芳酸类药物的质量控制

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1、 芳酸类药物的质量控制第一节 典型药物与结构特点非甾体抗炎药(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs)是一类不含有甾体骨架的抗炎药，是目前临床使用最多的药物种类之一。本类药物具有抑制前列腺素的合成，进而发挥抗炎、抗风湿、止痛、退热和抗凝血等作用，在临床上广泛用于风湿性关节炎和类风湿关节炎、多种发热和各种慢性疼痛，如头痛、关节肌肉疼痛、牙痛等症状的缓解。本类药物具有不同的化学结构，但多数具有芳酸基本结构，即芳基取代羧酸结构。本类药物的结构特点为同时具有游离羧基和苯环，其酸性特征可作为原料药的含量测定基础，即在中性乙醇或其他水溶性有机溶剂中，用氢氧化钠

2、滴定液直接滴定；苯环的紫外光吸收特性常被用于本类药物的鉴别、定量检查及部分制剂的含量测定。本类药物的酯类易于水解的特性决定了其特殊杂质检查的项目与方法；如阿司匹林中游离水杨酸的检查，ChP曾采用三价铁比色法检查；但由于在供试品溶液制备过程中阿司匹林的继续水解使检查结果不稳定；所以ChP2010采用1%冰醋酸甲醇溶液制备供试品溶液，以防阿司匹林的水解，增加稳定性，同时采用高效液相色谱法(HPLC)检查，以提高检查结果的可靠性。芳酸类非甾体抗炎药物在结构上具有苯环和羧基。羧基可呈游离态，如水杨酸、阿司匹林、双水杨酯、二氟尼柳、甲芬那酸、布洛芬、酮洛芬、萘普生、吲哚美辛等；羧基也可成盐或成酯，如双氯

3、芬酸钠、双水杨酯等；也可呈酰胺结构，如吡罗昔康、美洛昔康等。本类药物在苯环上亦存在不同的结构特征，如水杨酸、阿司匹林、双水杨酯、二氟尼柳等具有邻羟基(游离或酯化)苯甲酸结构；甲芬那酸具有邻胺基苯甲酸结构；酮洛芬具有二苯甲酮结构；吡罗昔康和美洛昔康具有-羟基-不饱和酮结构；吲哚美辛、吡罗昔康和美洛昔康具有杂环结构；二氟尼柳含有氟元素，双氯芬酸钠和吲哚美辛含有氯元素，吡罗昔康和美洛昔康含有硫元素。上述结构特征或杂原子的存在也决定了各药物的化学特性。作为其他非甾体抗炎药，对乙酰氨基酚和尼美舒利的结构分别为取代乙酰苯胺和甲磺酰苯胺，具有苯胺和甲磺酰基结构。主要理化性包括（一） 酸性本类药物因分子结构中

4、具有游离羧基而显酸性，但其酸性强度受苯环的取代位置及苯环上其他取代基的影响。具有邻位取代苯甲酸结构的药物，如水杨酸、阿司匹林、双水杨酯、二氟尼柳、甲芬那酸等，由于邻位效应使得酸性增强，如阿司匹林的酸性(pKa3.49)比苯甲酸的酸性(pKa=4.26)强；其中，水杨酸还由于邻位游离羟基的氢能与羧基形成分子内氢键，更增强了羧基中氧氢键的极性，使其酸性进一步增强(pKa=2.95)。双氯芬酸、布洛芬、酮洛芬、萘普生、吲哚美辛等，由于羧基并非直接与苯环相连，在结构上属于芳环取代的脂肪酸类，其酸性较弱。而吡罗昔康、美洛昔康、尼美舒利、对乙酰氨基酚则为酰胺结构，无明显酸性。基于本类药物具有较强酸性的特性

5、，大多数药物的原料药均可在中性乙醇或甲醇、丙酮等水溶性有机溶剂中，用氢氧化钠直接滴定法测定含量。（二） 水解性本类药物中，阿司匹林和双水杨酯具有酯键，吲哚美辛、吡罗昔康、美洛昔康、尼美舒利、对乙酰氨基酚等则具有酰胺键，均可发生水解反应。水解反应及其产物的理化特性反应可用于鉴别；若水解反应可快速、定量进行，亦可用剩余碱量法测定含量，如美洛昔康可加定量过量的氢氧化钠水解后，剩余的氢氧化钠用盐酸回滴定法测定含量。（三） 吸收光谱特性本类药物分子结构中具有苯环和特征取代基，均具有紫外和红外特征光谱，紫外-可见分光光度法和红外分光光度法已被广泛应用于本类药物及其制剂的鉴别；同时，紫外-可见分光光度法亦被

6、广泛用于本类药物制剂的含量均匀度、溶出度或释放度的检查，甚至部分药物制剂的含量测定。（四） 基团或元素特性本类药物分子结构中的特征基团或元素具有特征的理化特性，如对乙酰氨基酚的酚羟基、水杨酸的邻羟苯甲酸结构与三价铁可生成有色配位化合物；酮洛芬的二苯甲酮可与苯肼缩合显色；美洛昔康结构中的硫元素热分解后产生的硫化氢可与醋酸铅生成黑色硫化铅等均可用于本类药物的鉴别。第二节 鉴别试验依据上述理化性质，芳酸类非甾体抗炎药物可采用显色反应、沉淀反应，以及红外、紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法或薄层色谱法鉴别。一、与三氯化铁反应1水杨酸反应 水杨酸的水溶液加三氯化铁试液，即生成紫堇色配位化合物。反应宜在

7、中性或弱酸性(pH 46)条件下进行，在强酸性溶液中配位化合物可分解；本反应极为灵敏，试验宜在稀溶液中进行。如取样量大，产生颜色过深时，可加水稀释后观察。阿司匹林加水煮沸使水解生成水杨酸后，可与三氯化铁试液反应显紫堇色；双水杨酯在氢氧化钠试液中煮沸后与三氯化铁试液反应呈紫色；二氟尼柳溶于乙醇后与三氯化铁试液反应呈深紫色。2酚羟基反应 对乙酰氨基酚的水溶液加三氯化铁试液即显蓝紫色。吡罗昔康与美洛昔康噻嗪环上的烯醇式羟基具有酚羟基的性质，亦可在三氯甲烷溶液中与三氯化铁生成红色配位化合物，分别显玫瑰红色和淡紫红色。二、缩合反应酮洛芬具有二苯甲酮结构，在酸性条件下可与二硝基苯肼缩合生成橙色偶氮化合物。

8、取本品，加乙醇溶解后，加二硝基苯肼试液，加热至沸，放冷即产生橙色沉淀。三、重氮化-偶合反应对乙酰氨基酚具潜在的芳伯氨基，在稀盐酸中加热水解生成对氨基酚，具有游离芳伯氨基结构，在酸性溶液中与亚硝酸钠试液进行重氮化反应，生成的重氮盐再与碱性-萘酚偶合生成红色偶氮化合物。分子结构中具有芳伯氨基或潜在芳伯氨基的药物，均可发生重氮化反应，生成的重氮盐可与碱性-萘酚偶合生成有色的偶氮染料。四、氧化反应甲芬那酸溶于硫酸后，与重铬酸钾反应显深蓝色，随即变为棕绿色。吲哚美辛溶液在硫酸存在下，与重铬酸钾溶液共热，应显紫色；在盐酸溶液中与亚硝酸钠溶液反应显绿色，放置后渐变黄色。五、水解反应阿司匹林与碳酸钠试液加热水

9、解，得水杨酸钠及醋酸钠，加过量稀硫酸酸化后，则生成白色水杨酸沉淀，并发生醋酸的臭气。2 CH3COONa + H2SO4 2 CH3COOH +Na2SO4双水杨酯与氢氧化钠试液煮沸后，加稀盐酸，即生成白色水杨酸沉淀；沉淀在醋酸铵试液中可溶解。六、特征元素的反应1氯元素的鉴别 含氯药物与碱共热分解产生氯化物，显氯化物的鉴别反应。如双氯芬酸钠，与碳酸钠炽灼灰化，加水煮沸、滤过后，滤液显氯化物鉴别反应(详见本书第二章药物的鉴别)。2硫元素的鉴别 美洛昔康中含二价硫高温分解产生硫化氢气体，遇醋酸铅生成硫化铅黑色沉淀。如美洛昔康于试管中炽灼，产生的气体能使湿润的醋酸铅试纸显黑色。七、光谱法(一) 紫外

10、-可见分光光度法紫外吸收光谱为电子光谱，一般只有23个较宽的吸收带，药物分子结构中的共轭体系决定光谱的形态，如最大吸收波长与最小吸收波长及在各波长处的吸收系数均取决于分子结构中的共轭体系。紫外吸收光谱法被广泛应用于本类药物的鉴别，各药物的紫外吸收光谱特征参数见表6-1。常用的紫外鉴别方法如下：1最大吸收波长法 双氯芬酸钠、萘普生、吡罗昔康、美洛昔康等均规定其最大吸收波长，如双氯芬酸钠的水溶液(20g/ml)在276nm的波长处有最大吸收。本类药物的多种制剂亦采用本法鉴别，如吡罗昔康片的鉴别：取含量测定项下的溶液，照紫外-可见分光光度法测定，在243nm与334nm的波长处有最大吸收。2最大与最

11、小吸收波长法 布洛芬用0.4%氢氧化钠溶液制成0.25mg/ml的溶液，在265nm与273nm的波长处有最大吸收，在245nm与271nm的波长处有最小吸收，在259nm的波长处有一肩峰。布洛芬及美洛昔康制剂亦用同法鉴别。3吸光度法 甲芬那酸用1mol/L盐酸溶液-甲醇(199)混合液制成20g/ml的溶液，在279nm与350nm的波长处有最大吸收，其吸光度分别为0.690.74与0.560.60。4吸光度比值法 二氟尼柳用0.1mol/L盐酸乙醇溶液制成20g/ml的溶液，在251nm与315nm的波长处有最大吸收，吸光度比值应为4.24.6。(二) 红外分光光度法红外吸收光谱是由分子振

12、动、转动能级跃迁所产生的分子光谱，与紫外吸收光谱(电子光谱)比较，红外吸收光谱更具指纹特征性。本类药物的原料药均采用红外分光光度法鉴别；亦有少数制剂采用溶剂提取法去除辅料后测定，如布洛芬和对乙酰氨基酚、萘普生、尼美舒利片剂分别用丙酮、甲醇和无水乙醇溶解、滤过、干燥后，采用红外分光光度法鉴别。八、色谱法(一) 薄层色谱法药物制剂中存在大量的辅料，常对原料药所使用的某些鉴别方法，如红外光谱法构成一定的干扰。虽部分药物可用溶剂提取法去除辅料的干扰，但多数药物制剂中辅料的干扰难以有效去除，此时，可采用薄层色谱法(TLC)进行分离与鉴别。如二氟尼柳、美洛昔康等制剂均采用TLC法鉴别。二氟尼柳胶囊的鉴别：

13、以硅胶GF254为固定相，正己烷-二氧六环-冰醋酸(85105)为展开剂，展开后在紫外光(254nm)灯下检视，供试品溶液所显主斑点的位置和颜色应与对照品溶液的主斑点相同。美洛昔康制剂则以三氯甲烷-甲醇-二乙胺(6057.5)为展开剂，同法鉴别。(二) 高效液相色谱法虽然TLC设备简单、操作方便，但随着高效液相色谱法(HPLC)在药物制剂分析，尤其是在含量测定中的大量应用，近年来更多应用HPLC进行制剂的鉴别。如美洛昔康制剂采用有关物质检查的HPLC色谱条件进行鉴别，而阿司匹林、甲芬那酸、双氯芬酸钠、布洛芬、萘普生、吲哚美辛、对乙酰氨基酚等的多种制剂则均直接取含量测定项下记录的HPLC色谱图进

14、行鉴别。如阿司匹林片、泡腾片、肠溶片、肠溶胶囊等制剂均采用本法鉴别，方法如下：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。当TLC和HPLC均有收载时，二者可任选其一，如美洛昔康片的鉴别。第三节 特殊杂质及其检查法典型芳酸类非甾体抗炎药物的有关物质信息见表6-3。典型非甾体抗炎药物的主要有关物质药物名称有关物质结构式代码/名称药物名称有关物质结构式代码/名称阿司匹林双水杨酯游离水杨酸萘普生I 6-甲氧基-2-萘乙酮甲芬那酸2,3-二甲基苯胺对乙酰氨基酚氨基酚对氯苯乙酰胺一、阿司匹林及双水杨酯中游离水杨酸与有关物质的检查(一) 阿司匹林及双水杨酯的合成

15、阿司匹林及双水杨酯的合成路线如下：(二) 阿司匹林中游离水杨酸与有关物质的检查1游离水杨酸 阿司匹林为乙酰水杨酸，在生产过程中因乙酰化反应不完全，或在精制过程及贮藏期间的水解而产生水杨酸。游离水杨酸对人体有毒性，且其分子中所含的酚羟基在空气中易被逐渐氧化生成一系列有色醌型化合物，如淡黄、红棕甚至深棕色而使阿司匹林成品变色，因而需加以控制。ChP曾基于水杨酸可在弱酸性溶液中与高价铁盐生成紫堇色配位化合物，而阿司匹林结构中无游离酚羟基，不发生该反应的原理，用稀硫酸铁铵溶液显色反应检查游离水杨酸。但由于在供试品溶液制备过程中阿司匹林可发生水解产生新的游离水杨酸，所以ChP2010采用1%冰醋酸甲醇溶

16、液制备供试品溶液 (10mg/ml)，以防阿司匹林水解，同时采用高效液相色谱法(HPLC)检查，用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)为填充剂，以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水(205 5 70)为流动相，检测波长为303nm。按外标法以峰面积计算，游离水杨酸不得过0.1%。通常，制剂不再检查原料药物检查项下的相关杂质，但阿司匹林在制剂过程中易水解生成水杨酸，因此药典规定阿司匹林片、肠溶片、肠溶胶囊、泡腾片及栓剂均照原料药方法与色谱条件检查水杨酸，限量分别为0.3%、1.5%、1.0%、3.0%和3.0%。2有关物质 阿司匹林中的“有关物质”系指除“游离水杨酸”外的合成原料苯酚及其他合成副产物，如醋酸苯

17、酯、水杨酸苯酯、水杨酰水杨酸、水杨酸酐、乙酰水杨酸苯酯、乙酰水杨酰水杨酸及乙酰水杨酸酐等杂质。ChP采用HPLC法检查：使用ODS色谱柱，以检查“游离水杨酸”的流动相为流动相A、乙腈为流动相B，梯度洗脱，检测波长为276nm。以供试品溶液 (10mg/ml) 的稀释液(0.5%)为对照，除水杨酸峰外，其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(图6-2)。图6-2 阿司匹林有关物质HPLC检查色谱图a:阿司匹林供试品(10mg/ml)；b:0.5%自身对照(50mg/ml)；c:0.05%自身对照(灵敏度试验5mg/ml)；d:水杨酸对照(10g/ml)；e:空白1:阿司匹林；2:水杨酸；3

18、:乙酰水杨酰水杨酸(三) 双水杨酯中游离水杨酸的检查双水杨酯为水杨酰水杨酸，以水杨酸为原料经酯化而成。在生产过程中因酯化反应不完全，或在精制过程及贮藏期间的水解均可产生水杨酸。其检查原理是利用水杨酸可与三价铁生成有色配位化合物的特性，用硝酸铁溶液显色后，在530nm的波长处测定吸光度，规定供试品溶液的吸光度不得大于水杨酸对照溶液的吸光度，限度为0.5%。双水杨酯片同法检查，限度为1.5%。二、甲芬那酸中2.3-二甲基苯胺的检查(一) 合成工艺甲芬那酸主要以邻-氯苯甲酸(o-chlorobenzoic acid)和2，3-二甲基苯胺(2，3-dimethyl- aniline)为原料，在铜的催化

19、下缩合而成。(二) 2,3-二甲基苯胺的检查ChP曾采用HPLC法检查有关物质，单一杂质的限量为0.1%，杂质总量为0.5%。但因为2,3-二甲基苯胺可引起高铁血红蛋白血症，并对中枢神经系统及肝脏有损害。故ChP除规定采用HPLC法检查“有关物质”外，采用气相色谱法检查2,3-二甲基苯胺，限度为0.01%。方法如下：1色谱条件 以聚乙二醇(PEG-20M)为固定液的毛细管色谱柱；对照品溶液采用恒温150，供试品溶液采用程序升温，起始温度150维持至2,3-二甲基苯胺峰出峰后，以每分钟70的速率升温至220，维持20分钟；进样口温度250，检测器温度260。2溶液制备与测定法 取本品适量，精密称

20、定，用二氯甲烷-甲醇(31)溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含25mg的溶液，作为供试品溶液；另取2,3-二甲基苯胺适量，精密称定，用二氯甲烷-甲醇(31)溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含2.5g 的溶液，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液和对照品溶液各1l，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液中如有与2,3-二甲基苯胺保留时间一致的色谱峰，其峰面积不得大于对照品溶液中2,3-二甲基苯胺峰面积。三、二氟尼柳中有关物质的检查(一) 合成工艺二氟尼柳的合成路线有多条，其中较为常用的是：以2,4-二氟苯胺()为起始原料，经过改良的Gomberg-Bachmann偶联反应制得2,4-二氟联

21、苯()，经过Friedel-Crafts酰化反应得到4-(2,4-二氟苯基)苯乙酮()，再经Baeyer-Villiger氧化反应制成4-(2,4-二氟苯基)苯酚乙酯()，水解转化为4-(2,4-二氟苯基)苯酚()，最后经羧化反应得到二氟尼柳()。(二) 有关物质检查二氟尼柳在合成过程中可能产生多种苯或联苯类中间体及副产物，而且其制备工艺存在多条合成路线，产品中可能存在的有关物质的结构与性质相差较大，使用单一模式的色谱分离技术难以完全检出有关物质。故ChP分别采用TLC(正相)和反相HPLC法，以自身对照法检查有关物质A和B。方法如下：1有关物质A 取本品，加甲醇溶解并稀释制成每1ml溶液中约

22、含10mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加甲醇定量稀释制成每1ml溶液中约含50g的溶液，作为对照溶液，吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正己烷-二氧六环-冰醋酸(85105)为展开剂，展开，晾干，置紫外光(254nm)灯下检视，供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深。2有关物质B 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-甲醇-乙腈-冰醋酸(5523302)为流动相，检测波长为254nm，理论板数按二氟尼柳峰计算不得低于2000。精密量取有关物质A项下的对照溶液5l，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25%；再精

23、密量取有关物质A项下的供试品溶液与对照溶液各5l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(0.5%)。四、萘普生中6-甲氧基-2-萘乙酮等有关物质的检查(一) 合成工艺萘普生早期的合成工艺多采用1981年由Giordano等提出的1,2-芳基迁移重排合成法，即以6-甲氧基-2-丙酰基萘()为原料，经-溴化的化合物，再经1,2-丙二醇缩酮化的化合物，最后经分子重排、水解即得萘普生()1。但本合成工艺中的溴化反应所使用的溴化试剂对环境污染严重，目前萘普生的合成路线有多条，如以2-萘甲醚()为起始原料，经酰化制

24、备6-甲氧基-2-乙酰萘(6-甲氧基-2-萘乙酮)()，再经还原、羧化制成2-羟基-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸()，最后经催化氢化得到萘普生()2。(二) 有关物质检查目前，萘普生的合成工艺主要以2-萘甲醚或6-甲氧基-2-萘乙酮为起始原料，故检查6-甲氧基-2-萘乙酮及其他有关物质。方法如下：1色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(7525)，用磷酸调节pH至3.0为流动相；检测波长为240nm，理论板数按萘普生峰计算不得低于5000，萘普生峰与各相邻杂质峰的分离度应符合要求。2溶液制备与测定法 避光操作。取本品适量，加流动

25、相适量使溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；另取6-甲氧基-2-萘乙酮(杂质)对照品适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含50g的溶液，作为对照品溶液；分别精密量取供试品溶液1ml和对照品溶液2ml，置同一200ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照溶液20l，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使萘普生色谱峰的峰高约为满量程的20%；再精密量取供试品溶液与对照溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍，供试品溶液色谱图中如有与杂质峰保留时间一致的色谱峰，其峰面积不得大于对照溶液中杂质峰面积(0.1%)；其他单个杂

26、质峰面积不得大于对照溶液中杂质峰面积的2倍(0.2%)；各杂质峰面积的和不得大于对照溶液中萘普生峰面积(0.5%)。五、对乙酰氨基酚中氨基酚和对氯苯乙酰胺的检查(一) 合成工艺对乙酰氨基酚的合成工艺主要是：以对硝基氯苯为原料，水解后制得对硝基酚，经还原生成对氨基酚，再经乙酰化制得成品；或以苯酚为原料，经亚硝基化及还原反应制得对氨基酚。(二) 有关物质检查由于本品的合成路线较多，不同生产工艺引入的有关杂质不尽相同，它们主要包括合成中间体、副产物及分解产物，如对硝基酚、对氨基酚、对氯苯胺、对氯苯乙酰胺、o-乙酰基对乙酰氨基酚、偶氮苯、氧化偶氮苯、苯醌和醌亚胺等。ChP采用HPLC法检查对氨基酚及其

27、他有关物质，因为对氯苯乙酰胺的极性小，无法在同一色谱条件下一并检查，故药典将流动相中甲醇的比例由10%提高至40%后单独检查对氯苯乙酰胺。1对氨基酚及有关物质 临用新制。取本品适量，精密称定，加溶剂甲醇-水(46)制成每1ml中约含20mg的溶液，作为供试品溶液；另取对氨基酚对照品和对乙酰氨基酚对照品适量，精密称定，加上述溶剂溶解并制成每1ml中约含对氨基酚1g和对乙酰氨基酚20g的混合溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法试验。用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠8.95g，磷酸二氢钠3.9g，加水溶解至1000ml，加10%四丁基氢氧化铵溶液12ml)-甲醇(9010

28、)为流动相；检测波长为245nm；柱温为40；理论板数按对乙酰氨基酚峰计算不低于2000，对氨基酚峰与对乙酰氨基酚峰的分离度应符合要求。取对照品溶液20l，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使对氨基酚色谱峰的峰高约为满量程的10%，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍；供试品溶液的色谱图中如有与对照品溶液中对氨基酚保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，含对氨基酚不得过0.005%；其他杂质峰面积均不得大于对照品溶液中对乙酰氨基酚的峰面积(0.1%)；杂质总量不得过0.5%。2对氯苯乙酰胺 临用新制。取对氨基酚及有关物质项下的供试品

29、溶液作为供试品溶液；另取对氯苯乙酰胺对照品适量，精密称定，加上述溶剂溶解并制成每1 ml中约含1g的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法试验。用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠8.95g，磷酸二氢钠3.9g，加水溶解至1000ml，加10%四丁基氢氧化铵12ml)-甲醇(6040)为流动相；检测波长为245nm；柱温为40；理论板数按对乙酰氨基酚峰计算不低于2000，对氯苯乙酰胺峰与对乙酰氨基酚峰的分离度应符合要求。取对照品溶液20l，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使对氯苯乙酰胺色谱峰的峰高约为满量程的10%，再精密量取供试品溶液与对照品溶液各20l ，分别注入液相

30、色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，含对氯苯乙酰胺不得超过0.005%。第四节 含量测定基于药物结构中游离羧基的酸性和芳环的紫外吸收特性，本类药物原料药的含量测定主要采用酸碱滴定法，制剂的检查性定量测定，如溶出度(释放度)、含量均匀度等主要采用紫外-可见分光光度法，而制剂的含量测定则采用紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法。一、酸碱滴定法本类药物原料药的酸碱滴定法主要采用直接滴定法，亦可采用剩余量回滴法或非水溶液滴定法。(一) 直接滴定法直接滴定法即将药物溶于中性乙醇、甲醇或丙酮中，以酚酞、酚红或酚磺酞为指示剂，用氢氧化钠滴定液直接滴定。以阿司匹林含量测定为例，反应原理与测定法如下：取本

31、品约0.4g，精密称定，加中性乙醇(对酚酞指示液显中性)20ml溶解后，加酚酞指示液3滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于18.02mg的C9H8O4。阿司匹林在水中微溶，易溶于乙醇，故使用乙醇为溶剂。因本品相对于氢氧化钠为弱酸，用氢氧化钠滴定时，化学计量点偏碱性，故指示剂选用在碱性区变色的酚酞。因乙醇对酚酞指示剂显酸性，可消耗氢氧化钠而使测定结果偏高。所以，乙醇在使用之前需先用氢氧化钠中和至对酚酞指示剂显中性。滴定应在不断振摇下稍快进行，以防止局部碱浓度过大，致使阿司匹林酯结构水解。温度在040范围内对测定结果无显著影响。因本法缺乏

32、专属性，易受阿司匹林的水解产物水杨酸及醋酸的干扰，故本法不适用于水杨酸含量较高的试样测定。水杨酸、阿司匹林、双水杨酯、二氟尼柳、甲芬那酸、布洛芬、酮洛芬、萘普生及尼美舒利等均采用本法测定含量。其中，二氟尼柳和萘普生在甲醇中的溶解度较大，使用甲醇-水为溶剂；尼美舒利则使用丙酮为溶剂。二氟尼柳使用酚红指示剂、甲芬那酸则使用酚磺酞指示剂。(二) 剩余量滴定法美洛昔康含有与羰基共轭的烯醇式羟基，具有羧酸性质，显一价酸性。故亦可用氢氧化钠滴定液滴定。但本品甲醇、乙醇及水中极微溶解或几乎不溶，在丙酮中微溶。所以，ChP使用定量过量的氢氧化钠滴定液溶解后，用盐酸滴定液回滴定剩余的氢氧化钠滴定液。方法如下：取

33、本品约0.4g，精密称定，精密加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)25ml，微温溶解，放冷，加中性乙醇(对溴麝香草酚蓝指示液显中性)100ml，加溴麝香草酚蓝指示液10滴，用盐酸滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于35.14mg的C14H13N3O4S2。(三) 水解后剩余量滴定法1水解后剩余量滴定法 利用阿司匹林酯结构在碱性溶液中易于水解的特性，加入定量过量的氢氧化钠滴定液，加热使酯键水解后，再用硫酸滴定液回滴定剩余的氢氧化钠滴定液。USP32-NF27、BP2009、JP15等均采用本法测定阿司匹林含量。2NaOH

34、 + H2SO4Na2SO4 + 2H2OUSP32-NF27方法：取本品约1.5g，精密称定，加氢氧化钠滴定液(0.5mol/L)50.0ml，混合，缓缓煮沸10分钟，放冷，加酚酞指示液，用硫酸滴定液(0.25mol/L)滴定，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.5mol/L)相当于45.04mg的C9H8O4。碱液在受热时易吸收二氧化碳，生成碳酸盐，当用酸回滴定时，酸滴定液的消耗体积会减小，使测定结果偏高。故需在相同条件下进行空白试验校正。为减少二氧化碳的影响，JP15在装有附带二氧化碳吸收管(Soda Lime，氢氧化钙与氢氧化钠/钾的混合物)的回流冷凝器的锥形瓶中

35、加热水解。从上述反应式可知：阿司匹林与氢氧化钠反应的摩尔比为12。则：T=0.5(1/2) 180.16 = 45.04(mg/m1)式中，V0为空白试验消耗硫酸滴定液的体积(m1)；V为样品测定时消耗硫酸滴定液的体积(m1)；W为阿司匹林样品的称取量(g)；F为硫酸滴定液的浓度校正因数；T为氢氧化钠滴定液的滴定度。2两步滴定法 两步滴定法系水解后剩余量滴定法的改进。因阿司匹林片剂中除存在其水解产物水杨酸及醋酸外，在制剂工艺中添加了抑制阿司匹林水解的稳定剂酒石酸或枸橼酸。因而无法使用直接滴定法测定含量，且使用水解后剩余量滴定法时，稳定剂对测定亦存在干扰，为消除片剂中酸性降解产物及稳定剂对阿司匹

36、林测定的干扰，ChP2005曾收载两步滴定法测定阿司匹林片和肠溶片的含量。两步滴定法系指测定过程分为两步进行：第一步中和制剂中的酸性水解产物和酸性稳定剂(同时中和阿司匹林的游离羧基)，以消除其干扰；第二步水解与滴定，即水解后剩余量滴定法。阿司匹林片含量测定方法如下：中和：取本品10片，精密称定，研细，精密称取片粉适量(约相当于阿司匹林0.3g)，置锥形瓶中，加中性乙醇(对酚酞指示液显中性)20ml，振摇使阿司匹林溶解，加酚酞指示液3滴，滴加氢氧化钠滴定液(0.1moL/L)至溶液显粉红色。此时中和了供试品中存在的游离酸，阿司匹林也同时成为钠盐。水解与滴定：在中和后的供试品溶液中，精密加氢氧化钠

37、滴定液(0.1mol/L)40ml，置水浴上加热15分钟并时时振摇，迅速放冷至室温，用硫酸滴定液(0.05mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于18.02mg的C9H8O4。含量计算：供试品中阿司匹林的含量，由水解时消耗的碱量计算。因为在第一步中和时，已将阿司匹林的游离羧酸中和，所以在第二步水解后剩余量滴定法时阿司匹林与氢氧化钠反应的摩尔比为11，故氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)的滴定度T = 0.1(1/1) 180.16=18.02(mg/m1)。含量计算式如下：式中，V0为空白试验消耗硫酸滴定液的体积(m1)；V为样品测定时

38、消耗硫酸滴定液的体积(ml)；F为硫酸滴定液的浓度校正因数；T为氢氧化钠滴定液的滴定度(mg/ml)；W为供试品片粉的取样量(g)；W为供试品的平均片重(g)；标示量为片剂的规格(mg/片)。(四) 非水溶液滴定法吡罗昔康具有吡啶环、显碱性，可在冰醋酸溶液中用高氯酸滴定液滴定。方法如下：取本品约0.2g，精密称定，加冰醋酸20ml使溶解，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液显蓝绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于33.14mg的C15H13N3O4S。二、紫外-可见分光光度法本类药物制剂含量测定可采用直接紫外-可见分光

39、光度法，或采用柱分配色谱-紫外分光光度法。(一)直接紫外-可见分光光度法ChP2010收载的二氟尼柳、美洛昔康、尼美舒利制剂，对乙酰氨基酚及其部分制剂均采用本法测定。以二氟尼柳胶囊含量测定为例，方法如下：取装量差异项下的内容物，研细，精密称取适量(约相当于二氟尼柳0.1g)，置100ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸乙醇溶液适量，超声处理10分钟使二氟尼柳溶解，放冷，用0.1mol/L的盐酸乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置100ml量瓶中，用0.1mol/L的盐酸乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，在315nm的波长处测定吸光度；另取二氟尼柳对照品，精密称定，用0.1mol/L

40、的盐酸乙醇溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含50g的溶液作为对照品溶液，同法测定，计算，即得。式中，AS和AR分别为供试品溶液和对照品溶液的吸光度；CR为对照品溶液的浓度(mg/m1)；W为胶囊平均装量(g/粒)；W为胶囊内容物细粉的称取量(g)；D为供试品溶液的稀释体积(ml，D=100100/5=2000)；标示量为胶囊剂的规格(mg/粒)。三、高效液相色谱法药物制剂中的有关物质、辅料、稳定剂等，常对主成分的含量测定构成干扰。除可采用两步滴定法、柱分配色谱-紫外分光光度法外，高效液相色谱法作为在线分离检测技术被广泛应用于本类药物制剂的含量测定。ChP2010收载的典型芳酸类非甾体抗炎药物

41、制剂大多采用离子抑制-反相高效液相色谱法测定，用外标法计算含量。以阿司匹林栓的含量测定为例，方法如下：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水(205570)为流动相；检测波长为276nm。理论板数按阿司匹林峰计算不低于3000，阿司匹林峰与水杨酸峰的分离度应符合要求。测定法：取本品5粒，精密称定，置小烧杯中，在4050水浴上微温熔融，在不断搅拌下冷却至室温，精密称取适量(约相当于阿司匹林0.1g)，置50ml量瓶中，加1%冰醋酸的甲醇溶液适量，在4050水浴中充分振摇使阿司匹林溶解，放冷，用1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却1小时

42、，取出，迅速滤过，取续滤液作为供试品贮备液。精密量取供试品贮备液5ml，置100ml量瓶中，用1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取10l，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿司匹林对照品，精密称定，加1%冰醋酸的甲醇溶液振摇使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。式中，CR为对照品溶液浓度(mg/ml)；AX和AR分别为供试品溶液和对照品溶液的峰面积；D为稀释体积(ml，D=50100/5=1000)；W为栓剂熔融物取样量(g)；W为栓剂平均粒重(g)；标示量为栓剂规格(mg/支)。本法为反相离子抑制色谱，流动相中添加冰醋酸是为抑制阿司

43、匹林的解离，进而消除因色谱柱对阿司匹林的吸附而造成的色谱峰拖尾现象。同时，流动相及供试品溶液中的醋酸也可抑制阿司匹林的水解，增加溶液的稳定性。ChP2010收载的典型芳酸类非甾体抗炎药物制剂含量测定的色谱条件及定量方法见表6-4。典型非甾体抗炎药物制剂含量测定的色谱条件与定量方法药物制剂色谱条件定量方法色谱柱流动相检测波长阿司匹林片/肠溶片/肠溶胶囊/泡腾片/栓ODS乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水(205570)276nm外标法/峰面积甲芬那酸片/胶囊ODS0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(用氨试液调节pH至5.0)-乙腈-四氢呋喃(4046 14)254nm外标法/峰面积双氯芬酸钠肠溶片ODS甲

44、醇-0.12%冰醋酸溶液(2080)276nm外标法/峰面积布洛芬片/胶囊/缓释胶囊/口服溶液/糖浆ODS醋酸钠缓冲液(取醋酸钠6.13g，加水750ml使溶解，用冰醋酸调节pH至2.5)-乙腈(4060)263nm外标法/峰面积布洛芬混悬滴剂ODS甲醇-乙腈-水-磷酸(6510250.03)220nm外标法/峰面积酮洛芬肠溶胶囊/搽剂ODS磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾68.0g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH至3.50.1)-乙腈-水(24355)255nm外标法/峰面积萘普生片/胶囊/栓/颗粒ODS甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(7525)，用磷酸调节pH至3.0272

45、nm外标法/峰面积对乙酰氨基酚泡腾片/注射液/滴剂/凝胶ODS磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠二水合物15.04g、磷酸氢二钠0.0627g，加水溶解并稀释至1000ml，调节pH至4.5)-甲醇(8020)254nm外标法/峰面积药品质量控制中现代分析方法的进展随着我国对药品质量的日益重视和自主创新药物研制的迫切需要，色谱分析和光谱分析已成为药物研究中最重要的分析方法，色谱分析和光谱分析技术结合的联用技术更是必不可少，发展亦十分迅速。第一节 毛细管电泳及其应用毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。与HPLC法相似，两者均为液

46、相分离技术，有多种分离模式，且仪器操作可自动化；但遵循不同的分离机制。虽然由于CE的工作原理和运行方式所限，CE检出的灵敏度和精密度通常不及HPLC，但是，CE和HPLC的适用范围在很大程度上互为补充。所以，早在2000年USP24中就收录了CE法。自此，毛细管电泳法就相继被国际上主要的药典所收录。这为毛细管电泳在药物分析中更广泛的应用奠定了基础。CE具有如下优点：1.高效 理论板数为每米几十万，高者可达几百万乃至几千万，而HPLC一般为几千到几万。2.高速 最快可在约1分钟内完成分离。有文献报道，在4分钟内可分离10种蛋白质，1.7分钟内分离19种阳离子及3分钟内分离30种阴离子。3.微量

47、只需纳升级的进样量，仅为HPLC的几百分之一。4.低消耗 只需少量(ml量)溶剂和价格低廉的毛细管。所以CE也常常被称为HPCE。CE使用的检测器主要为紫外-可见分光光度检测器，此外还有激光诱导荧光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。以下重点讨论毛细管电泳的主要分离模式，及其在药物分析中的应用。一、CE的主要分离模式采用CE作为药物分离的手段时，首先需要根据待分离物质的存在状态来选择不同的分离模式。(一) 毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis，CZE) CZE是毛细管电泳中最基本、应用最广泛的一种分离模式。主要适用于以离子状态存在的样品。在电解质溶液中，

48、带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移，产生电泳流。CE通常采用的是石英毛细管柱，在一般情况下(pH3)内表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子整体地朝负极方向移动，产生电渗流。在多数情况下，电渗流的速度是泳流速度的57倍。CZE 既可以使用水相缓冲溶液，也可以使用有机相缓冲溶液进行分离。在有机溶剂中进行的CZE分离常被称为非水毛细管电泳(nonaqueous capillary electrophoresis，NACE)。目前，常用的有机溶剂主要有：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、醋酸、甲酰胺、N-甲基甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚

49、砜和乙腈等。 (二) 胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC或MEKC) MECC是采用CZE技术并结合色谱原理而形成，主要用于非离子状态的样品，亦称电中性物质的分离分析。MECC法的原理是在缓冲液中加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠，形成胶束，被分离物质在水和胶束两相分配，各溶质因分配系数的差别而实现分离。通常疏水性较强的物质与胶束的作用亦较强，结合较稳定，在两相之间的分配系数大，相对于疏水性较弱物质的迁移亦较慢，未结合者则随电渗流流出。因此中性物质按疏水性的不同而实现分离。 (三) 毛细管凝胶电泳(c

50、apillary gel electrophoresis，CGE) CGE是毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成凝胶作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性，类似于分子筛的作用，使溶质按分子大小逐一进行分离。由于凝胶的黏度大，可减少溶质的扩散，使被分离组分峰形尖锐，能达到CE中最高的柱效。该方法主要用于分析蛋白质、DNA等生物大分子。若采用黏度低的线性聚合物，如葡聚糖、聚环氧乙烷或甲基纤维素等的筛分作用进行分析，则称为毛细管无胶筛分。有时将它们统称为毛细管筛分电泳，包括凝胶电泳和无胶筛分电泳两类 。第二节 手性HPLC技术与应用临床应用的手性药物，除天然和半合成药物外，人工合成的手性药物仍以外消

51、旋体供药为主，约占全部合成手性药物的87%以上。而近20年以来随着药学研究工作的深入，已表明药物对映体具有不同的药动学和药效学5，如熟知的DL-()合霉素的疗效仅为D()氯霉素的一半；普萘洛尔(propranolol)L-异构体的药物活性比D-异构体大一百倍；D-天门冬素是甜味，而L-天门冬素则是苦味；()美沙酮是强止痛剂，而(+)美沙酮无效。另外药物对映体的毒性也存在差别，如沙利度胺(thalidomide)的两个对映体对小鼠的镇静作用相近，但只有S()异构体及其代谢物才有胚胎毒及致畸作用；氯胺酮为麻醉和镇痛药，但 存在产生幻觉等副作用，研究发现，S(+)体作用比R()体强34倍，而毒副作用

52、明显与后者有关。由此可见，建立和发展快速而灵敏的分离(或拆分)和测定对映体药物的方法，以有效地进行以下四个主要方面的工作是十分重要和必要的。对某些手性药物进行对映体的纯度检查；生物体液中药物对映体的分离分析研究可探索血药浓度与临床疗效的关系；在研制手性药物过程中，可分别评价单个对映体的效价、毒性、不良反应以及药动学性质；必要时，可进行手性药物对映体的制备分离(或拆分)。一、手性药物拆分方法与机制对映体化合物之间除了对偏振光的偏转方向恰好相反外，其理化性质是完全相同的，因而难于分离。1950年Dalgliesh采用纸色谱拆分了手性药物芳族氨基酸，由此提出三点相互作用的理论概念。在其后的20年中，

53、该法在用于分离其他DL-氨基酸方面取得了极大成功。这就是在对映体拆分理论中颇为流行的“三点手性识别模式”。Dalgliesh认为至少要有三个作用力，其中一个要有立体选择性，可以是吸引的，也可以是排斥的。如图21-9所示。这些相互作用可以是氢键、偶极-偶极作用、-作用、静电作用、疏水作用或空间作用。图中，对映体()与CSP相互作用的部位为AA、BB和CC；而它的对映体()缺少CC作用部位。如果CC是相互吸引部位，则对映体()比()在柱上的保留时间长；如果CC是相互排斥部位，则()可被先洗脱；如果CC之间相互作用极弱或完全没有作用，则观察不到分离。这就是三点模型的关键概念。因此，手性HPLC拆分法

54、通常分为直接法和间接法两大类。对映体混合物以手性试剂作柱前衍生，形成一对非对映异构体，然后以常规(偶尔也见手性)固定相分离，称为间接法，也称手性衍生试剂(chiral derivatization reagent，CDR)法；未作上述处理，使用手性流动相(CMP)或手性固定相(CSP)拆分者即是直接法。其共同特点是，均以现代HPLC技术为基础，并引入不对称中心(或光活性分子)；不同的是CDR法将其引入分子(溶质)内，而CMP和CSP则引入分子间。引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异是手性HPLC进行光学异构体拆分的基础。(一) 柱前手性衍生化法对映异构体与手性试剂反应，如醇类与手性酸或

55、酰氯酯类、胺类或氨基酸与手性异硫氰酸酯类或硫脲等反应，其产物为相应的非对映异构体(diastereoisomer，DSTM)对，所以也称为非对映异构化衍生。SE为光活性试剂，也称“选择器”，SA为手性溶质，也称“选择靶”。本法需要高光学纯度的手性衍生化试剂，衍生化反应往往比较烦琐费时；各对映体衍生化反应的速率有时也有不同。尽管如此，由于可以采用价格便宜、柱效较高的非手性柱和通过适当的衍生化反应可提高检测灵敏度，以及衍生化过程中可伴随样品的纯化等优点，柱前衍生化的方法仍然是当前手性药物拆分、尤其是生物样品中药物对映体分离和测定的常用方法。常用的CDR有羧酸衍生物类、胺类、异硫氰酸酯、异氰酸酯类、

56、萘衍生物类、光学活性氨基酸类及固相衍生化试剂等，其结构以及可分离的对映体类型可参阅有关总结。(二) 手性流动相拆分法手性流动相(CMP)拆分法也称手性洗脱法或手性流动相添加剂法。它与CDR法不同之处在于不必事先将样品制备成衍生物，而只需将手性试剂加入流动相中，手性添加剂与样品所形成的各种手性络合物虽然不及CDR法那样牢固，但它所依据的手性识别作用和络合物的非对映异构性质却基本类同。常用的手性添加剂为：1.配基交换型手性添加剂(chiral ligand-exchang complexes，CLEC) 在众多的手性添加剂中以该类添加剂的基础理论研究较成熟，应用也较广。在CLEC中，手性配基多为光

57、活性氨基酸(AA)或其衍生物。它们和二价金属离子螯合，以适当的浓度分布于流动相中，遇到药物消旋体，共同形成配位络合物对，然后在反相或正相柱上完成拆分。2.环糊精类添加剂 环糊精(cyclodextrins，CD)是由吡喃葡萄糖通过a-(1,4)糖苷键连接 构成的环状低聚糖，CD分子呈截头圆锥体状，边缘排列有许多羟基，内部则是相对疏水的空腔。如果待分析化合物的分子大小与空腔相符合，则可形成CD包合物。常用的CD主要为-CD、-CD和新型改性CD。对溶质分子基团体积(直径)的选择性及其手性识别作用，亦颇有应用前景。3.手性离子对络合剂(chiral ion pair complex，CIPC) 荷

58、电药物能与手性离子对缔合成电中性络合物，即离子对分布于固定相上，其保留特征(如k)可采用手性离子对浓度及其种类调节外，同时还可由外加的手性络合剂控制。常用的手性离子对络合剂有(+)-10-樟脑磺酸、奎宁和奎尼丁等。除了上述两类添加剂外，环糊精即环型葡聚糖及其衍生物，对溶质分子基团体积(直径)的选择性及其手性识别作用，颇有应用价值。(三) 手性固定相拆分法目前市售的手性固定相品种很多，其分类方法亦较多。根据拆分过程中固定相与对映体之间的相互作用，可分为吸附型、模拟酶移植型、电荷转移型、配体交换型等；根据固定相的材料，又可分为：Pirkle型(“刷型”)手性固定相；蛋白质手性固定相；手性聚合物固定

59、相；环糊精类手性固定相；大环抗生素手性固定相；配体交换手性固定相；冠醚手性固定相等。第三节 GC-MS技术与应用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)经过约40年的发展后已较为成熟，它集气相色谱法的高速、高分离效能、高灵敏度和质谱的高选择性于一体，通过总离子流谱图结合质谱图和综合气相保留值法能对多组分混合物进行定性鉴定和分子结构的准确判断，通过峰匹配法、总离子流质量色谱法、选择离子检测法可对待测物进行定量分析，并由于灵敏度高、定量准确，逐渐成为分析微量痕量物质的重要手段之一。目前多用毛细管气相色谱与质谱联用，检测限已达10-

60、910-12g水平。20世纪70年代，GC-MS已开始作为商品化仪器出售；80年代后已开始普及应用，目前技术已非常成熟。气相色谱仪可以看作是质谱仪的进样系统，同时也可以把质谱仪看作是色谱仪的检测器。因质谱仪灵敏度高、特征性强、要求分析试样必须是高度纯净物(除MS/MS联用技术外)，色谱技术为质谱分析提供了色谱纯化的试样，质谱仪则提供准确的结构信息。GC-MS联用技术是供试品经GC分离为单一组分，按其不同的保留时间，与载气同时流出色谱柱，经过分子分离器接口(interface)，除去载气，保留组分进入MS仪离子源。由于此时载气和组分的量甚微，不致于严重破坏MS仪的真空度，各组分分子进入离子源后被

61、离子化，样品分子转变为离子。对于有机化合物，在多数情况下，由于在离子化过程中接受了过多的能量，新生的分子离子会进一步裂解，生成各种碎片离子，经分析检测，记录为MS图。经计算机自动检索核对，即可迅速鉴别样品，方法专属灵敏。因此，GC-MS联用主要包括色谱柱、接口和质谱仪的选择。接口的选择尤为重要。色谱柱分为填充柱和毛细管柱两类。毛细管柱的发展，FSOT柱本身具有弹性，可拉直，易与GC-MS仪离子源连接，而且键合或横向交联的固定相在使用时流失较少，所以现代GC-MS大多采用这种色谱柱。GC-MS仪的接口组件是解决气相色谱和质谱联用的关键组件，它起传输试样、匹配两者工作流量(也就是工作气压)的作用。

62、理想的接口应能去除全部载气而使试样毫无损失地从气相色谱仪传输给质谱仪。要求试样传输产率高，浓缩系数大，延时短，色谱的峰展宽少。一般接口可以分为三类：直接导入型、分流型和浓缩型。最简单、也是目前常用的一种接口是毛细管柱直接导入型接口(图21-20)。这种接口是将毛细管色谱柱的末端直接插入质谱仪离子源内，柱的流出物直接进入电离盒区，然后通过离子源高真空泵组排入大气。接口只起保护插入段毛细管柱和控制温度的作用。这种接口的优点是构造简单和产率高(100%)，缺点是无浓缩作用，不适合流量大于1mlatm/min的大口径的毛细管柱和填充柱。气相色谱-质谱法分析冠心苏合丸中挥发性组分：冠心苏合丸为深棕色至棕

63、褐色的大蜜丸，气芳香、味苦、凉。具有理气宽胸，止痛之功效。它是由冰片(borneol)、乳香(Resona Boswellia)、檀香(Lignum Santali Albi)、苏合香(Styrax)、青木香(Radix Aristolochiae)五味药材组合而成，其中主要有效成分为冰片和苯甲酸苄酯。采用水蒸气蒸馏法方法提取冠心苏合丸的挥发性组分，用GC/MS法对挥发性组分进行分离，通过检索标准谱图库，并结合有关文献确认挥发性组分中的化学成分，检验是否涵盖五味中药材的代表性成分，为质量监控和真伪鉴别提供科学依据。(1)挥发性组分分析：取切薄片的冠心苏合丸A 100g，加适量去离子水浸泡24小时。然后将其移入圆底烧瓶中，用水蒸气蒸馏法提取6小时，馏出液用乙醚萃取，加入无水硫酸钠干燥过夜后用旋转蒸发器除去乙醚，获得具有特殊芳香味的透明液体。(2)GC/MS实验条件色谱条件：色谱柱为HP-5(30m250mm0.25mm)弹性石英毛细管柱；程序升温：60(5/min)200；进样口温度230；载气(He)流量1ml/min；进样量0.2ml；分流比801。质谱条件：电子轰击(EI)离子源；离子源温度200；接口温度230；四极杆温度150；电子能量70eV；电子倍增