微生物限度方法学验证方案

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1、 微生物限度检测方法学验证方案文件编号：P-批准签字页方案起草岗位/职位姓名签字日期微生物岗/QC人员方案审核岗位/职位姓名签字日期微生物岗/组长生产部/部长质量部/QA监督员方案批准岗位/职位姓名签字日期总工质量受权人目录1.目的42.范围43.责任者及职责44.验证简介45 验证过程76 结果判断87 结论和建议88 异常情况报告89 再验证810附件8附件1：培养基的灵敏度复核9附件2：稀释液的无菌性检查10附件3：方法验证111. 目的按照中国药典2010版（第三部），采用薄膜过滤法进行微生物限度检查，本方案对新修订的方法进行验证。2. 范围本公司要求进行微生物限度检查的原辅料和制剂，

2、中间制品以及消毒剂。3. 责任者及职责部门职责质量部QC起草并审核验证方案进行验证试验的具体操作完成验证记录中相关操作记录的填写根据验证结果起草和审核验证报告总工负责审核并批准验证方案和验证报告质量部QA审核并批准验证方案和验证报告监督验证方案的实施4. 验证简介4.1 定义l CFU：菌落数l 供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。l 试验组当采取薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入对应培养基中。l 菌液组测定所加的试验菌数。l 稀释剂对照组用相应的稀释液替代供试品，按试验组规定的方法进行菌落计数。样品组样品溶液菌

3、悬液（50-100CFU）稀释液平均菌落数(CFU/皿)供试液对照组+-+C供试液对照组试验组+C试验组菌液组-+-C菌液组稀释剂对照组-+C稀释剂对照组4.2 菌悬液4.2.1菌种及来源培养基名称名称及代号编号批号有效期至来源营养琼脂培养基金黄色葡萄球菌Staphlococcus aureusATCC6538ATCC大肠埃希氏杆菌Escherichia coliATCC8739枯草芽胞杆菌Bacillus subtilisATCC6633玫瑰红钠琼脂培养基白色念珠菌Candida albicansATCC10231黑曲霉Aspergillus nigerATCC16404备注检查人： 复核人

4、： 检查日期： 4.2.2菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，3035培养1824h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，2025培养2448h。上述培养物用0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50100CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，2328培养57天，加入35ml含0.05（ml/ml）聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子

5、数50100CFU的孢子溶液。4.3 培养基及稀释液4.3.1培养基和稀释液的名称培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基稀释液：pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液、灭菌纯化水4.3.2培养基灵敏度复核 培养基灵敏度复核，参见培养基的灵敏度检查操作规程QC2524.3.3稀释液的无菌性检查对稀释液进行无菌检查，14天规定温度培养后应无菌。此操作可与其它试验同时进行。4.4 供试液的预处理4.4.1样品名称及数量样品编号样品名称取样量/批批号 Sn-ASn-BSn-CS01*中间制品1000MLS02*成品200gS03原辅料1200gS04原辅料2200gS05原辅料.200gS06消毒剂20

6、mlS07饮用水100mlS08纯水制备过程水100mlS09.备注检查人： 复核人： 检查日期： 4.4.2样品预处理方法l *中间制品无需处理，取原样品50ml作为供试液。l *成品无需处理，取原样品50ml作为供试液。l 原辅料1 取10g样品，加入灭菌后的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用；l 原辅料2取10g样品，加入灭菌后的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用；l 原辅料.取10g样品，加入灭菌后的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用；l 消毒剂（*）按照比例进行配制。取1ml样品，加入灭菌后的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混

7、匀待用。l 饮用水取1ml样品，加入灭菌后的纯化水至100ml,混匀待用。l 纯水制备过程水取1ml样品，加入灭菌后的纯化水至100ml,混匀待用。4.5 实验用品名 称型 号设备编号厂 家半封闭薄膜过滤器millipore plusmillipore生化培养箱SHP-250上海试验仪器厂有限公司生化培养箱SPX-250B-Z上海博迅实业有限公司医疗设备厂洁净工作台SW-20-2FD雷柏特生物安全柜NU-440-400E美国NUAIRE公司滤膜*0.45mmillipore*滤膜材质为混合纤维素酯。4.6 参考文件4.6.1 中国药典2010版第三部附录XIIG- 微生物限度检查法4.6.2验

8、证管理规程4.6.3超标数据调查及处理管理规程4.6.4异常情况管理规程4.6.5培养基管理规程4.6.6薄膜过滤法无菌检查操作规程4.6.7培养基的灵敏度检查操作规程4.6.8菌种复苏、传代及菌悬液制备操作规程4.6.9微生物限度检查操作规程4.6.10消毒剂微生物污染水平检测操作规程5 验证过程5.1试验次数：验证试验应进行3次独立平行实验5.2试验器具准备试验前，将先前已准备的适量稀释液和培养基灵敏度复核检查合格的培养基、检品、无菌滤膜和无菌滤杯一同放入无菌室的传递厨内。用消毒剂对无菌室进行消毒，并擦拭超净台，打开超净工作台风机及紫外灯灭菌1小时以上。5.3 测定5.3.1 按照无菌室更

9、衣程序更衣，进入无菌室。5.3.2 用70%酒精棉球擦拭工作台面与待测品表面。5.3.3 在无菌环境下，取4.2.2项下配制的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50100CFU，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30-35培养2天，计数；取4.2.2项下配制的白色念珠菌、黑曲霉各50100CFU，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23-28培养3天，计数；以上作为菌液组。5.3.4 在无菌环境下，将过滤设备安装完毕。5.3.5 取适量稀释液倒入滤杯中，待滤膜润湿后进行以下操作。5

10、.3.6 将规定量的样品加入过滤器内（滤膜d47mm；0.45m），减压过滤。滤后，加100mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，重复n次（初步设定为3次，如需增加冲洗量可以适当增加冲洗次数，每次100ml，但总冲洗量不得超过1000ml），在最后一次的稀释液当中加入4.2.2项下配制的菌液，作为试验组，平行操作一次。5.3.7 不加入菌液重复5.3.4-5.3.6，作为供试品对照组。5.3.8 只加入稀释液和4.2.2项下配制的菌液作为稀释剂对照组。5.3.9 无菌操作取出滤膜，按下表加入对应培养基上，营养琼脂培养基 30-35培养2天后观察，玫瑰红钠培养基23-28培养3天后观察。营养

11、琼脂培养基（细菌）玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌）金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌白色念珠菌、黑曲霉5.3.10 以上表中所选的菌按照5.3.2-5.3.9重复操作。6 结果判断 在三次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率K1（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌落数回收率K2(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%。稀释剂对照组的菌数回收率K1= 100%试验组的菌落数回收率K2= 100%7 结论和建议此项中将根据实际测试的结果给出运行确认的结论，有异议的将给出建议。8 异常情况报告

12、对验证中发现的任何异常/不合格情况应按照异常情况管理规程执行。9 再验证如该验证的试验方法或试验相关试剂发生改变，需再验证。10附件10.1附件1 培养基灵敏度检查记录10.2附件2 薄膜过滤法无菌检查记录10.3附件3 微生物方法学验证记录10.4附件4 培养基厂家报告附件1：培养基的灵敏度复核培养基类型： 菌落计数用培养基 名称批号1菌悬液制备菌种名称菌种编号菌种批号培养温度生长状况培养时间培养箱编号金黄色葡萄球菌ATCC6538良好 不良大肠埃希氏杆菌ATCC8739良好 不良枯草芽胞杆菌ATCC6633良好 不良白色念珠菌ATCC10231良好 不良黑曲霉ATCC16404良好 不良将

13、新鲜培养物上的菌株用0.9%氯化钠溶液制成1ml含菌数小于50-100cfu的菌悬液；黑曲霉向培养基中加入3-5ml 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于50-100cfu的孢子悬液。2观察记录培养温度培养箱编号培养时间对照培养基厂家配制批号加入菌株培养基简称：待测培养基；：对照培养基加入菌悬液名称培养基名称3个平皿菌落数（CFU/皿）菌落平均数（CFU/皿）菌落数/菌落数(%)金黄色葡萄球菌大肠埃希氏杆菌枯草芽胞杆菌白色念珠菌黑曲霉3评

14、定标准：待测培养基上的微生物数量不得低于对照培养基上微生物数量的70%。结 论符合规定 不符合规定复核人： 操作人：附件2：稀释液的无菌性检查名称pH7.0的氯化钠蛋白胨溶液规 格pH7.0批号检验依据CHP2010实验条件培养基名称改良马丁培养基（培养基）硫乙醇酸盐流体培养基（培养基）配制批号培养温度20253035取样量实验观察结果观察天数培养基样品管培养基样品管培养基阴性对照管培养基阴性对照管阴性阳性阴性阳性阴性阳性阴性阳性第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天第8天第9天第10天第11天第12天第13天第14天评定标准硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基均为澄清，或虽显浑浊但经证明并非有菌生长，判供试品符合规定结 论符合规定 不符合规定 复 核 人： 检 验 人：附件3：方法验证 样品名称： 培养基：试验菌名称： 菌种批号：3批样品按顺序进行3次试验样品编号试验组菌液组供试品对照组稀释剂对照组平皿上菌落数CFU时间平均数CFU回收率K1=回收率K2=样品编号试验组菌液组供试品对照组稀释剂对照组平皿上菌落数CFU时间平均数CFU回收率K1=回收率K2=样品编号试验组菌液组供试品对照组稀释剂对照组平皿上菌落数CFU时间平均数CFU回收率K1=回收率K2=判定标准在3次独立的平行试验中，k1、k2均不低于70%。结论复核人 ： 操作人：P-* Page 13 of 13