 -1982年间腹泻人群、134 株分离自牛、禽和野禽；72 株结肠弯曲菌，其中，18 株来自人群、54 株分离自猪，并测定了APC、EM、 CO、 TC、 AMK、 GM、 KM、 CER、 NA等9 种抗生素的耐药性，所有人源空肠弯曲菌分离株对APC、EM、CP、AMK、 GM、 KM和NA 敏感，CER的MIC 值为3.12-100 g/ml，另外，

10、69%的人源分离株对TC耐药；结肠弯曲菌的抗生素耐药性与空肠类似，但猪分离株对EM、 KM的耐药性要高，分别为44%、59%，此外，弯曲菌分离株还存在着多重耐药性。中国许海燕、黄金林等对93 株空肠弯曲菌医院分离株耐药性分析显示18，在21 种药物中，对分离株处于中度敏感和高度敏感的只有8 种，占38.10% 。对氨基糖甙类、大环内脂类、青霉素类抗生素较为敏感，而对头孢菌素类、喹诺酮类、磺胺类和四环素类抗生素产生了较强的耐药性，不同医院、不同诊区、不同月份的分离株对21 种抗生素的敏感性和耐药性无显著性差异；多重耐药主要集中在9 耐到 14 耐， 2 家医院分别占82.96% 、 79.16%

11、 ，两医院多重耐药性无显著性差异；但不同诊区分离菌多重耐药性存在显著性差异，门诊部主要集中在9 耐至 14 耐，占80.68% ，住院部集中在 10 耐至 12 耐。3.3动物源弯曲菌耐药监测法国开展了一系列动物源弯曲菌耐药监测研究，1999 年对鸡群、2000 年对猪群，从屠宰场采集肉鸡和猪的排泄物样品200-600份 19 ，多重PCR检测检测后，用MIC 法（琼脂稀释法）测定耐药性，包括萘啶酮酸、恩诺沙星、环丙沙星、四环素、红霉素和庆大霉素。氨苄青霉素、萘啶酮酸和氟喹诺酮类抗生素的敏感性不断变化，四环素的耐药比例较高，所有菌株对庆大霉素敏感，对空肠弯曲菌红霉素耐药较轻，而结肠分离株的红霉

12、素耐药较严重，特别是猪源结肠分离株。对生产过程中使用土霉素和强力霉素的肉鸡分离株的四环素耐药明显增高，此外， 用于出口禽类产品中四环素耐药（ 81-90%）明显高于普通产品（51%）。美国美国是世界上最大的家禽生产和禽肉出口国，由于禽肉和鸡蛋价格相对较低，属健康食品，未来还有较大的发展空间。据美国CDC评估，弯曲菌病的发病人数约为100 万，约占人口的0.5% ，且与消费禽肉相关20 。1990 年出现环丙沙星耐药弯曲菌，这与FDA 允许将氟喹诺酮类抗生素用于禽相一致21 ，空肠弯曲菌氟喹诺酮类耐药性呈逐年上升趋势，禽氟喹诺酮类抗生素的应用能很快的诱导产生弯曲菌环丙沙星耐药性。由于禽食源性病原

13、菌耐药性的不断增加，2001 年， FDA已提议将鸡和火鸡上用于大肠杆菌病治疗的恩诺沙星禁用，盐酸沙拉沙星限制使用。在美国，鸡粪通常用作农田肥料以改善土壤条件，这可能是多重耐药菌产生的源泉，火鸡分离株中结肠弯曲菌环丙沙星和红霉素的耐药性高于空肠弯曲菌。传统立体养殖条件下分离株几乎均对环丙沙星耐药，远高于现代养殖条件下的分离株，但现代化养殖条件下红霉素或四环素耐药株较高。对美国市场的生禽产品监测表明，弯曲菌阳性率可达84%， 17%的分离株氟喹诺酮类耐药，且在 gyrA 基因上发生了突变，这与文献报道的一致22 。另外，在分离自美国肉鸡的弯曲菌检测到托普霉素 - 庆大霉素耐药潜在的类整合子基因。

14、澳大利亚Korolik等 15对88 株弯曲菌分离株（79 株空肠、9 株结肠）研究表明，31%空肠和22%结肠对红霉素耐药、10%空肠和33%结肠对强力霉素耐药，恩诺沙星没有产生耐药性。216 株鸡源弯曲菌（ 142 株空肠、 74 株结肠），分别来自 3 个不同地区，耐药性分析表明，不同地区差异性显著，这可能与不同地区使用的抗生素不同有关，氨苄青霉素耐药性50%-61%、林肯霉素和泰乐菌素在4%-28%、四环素15%-37%、红霉素0%-11%，新霉素和庆大霉素没有产生耐药性，1 株分离株环丙沙星耐药；在结肠弯曲菌，氨苄青霉素耐药性在35%左右、四环素16%-36%、林肯霉素4%-30%、

15、红霉素 0%-17%、泰乐菌素在1%-17%，新霉素和庆大霉素没有产生耐药性，从同一地区的2 株分离株对环丙沙星耐药。日本对1995年 -1999年日本南部肉鸡的68 株弯曲菌分离株的耐药性分析表明对苯二酚的耐药达32.4% 23； 90年代后期，在兽医领域对苯二酚对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌有较高的耐药性，而EM高耐药性只在结肠。1999-2001年间，Ishihara对动物源食品弯曲菌耐药性进行了全国监测，468株分离对OTC和 DHSTH（二双氢链霉素）高度耐药，且同一种药物的耐药性结肠弯曲菌对氨基甙类抗生素(aminoglycosides， AMGLY)、大环内酯类抗生素（macrolid

16、es， MACD）、 TC 和对苯二酚的耐药性远高于空肠弯曲菌，所有空肠弯曲菌对MACD敏感， 而48.4%的结肠弯曲菌耐药。2004年， Niwa对神奈川地区1979 年 -2001年间人弯曲菌分离株193 株和1997年 -2000年间禽肉分离株56 株进行了药敏性分析24，分别对NA、 OFLX、 EM、 TC、 APC、 GM和PM（磷霉素）耐药，且人源分离株对苯二酚的耐药率显著上升，而TC 耐药性下降。中国黄金林等对35 株空肠弯曲菌奶牛分离株药敏试验表明25，在8 大类21 种临床常用的抗生素中处于中度敏感和高度敏感的只有 8 种，占 38.10%；对氨基糖甙类、大环内脂类和林可霉

17、素类抗生素较为敏感， 而对喹诺酮类、 磺胺类、 四环素类和大多数头孢菌素类抗生素产生了较强的耐药性；多重耐药主要集中在 9 耐到 12 耐，占 88.57% ；其中产奶牛分离株的多重耐药性较其它分离株更为严重。4 方法的建立采用 API Campy System 进行生化与分类鉴定,结合弯曲菌多重PCR 检测方法在2006-2008 年对江苏地区家禽市场、养鸡场，奶牛场，养猪场、实验猴养殖基地、动物园和国家级珍禽丹顶鹤、糜鹿中分离的 108 株空肠弯曲菌进行耐药性测试。由于菌株较多，实验工作量较大且耗时长，不利于微需氧菌的生长，从而确定微量稀释法为本标准的检测方法，参照肠杆菌科MIC解释标准进

18、行结果记录。5检测程序待测样品细菌培养用肉汤稀释到0.5 MCF加入抗生素在96 孔板上梯度稀释42 培养 24 h 或者 37 培养 48 h用酶标仪600 nm 波长进行读数参考判读标准确定菌株药物敏感程度报告图 1空肠弯曲菌耐药性有限稀释检测程序6操作步骤具体参见本标准。7实验结果由于实验数据较多，在此仅列出用于验证实验的8株菌株的 MIC值及判定结果。该8株菌株为实验室分离株。 A、 B、 C、 D、 E、F、 G、 H分别表示 Amikacin 硫酸阿米卡星（丁胺卡那霉素）、Cefotaxime （头孢噻肟）、 Kanamycin （卡那霉素） Trimethoprim （三甲氧苄二

19、氨嘧啶）、 Cefoperazone（头孢哌酮）、 Sulfame （磺胺对甲氧嘧啶钠 ）、 Tetracycline （四环素）、 Chloramphenicol （氯霉素）。表 1 空肠弯曲菌1 号12864321684210.50.250.125判断结果A0.0610.0490.0470.0520.1650.1780.4760.4850.4950.4960.496敏感B0.0560.0470.1530.180.1890.8810.9090.9891.0091.0811.021中介C0.050.0560.0640.480.4910.5010.4430.6010.5960.5970.602敏

20、感D0.1750.1870.1460.1040.1210.1050.150.1140.150.1480.148耐药E0.2680.2470.3140.3350.3420.3610.4020.4140.4210.4310.471耐药F0.2120.2540.2780.2880.2940.2960.3010.330.3150.3260.331耐药G0.0540.0530.0530.0550.0560.0650.5410.7570.7890.8210.991敏感H0.0560.0540.0510.0540.0550.1210.5060.5720.6010.6310.627敏感表 2 空肠弯曲菌2 号

21、12864321684210.50.250.125判断结果A0.0610.0580.0490.0510.1680.1780.4730.4850.4850.4880.489敏感B0.0560.0470.160.180.1890.8810.8240.9841.0031.0751.241中介C0.050.0540.0640.6750.6780.7020.7110.7610.7810.7880.79敏感D1.1351.1241.2511.5671.8641.861.8811.8751.8142.0012.125耐药E0.2680.2470.3140.3540.3590.4010.4210.4540.5

22、020.5180.524耐药F0.1540.2540.2670.2810.2940.2950.2970.3010.30.3120.323耐药G0.0520.0510.0510.0540.0560.0650.5890.7610.8910.9090.987敏感H0.0560.0550.0530.0540.0560.2180.4160.4510.5210.5610.582敏感表 3 空肠弯曲菌3 号12864321684210.50.250.125判断结果A0.0580.0630.0610.0610.0560.1020.2930.3210.4110.4520.445敏感B0.0490.0470.51

23、0.6050.6811.0591.1561.2121.1511.2211.739中介C0.7490.7270.8080.7190.9650.9291.1210.9390.9590.9341.002耐药D0.8260.8690.8820.7330.9460.9120.9331.0591.0491.0391.121耐药E0.0990.1030.1610.1520.1810.2010.2120.2230.3010.3310.351耐药F0.0720.8650.9950.9180.8580.9850.9980.9891.011.5412.012耐药G0.0540.0490.0490.0510.9631

24、.0211.1121.5211.6542.3612.254敏感H0.0610.0550.0540.0660.0650.4381.1491.2121.2651.3541.521敏感表 4 空肠弯曲菌4 号12864321684210.50.250.125判断结果A0.0470.0490.0460.0510.0560.0630.1020.2540.2710.3010.321敏感B0.0660.0460.0690.1510.4210.9230.9571.0232.212.2212.231中介C0.9120.710.8490.7031.0211.0021.0641.2541.311.3231.354耐

25、药D0.7040.7120.8941.0211.2541.2312.0122.2212.3542.3352.21耐药E0.1540.1390.2330.2050.1870.2140.210.2320.2510.2260.226耐药F0.9120.9761.0491.0511.1121.1671.2311.2261.2641.4651.484耐药G0.0470.130.210.2140.2310.3210.3240.4660.4750.4770.49中介H0.0480.0460.0470.0460.051.1121.1211.1251.1541.1521.12敏感表 5 空肠弯曲菌5 号1286

26、4321684210.50.250.125判断结果A0.0510.0620.0560.0990.110.1150.1980.1540.1560.1910.202敏感B0.0480.0460.0480.050.8080.8150.8090.8890.890.9120.901中介C0.0560.7930.7840.8140.8250.9031.0451.061.121.1131.21中介D0.7110.7750.8540.8870.9990.9091.011.1121.1031.0341.157耐药E0.1850.3320.320.3210.2010.3210.3140.3390.3710.354

27、0.361耐药F0.050.4570.9710.9480.9941.1340.9011.0421.211.0121.175中介G0.050.0650.0510.0580.9960.9870.9570.9870.9970.9860.978敏感H0.0550.0490.0490.0490.0481.1351.1381.2141.2351.1871.201敏感表 6 空肠弯曲菌6 号12864321684210.50.250.125判断结果A0.0510.0620.0640.060.0610.0560.1870.2280.4850.8781.036敏感B0.0650.0560.2540.5271.1

28、360.9750.9871.2291.2250.9881.199中介C0.9310.8310.7790.7590.8640.7221.1031.011.1181.1471.063耐药D1.0390.8570.9950.9340.971.0530.9961.2540.7390.9911.163耐药E0.1860.1340.320.2490.3280.2390.2830.2970.2870.3010.287耐药F0.1010.2760.3580.3190.4560.3240.2240.2540.3010.2850.219耐药G0.0610.0550.0560.0590.0640.8480.8170

29、.740.8750.9010.871敏感H0.0440.0590.070.0640.0560.0590.2411.3161.1141.1890.987敏感表 7 空肠弯曲菌7 号12864321684210.50.250.125判断结果A0.0470.0640.0690.0610.0640.0560.0560.0630.9010.0921.121敏感B0.0450.0470.0480.2540.5240.8230.8540.7590.7840.8430.801中介C0.0640.0690.0740.0840.090.0890.0910.1030.8180.8570.823敏感D0.2290.2

30、540.1240.1310.2140.120.130.1290.1780.2650.259耐药E0.1610.1870.1730.160.1340.0850.1050.0760.0980.0990.178耐药F0.3680.3950.4010.4210.3980.3650.3870.3910.3960.4020.4耐药G0.0620.0590.0620.0620.070.0720.0580.0670.0480.0530.052敏感H0.0440.0510.0620.0580.0511.011.1211.1560.8361.0610.987敏感表 8 空肠弯曲菌8 号12864321684210

31、.50.250.125判断结果A0.0590.0650.0780.0640.0690.0920.0760.0870.0750.0780.069敏感B0.0480.0820.060.1240.2030.2870.2150.3060.2450.2970.311中介C0.0530.7640.5870.6020.3890.6890.7010.7540.7380.6590.701中介D0.2470.2870.2910.2170.3050.3540.1540.2870.2080.3010.364耐药E0.2340.3570.3050.190.1910.2780.2560.3210.2980.3010.28

32、5耐药F0.0630.2810.7440.8250.8940.9050.9810.8970.9030.90.899中介G0.060.0520.0590.0540.0520.0520.0470.0480.0520.9680.993敏感H0.0450.060.050.0480.0480.0471.1910.9870.9990.9581.245敏感通过表 1、表 2、表 3、表 4、表 5、表 6、表 7、表 8 可以看出该方法操作简便，通过所发验证实验的比对，发现该方法稳定性好且准确度高。参考文献：1 Altekruse S F, Stern N J, Fields P I , et al. Ca

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