蚕桑生物技术

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1、蚕桑生物技术及新产品开发教学大纲总学时： 36学时 学分：2 学分 理论学时：27学时 实验学时：9学时课程代码：BBO16002 面向专业：蚕学大纲执笔人：王洪利 大纲审定人：王彦文 一、说明1、课程的教学目的、性质、地位和任务本课程是蚕学专业学生的一门专业选修课，重点讲授蚕桑生物技术的研究进展以及具有重大理论意义或广阔应用前景的新产品开发情况。二、课程教学的基本要求本课程的主要内容有：分子生物学基础知识与基因工程简介、家蚕分子生物学研究概况、桑树分子生物学研究概况、蚕的基因工程、转基因蚕与桑等以及蚕与桑的新产品、新用途开发等。二、教学大纲内容： (一)、课程理论教学：绪论（2学时）分子生物

2、学的含义、发展简史及其分子生物学在生命科学中的地位。生物技术(biotechnology)，是利用生物体（包括微生物、动物或动物细胞、植物或植物细胞）或其它组成部分（细胞器或酶），应用先进的生物学和工程技术，在最适条件下生产有价值的产物，或进行有益的过程的技术。生物技术是在分子生物学、生物化学、细胞生物学和微生物学研究的基础上发展起来的，它研究的内容包括基因工程（遗传工程）、酶工程、微生物工程、细胞工程和生化工程等方面的内容。遗传工程技术发展极为迅速，它研究的范畴基本上已经形成。其主要内容应有如下几个方面：可用于克隆的DNA片段的切割与分离；DNA片段与载体DNA分子间的连接；将载体与DNA片

3、段相结合的杂交分子导入宿主细胞；对带有所希望的杂交分子的细菌株系的鉴定与选择；重组分子的表达与扩增等。本章重点难点：1、分子生物学的含义、发展简史及其分子生物学在生命科学中的地位。2、生物技术的概念、内容。思考题：1、生物技术的概念、内容有哪些？ 建议教学方法：课堂讲授。第一章 植物基因工程（2学时）已鉴定和克隆的植物基因分别与农业中的抗除草剂、抗昆虫、抗病、抗不良环境因素、提高产量的光合作用、雄性不育以及蛋白质含量等基因有关。本章重点难点：1、植物基因工程研究概述。思考题：1、简述植物基因工程研究进展。建议教学方法：课堂讲授。第二章 动物基因工程（2学时）动物基因工程研究最突出的技术进步便是

4、转基因动物及其发展。1983年美国将大白鼠的生长激素基因注射到小鼠的受精卵内，并经移植和胚胎发育成功地培育出“超级鼠”。之后，人们起而效颦，相继培养出转基因猪、羊、鸡、兔、牛、鱼等。转基因动物也是研制活性多肽（医用活性多肽）的一条新颖而廉价的技术路线。本章重点难点：1、熟悉动物基因工程研究的技术及其发展简史。2、了解转基因动物的技术路线。思考题：1、转基因动物的技术路线是什么。建议教学方法：课堂讲授。第三章 基因诊断与基因治疗（2学时）所谓基因诊断，原指遗传性疾病的诊断。现在主要指使用DNA探针技术检测所要查明的DNA或基因。DNA探针就是单股DNA小片段给予标记，然后同被检测的DNA中的同源

5、互补序列杂交。用DNA探针方法来诊断疾病可达到特异性强、灵敏度高、简便、快速等目的，现已被用于对其它疾病（如腹泻病原菌和病毒、人性病病原体、乙型肝炎和丙型肝炎病毒等）的诊断。基因治疗一般是指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内，以弥补所缺损的基因、关闭或降低异常表达的基因，以达到治疗遗传性疾病的目的。也用于治疗恶性肿瘤和心血管疾病及传染病等。本章重点难点：1、了解基因诊断、基因治疗的基本知识。思考题：1、何为基因诊断、基因治疗？ 建议教学方法：课堂讲授。第四章 桑蚕杆状病毒表达载体系统（4学时）昆虫杆状病毒科(Baculoviridae)因包埋于多角体中的病毒粒子呈棒状而得名。基因组由超螺旋的双

6、链DNA组成，用作外源基因表达载体的杆状病毒,目前仅限于核型多角体病毒属的核型多角体病毒。杆状病毒基因组是单分子共价闭合环状的dsDNA,核型多角体病毒平均约130 kb。1核型多角体病毒作为外源基因的表达载体的设想最初是由Miller（1981）提出。Smith和Summers(1983)首次用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus , AcMNPV)在Sf9细胞中成功地表达人-干扰素，1985年用家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis

7、 virus , BmNPV)在细胞、蚕体高水平地表达了-干扰素从而确证杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vector system ,BEVS)表达外源基因的可行性与高效性。近年来随着杆状病毒分子生物学研究的不断深入，以及各种新表达载体的开发，BEVS已是一个较为成熟的真核表达系统，已被公认为当代四大真核表达系统之一，特别其超高效表达能力、安全性、易操作性更为引人注意。至今已有数百种外源基因在BEVS系统得到表达。2. 重组杆状病毒的构建由于杆状病毒基因组较大，外源基因不能直接插入到病毒的基因组内，必须通过转移载体的介导，如图所示，重组杆状病毒的构建大致可以分为

8、三步：(1).将目的外源基因插入到转移载体中，用普通的分子生物学技术进行扩增，转移载体一般含有amp抗性基因、复制起始点ori和用于插入外源基因的多克隆位点，多克隆位点的两侧为靶基因的5和3区域(各为13kb)；(2).通过同源重组将目的基因转移到病毒基因组的靶位点；(3).筛选重组病毒在昆虫或细胞中进行增殖。3. 外源基因插入到杆状病毒转移载体几乎任何类型的外源基因都可以插入到杆状病毒基因，但以下方面在高效表达时必须注意：(1).插入的外源基因无内含子，BEVS虽有表达非剪接基因的能力，但剪接效率较低，特别是在感染的后期，因此为了能高水平表达一般采用cDNA形式的外源基因；(2).外源基因的

9、5非编码区不要超过50 bp，特别是GC丰富的非编码区，一般认为5非编码区要求AT丰富，且短于2030 bp；(3).BEVS虽可表达对细胞有毒的外源基因，但往往会引起表达水平下降。4. BEVS系统中用来驱动外源基因的启动子5. 产生多角体缺失病毒的表达载体5.1 传统的转移载体5.2 多角体蛋白融合转移载体5.3 便于纯化表达产物的转移载体5.4 多启动子表达载体6. 重组病毒的筛选鉴定方法的改进最初用来筛选鉴定重组病毒的方法是通过空斑法进行的。用野生病毒DNA和重组转移载体DNA共转染后,野生病毒的多角体蛋白基因被外源基因取代，所以重组病毒形成的空斑无多角体，而野生病毒的空斑带有多角体。

10、根据空斑表现型的差异而加以区分筛选，但由于重组病毒的比例仅为0.11%,且此种表型差别对初学者在应用上有一定困难，因此,近年来开发了一些病毒筛选、鉴定的新技术。本章重点难点： 重组杆状病毒的结构、重组杆状病毒的构建、外源基因插入到杆状病毒转移载体、BEVS系统中用来驱动外源基因的启动子、产生多角体缺失病毒的表达载体、传统的转移载体、多角体蛋白融合转移载体、便于纯化表达产物的转移载体、多启动子表达载体、重组病毒的筛选鉴定方法的改进。思考题：1、何为重组杆状病毒？2 、怎样构建重组杆状病毒？3、在蚕桑上如何应用重组杆状病毒。建议教学方法：课堂讲授。第五章 生物信息技术在分子生物学领域中的应用（4学

11、时）近几年来，由于基因序列、蛋白质序列和生物学文献为主要内容的生物信息的爆炸性增长，极大促进了生物信息学科的发展，虽然生物信息学的建立和发展只有短短几年的时间，但它的发展极其迅速，从早期的单纯从事数据收集、整理、加工、数据查询为主的服务性，工具性学科，现已成为这些原始数据的极联放大器和生物规律的 “产品加工厂”。目前，生物信息学的研究内容已超出传统的生物和医学学科，逐渐渗入到农学、环境学、人口学、人类学多个研究领域，甚至已成为当今计算机应用的主要发展方向之一。本章重点难点：1、了解生物信息学的建立和发展史。2、基因芯片的发展历史和应用范围。思考题：1、何为基因芯片？ 2、生物信息学的研究内容有

12、哪些？3、简述基因芯片的发展历史和应用范围。建议教学方法：课堂讲授。第六章 植物基因工程技术及其在桑树上的应用前景（6学时）植物基因工程技术是近十年发展起来的一项重要的生物技术。自从1984年人类首次获得转基因烟草植株以来，植物基因工程研究发展迅速，取得了令人鼓舞的成就。越来越多的基因片段已被分离或合成得到，基因工程操作技术也越来越完善，为基因工程技术在更多植物上的应用建立了良好的实验技术。桑树基因工程的研究虽然起步较晚，但已探明外源基因能够进入桑树体内，并在其中表达。本文就植物基因工程技术的发展以及在桑树上的应用前景作一些介绍和探讨。（一）、植物基因工程技术研究概况（二）、桑树基因工程研究进

13、展1. GUS基因对桑树叶盘的转化1990年盯井博明报导了用携带有GUS基因的根癌农杆茵LBA4404感染桑树叶盘后，经含抗生京的Ms培养基筛选获得了转化苗，证明了GUS基因已进入桑树体内。这一试验首次证实了桑树叶盘能够接受外源基因。2天蚕抗菌肽B基因对桑树叶盘的转化1993年吴成仓等报道了用天蚕抗菌败B基因进行的对桑树叶盘的转化研究。天蚕抗菌肽B是一种广谱性的体内杀菌多肽。试验以培育抗细菌病桑树为目标，但获得的转化频率不高，经含卡那霉素的培养基筛选，仅有1的叶盘形成了愈伤组织，经分化培养也未能成苗。2 人工合成抗菌肽D基因对桑树叶盘的转化1994年管志文等报道了用人工合成的抗菌肽D基因导入桑

14、树的研究结果。他们用据带有抗菌肽D基因的根癌农杆菌感染桑树叶盘，经过卡那霉素筛选培养，获得了转化苗。经检测发现转化苗中有朋脂碱合成酶，证实了外源基因已进入桑树体内。对转基因桑苗的抗病性检测正在进行中。（三）、植物抗虫基因工程及转基因桑树的培育植物抗虫基因主要有苏云金杆菌毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因等。苏云金杆菌毒蛋白基因和蛋白酶抑制剂基因是广泛应用于植物抗虫基因工程中的两大类基因。苏云金杆菌毒蛋白基因已获得以转基因抗虫棉花为主的一大批转基因植物；蛋白酶抑制剂基因，其蛋白酶抑制剂是植物天然的抗虫物质。多种蛋白酶抑制剂基因或cDNA被克隆并得到具有良好抗虫效果的转

15、基因植物。其中将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转入烟草、棉花分别获得具有较强抗虫性的植株；将马铃薯蛋白酶抑制剂基因转入烟草具有明显抗虫效果；将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转入烟草、水稻、茄子、马铃薯等都获得了较理想的抗虫效果。在多基因融合共转化植物方面也取得了可喜的成果。本章重点难点：1、植物基因工程技术研究进展。2、桑树基因工程研究进展。3、植物抗虫基因工程及转基因桑树的培育。思考题：1、目前常用的植物转基因方法有哪些？2、目前在植物保护应用的植物转基因工程有哪些？3、植物抗虫基因工程常用的基因有哪些？4、试述桑树转基因研究的进展？5、转基因作物的安全性保障主要指哪些内容？6、抗逆基因工程主要指哪些

16、内容？7、试述RAPD技术，以及其在蚕桑学研究中的应用前景。建议教学方法：课堂讲授。第七章 丝蛋白分子结构与丝蛋白基因表达调控机制的研究（2学时）丝蛋白分子结构与丝蛋白基因表达调控机制的研究，将为增产蚕丝、改进丝质提供分子生物学理论基础。近十几年来我国在此也作了很多的研究，现在，蚕丝蛋白质-丝素的特性已越来越为人们发现和认识，蚕丝作为新的生物材料已为人们所共识。对丝素溶液的研究利用、丝素食品、丝素肽、丝素膜及用丝素溶液合成的吸水性高分子材料和酶与抗体的固定材料（载体）等的研究都有很大的突破。我国科技工作者采SDS-PAGE法，对成熟幼虫丝腺分区进行了丝胶蛋白多肽组成进行了测定，研究了六种蚕类丝

17、胶蛋白的多肽组分；并测定了蚕丝心蛋白的亚基及其分子量、氨基酸的组成和蚕丝胶蛋白的多肽组分及其分子量。测定和分析了丝素膜的结构，对脱胶丝素纤维、初生丝素蛋白膜、GOD-丝素膜结构的红外光谱分析丝素纤维为典型的丝（双向平行的片层）结构，初生丝素膜的红外光谱显示无规卷曲或丝构型的特征，其特征向型转变；对丝心蛋白亚基的组成研究，证实了家蚕、野桑蚕H-L型，天蚕、柞蚕、樗蚕、蓖麻蚕H-H型。家蚕蛾科的蚕类与天蚕蛾科的蚕类在丝心蛋白氨基酸组成上，具有种的特异性，各种蚕类丝心蛋白氨基酸组成差异同它们的分类地位相一致。从家蚕和野桑蚕绢丝腺液状丝心蛋白中分离出的小亚基的氨基酸组成和大亚基有很大的不同。本章重点难

18、点：1、丝蛋白分子结构与丝蛋白基因表达调控机制研究的分子生物学理论。2、以蚕丝蛋白质-丝素为新的生物材料的研究方向。思考题：1、丝蛋白分子结构与丝蛋白基因表达调控机制研究进展。建议教学方法：课堂讲授。第八章 家蚕性别控制研究（3学时）我国近几年开始了家蚕性别控制的研究，专养雄蚕的巨大经济效益（体质强、产丝量高、丝质优、饲料报酬与劳动报酬高）。限性黑卵与性连锁平衡致死基因系统的育成，使专养雄蚕成为现实。我国引进前苏联性别控制蚕品种后，更加强了对培育雄蚕品种及专养雄蚕的研究。浙江省蚕业研究所，比较了雌雄蚕的形状差异，指出了控制蚕性别比的重要意义和专养雄蚕的优越性。通过杂交（回交）和标记形状选择等技

19、术，已把引进种的性别控制基因，包括平衡致死基因和限制卵色基因转育到我国的实用蚕品种中，育成了性连锁平衡致死新品种和限性卵色新品种。筛选出了几对优良的雄蚕杂交组合，在农村专养雄蚕获得了成功：雄蚕率达到类99%，鲜茧出丝率显著提高。本章重点难点：1、家蚕性别控制研究的进展。思考题：1、简述家蚕性别控制研究的进展。2、简述我国农村专养雄蚕的发展前景。建议教学方法：课堂讲授。（二）课程考核要求：本课程考核以平时考核和课程结束后考试为最终考核成绩。平时考核成绩占30，课程结束后考试成绩占70。三、课程实验教学大纲实验一 质粒DNA的制备（3学时）内容：分离纯化质粒DNA主要是利用宿主染色质DNA与质粒之

20、间的差异来进行的：(1) 染色质DNA分子量比质粒DNA大得多；(2) 从细胞中提取到的染色质DNA大多断裂成线状分子，而质粒DNA则为共价闭合环状结构。分离质粒DNA包括三个基本步骤：(1)培养细菌使质粒大量扩增；(2)收集和裂解细菌并去掉蛋白和染色质DNA；(3)分离和纯化质粒DNA。目的：学会制备质粒DNA的方法。实验二 基因组DNA的提取（3学时）内容：不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同；同种生物的不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时，必须参照文献和经验建立的相应提取方法，以获得可用的DNA

21、大分子。尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此对富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以水稻幼苗(禾本科)、李或苹果叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。目的：基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。因此，要学会不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法。 实验三 PCR技术（3学时）内容：PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括3个基本步

22、骤：(1)变性(denature)：目的双链DNA片段在94左右下解链；(2)退火(aneal)：两种寡核苦酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下(72)，以目的DNA为模板进行合成。由这3个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经2535轮循环就可使DNA扩增达1071010倍以上。 目的：通过实验熟练掌握PCR技术。四、教材与参考书：分子生物学昆虫病毒分子生物学植物基因工程原理与技术五、课程教学改革方案（一） 提高直观教学的力度，增加多媒体教学中蚕桑新产品开发的录像数量。（二） 加强实践教学环节，提高学生的实践操作水平。8