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1、实验实验2 2 分离分离以尿素为氮以尿素为氮 源的源的微生物微生物尿素又称脲尿素又称脲, ,是蛋白质的降解产物是蛋白质的降解产物, ,哺乳动哺乳动物的尿液中含有物的尿液中含有, ,植物不能直接吸收尿素植物不能直接吸收尿素, ,因此因此, ,大量尿素的存在对环境造成污染大量尿素的存在对环境造成污染. .有有些细菌可产生些细菌可产生脲酶脲酶, ,以尿素为氮源以尿素为氮源, ,脲酶可脲酶可将尿素分解为氨将尿素分解为氨, ,被植物吸收被植物吸收. .一、实验原理一、实验原理用选择培养基可分离出以尿素为氮源的微生物，这些微生物可产生脲酶，脲酶可将尿素分解为能被植物吸收的氨，因此这类微生物具有一定的生态学
2、价值。稀释涂布平板法统计土壤样品中含有的这种微生物的数目 细菌 尿素 NH3 中性 碱性 酚红颜色： 黄色 紫红色稀释涂布平板法的原理 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以形成标准液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以形成标准菌落菌落 http:/ : 使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌( (有有脲酶脲酶) ) 通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基pHpH的变化的变化( (脲酶催化的化学反应脲酶催化的化学反应
3、) ) 统计被检测的土壤中含有的以尿素为氮源的微生统计被检测的土壤中含有的以尿素为氮源的微生物的数量物的数量三、实验中涉及到的一些问题：三、实验中涉及到的一些问题：（一）哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多？（一）哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多？（选材的问题）（选材的问题）（二）此实验用到的选择培养基必需含有哪些物质？（二）此实验用到的选择培养基必需含有哪些物质？（三）可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物（三）可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物对尿素分解能力的高低？对尿素分解能力的高低？（四）统计微生物的数量可用哪些方法？（四）统计微生物的数量可用哪些方法？没硬化，腐殖
4、质丰富的土壤没硬化，腐殖质丰富的土壤碳源、尿素、无机盐、水、酚红碳源、尿素、无机盐、水、酚红培养基红色的深浅培养基红色的深浅稀释涂布平板法，显微镜直接记数法稀释涂布平板法，显微镜直接记数法四、操作步骤：四、操作步骤：、倒平板：、倒平板：、制备一定浓度梯度的细菌悬液：、制备一定浓度梯度的细菌悬液：g土壤ml无菌水，振荡，为稀释液，依次制备、的土壤稀释液。、稀释涂布分离法分离细菌、稀释涂布分离法分离细菌、制备无菌的固体培养基和尿素固体培养基、制备无菌的固体培养基和尿素固体培养基、培养观察（倒置，度）、培养观察（倒置，度）倒个培养基，个尿素固体培养基（无菌，0.1ml，玻璃刮刀）配制培养基 尿素培养
5、基（1L） 葡萄糖 10g NaCl 4.8g K2HPO4 4.8g 琼脂 20g 酚红 0.01g 尿素 80g LB培养基（1L） 蛋白胨： 10g 酵母粉： 5g NaCl： 10g 琼脂： 20g 对照组对照组选择培养基选择培养基实验组实验组LB培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种,使菌种成倍扩增,达到使用要求.倒平板需要倒3个LB平板，9个尿素平板LB(对照)尿素10-210-310-4每个稀释度每个稀释度 1个个LB对照平板对照平板 3个尿素平板个尿素平板(平行重复组平行重复组)接种 取100ul菌悬液涂布分离涂布分离涂布前后三角刮刀需要灼烧吗？涂布
6、前后三角刮刀需要灼烧吗？ 涂布平板的所有操作都应在火焰附近涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第操作要求，想一想，第2 2步应如何进行无步应如何进行无菌操作？菌操作？ 应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。在酒精灯火焰周围等等。37倒置培养按浓度捆成一摞按浓度捆成一摞恒温恒温37培养培养防止冷凝水污染培养皿，防止其它细菌污染。 五、操作步
7、骤：（学生做）五、操作步骤：（学生做）、倒平板：、倒平板：倒个培养基，个尿素固体培养基、制备一定浓度梯度的细菌悬液：、制备一定浓度梯度的细菌悬液：g土壤ml无菌水，振荡，为稀释液，依次制备、（.ml无菌水）的土壤稀释液。、稀释涂布分离法分离细菌、稀释涂布分离法分离细菌、制备无菌的固体培养基和尿素固体培养基制备无菌的固体培养基和尿素固体培养基、培养观察（倒置，度）、培养观察（倒置，度）10-4 、 10-3,、 10-21、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基 因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌
8、提供一定量的非尿素类如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源氮源，这样会在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故用纯化的的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故用纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂琼脂糖而不用琼脂做固化剂思考题：2、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用 土壤中的尿素在较高温度下会被水解成氨，氨使土壤碱化，土壤中的尿素在较高温度下会被水解成氨，氨使土壤碱化，氨还与氨还与SO42-等离子形成化合物，使土壤板结。而脲酶的等离子形成化合物，使土壤板结。而脲酶的细菌不仅使动植物尸体降解，而且利
9、用了所形成的氨，有细菌不仅使动植物尸体降解，而且利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。利于自然界中氮的循环。3、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现。 细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，水解后产生细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，水解后产生氨，氨为碱性，酚酞在酸性环境里呈黄色，碱性里呈红色。氨，氨为碱性，酚酞在酸性环境里呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在培养基中酸碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。4、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落 表明能利用尿素的细菌在土壤菌落中只占有极少数。表明能利用尿素的细菌在土壤菌落中只占有极少数。
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