转基因植物制药

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1、第三节第三节 植物转基因技术植物转基因技术1、植物转基因技术的发展、植物转基因技术的发展2、植物表达载体的构建、植物表达载体的构建3、植物转基因的过程、植物转基因的过程4、转基因植株的鉴定、转基因植株的鉴定农杆菌介导法农杆菌介导法基基因因枪枪法法植物植物转基因转基因技术技术花粉管通道法花粉管通道法其其它它方方法法优点：优点：低成本易操作、转基因的低拷贝数低、导入片段低成本易操作、转基因的低拷贝数低、导入片段的确定性好。的确定性好。缺点：缺点：受作物基因型的影响较大受作物基因型的影响较大优点优点：低成本易操作、不受基因型：低成本易操作、不受基因型影响、不需要经过组织培养可以获得转基因影响、不需要

2、经过组织培养可以获得转基因种子。种子。缺点缺点：导入片段的确定性差、转化效率很低。：导入片段的确定性差、转化效率很低。优点优点：不受作物基因型：不受作物基因型的限制。的限制。缺点缺点：成本高、转基因：成本高、转基因的拷贝数高、导入片断的确定性差的拷贝数高、导入片断的确定性差聚乙二醇法、显微注射法、激光聚乙二醇法、显微注射法、激光介导法、脂质体介导法介导法、脂质体介导法农杆菌介导法植物转基因的原理农杆菌介导法植物转基因的原理AgrobacteriumAgrobacterium-mediated plant transformation-mediated plant transformation基

3、因枪法植物转基因的原理基因枪法植物转基因的原理Plant transformation via microprojectalPlant transformation via microprojectal bombardment bombardment第四节第四节 植物转基因技术植物转基因技术1、植物转基因技术的发展、植物转基因技术的发展2、植物表达载体的构建、植物表达载体的构建3、植物转基因的过程、植物转基因的过程4、转基因植株的鉴定、转基因植株的鉴定pCAMBIA1301pCAMBIA1301质粒质粒T-Border(right)Nos 3Gus35S5NcoI35S5Hyg(R)T-Bor

4、der(left)35S3HinDIIISalIBamHIEcoRIBstEIIpCAMBIA130111837bpLac ZpCAMBIA1301pBS-RSP1/235SHyg(R)T3 PGusRSP2LacZNcoIpCAM-GusBam HIHind IIIKpnIBam HIKpnIHyg(R)T7 PGusRSP1KpnIBamHIGusNos3Hyg(R)35S35S35SRSP2RSP1KpnI用用KpnI和和BamHI双酶切后连接双酶切后连接BamHINos3Nos3LBRB(1715 bp)First intron(1182 bp)LBLBRBRB水稻蔗糖合酶基因启动子驱

5、动水稻蔗糖合酶基因启动子驱动GusGus基因的表达载体构建基因的表达载体构建第四节第四节 植物转基因技术植物转基因技术1、植物转基因技术的发展、植物转基因技术的发展2、植物表达载体的构建、植物表达载体的构建3、植物转基因的过程、植物转基因的过程4、转基因植株的鉴定、转基因植株的鉴定2N6诱导愈伤诱导愈伤 7-10dN6 -BA 预培养预培养 2-3d种子种子AB-AS 诱导诱导12hAB培养基活化培养基活化12hYEP平板单菌落平板单菌落液体液体MS浸泡浸泡15min无生长素无生长素N6-AS共培养共培养 3dN6-H选择培养选择培养20d抗性愈伤组织的获得及植株再生抗性愈伤组织的获得及植株再

6、生 30d62d70d1 2N6愈伤诱导愈伤诱导2 N6-BA预培养预培养3 N6-H选择培养选择培养优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程4 植株再生植株再生第四节第四节 植物转基因技术植物转基因技术1、植物转基因技术的发展、植物转基因技术的发展2、植物表达载体的构建、植物表达载体的构建3、植物转基因的过程、植物转基因的过程4、转基因植株的鉴定、转基因植株的鉴定2.0kb1.0kb0.5kb 转基因植株中转基因植株中Gus基因的基因的PCR检测检测PCR analysis of Gus in putative transgenic plantletsM, DNA

7、 marker; P, 以PCAM-Gus1质粒为阳性对照; CK1,以水为模板的阴性对照; CK2,以未转基因植株为阴性对照; 1-6，转基因植株。M, DNA marker; P, PCAM-Gus1 plasmid as positive control; CK1,the templete is water as negtive control; CK2, non-transformed plantlet as negative control; 1-6, putative transgenic plantlets. M P CK1 1 2 3 4 5 6 CK2(563 bp)转基因水

8、稻根、茎和叶的转基因水稻根、茎和叶的GUS组织化学分析组织化学分析ABCabcabcabcA, 根系；根系； B, 茎杆；茎杆；C, 叶片。叶片。a, Gus 基因由基因由35S启动子驱动；启动子驱动； b, Gus 基因由蔗糖合酶基基因由蔗糖合酶基因因RSuS1的启动子序列驱动；的启动子序列驱动； c, 未转基因水稻植株。未转基因水稻植株。A, roots; B, stems; C, leaves. a and b represent the Gus gene is drived by 35S and RSuS1 promoter respectively; c, no-transforme

9、d plants as negative control. 农杆菌介导的基因转移 以原生质体或细胞（组织）作为受体的直接基因转移，如：聚乙二醇法（PEG） 电击（EP ，electroporation）脂质体（Lip， Lome） 磷酸钙DNA共沉淀（CaP）微注射（Mi ，Microinjection）基因枪法（particle bombardment，简称PB）超声波法（Ulstrasonication） 种质系统（germ line transtormation）的基因转移，如利用子房注射 、种胚以及花粉管通道等导入外源基因植物转基因的主要方法植物转基因的主要方法 在当今众多的植物基因转

10、化技术中，最为可靠在当今众多的植物基因转化技术中，最为可靠和有效的方法之一是和有效的方法之一是农杆菌农杆菌TiTi质粒质粒介导的外源基因介导的外源基因转化系统。这是一个本来就存在于自然界的转化系统。这是一个本来就存在于自然界的“天然天然”的基因工程系统。随着人们对其机理的揭示，使人的基因工程系统。随着人们对其机理的揭示，使人们得以利用其进行植物的定向转化们得以利用其进行植物的定向转化把有益基因转把有益基因转入植物，成为可能。入植物，成为可能。概概 述述1.1植物冠瘿瘤植物的一种癌症1.1冠瘿瘤 植物与人一样，可以产生各种各样的瘤和癌。其中一类瘤被叫作瘿，瘿的种类很多。引起瘿的因素有：受伤、昆虫

11、、病毒、细菌和特定的基因组织表达等。人们最感兴趣的瘿是冠瘿瘤。 1.1.1冠瘿瘤的起因 由根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）属根瘤菌科（Rhizobiaceat）对植物的侵染而引起。 1.1.2冠瘿瘤的侵染过程 细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。冠瘿瘤上： 电镜下的根癌农杆菌下： 冠瘿瘤1.1.3 冠瘿瘤的一般生物学特性 45杀死侵染植物的根癌农杆菌，植物组织仍然能形成癌。把瘤组织培养在不加生长素和细胞分裂素的培养基上，能够无限止的分裂和生长。（1）根癌农杆菌转化植物细胞的能力是

12、因为它含有一个叫作Ti（tumor-inducing）的质粒（Ti plasmid）。（2）根癌农杆菌侵染植物后产生两种物质：类植物激素和冠瘿碱。类植物激素使细胞大量扩增，出现冠瘿瘤；冠瘿碱是受侵染植物组织合成的稀有氨基酸，包括胭脂碱、章鱼碱等。冠瘿碱是根癌农杆菌生活的C、N和能量来源。1.2 Ti质粒1.2.1 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合环状DNA分子，其分子量为95156 106D，约有200kb。最近有人发现农杆菌中还有其它的质粒，称之为隐秘质粒。稳秘质粒的功能还不清楚，有的认为可能是缺陷型的Ti质粒。迄今已从多种植物中分离出不同种类的根癌农杆菌。1.2 Ti

13、质粒1.2.2 Ti质粒的物理图谱物理图谱：限制性内切酶酶切片段在Ti-DNA上的排列顺序。Ti物理图谱构建：经限制性内切酶处理之后的Ti质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳作片段分离，便可显示出有20多条大小不同的DNA酶切片段。然后将这些酶切片段进行分子杂交分析，测定顺序，再排列成完整的物理图。 图图 5-3 章章鱼鱼碱碱型型 Ti质质粒粒的的物物理理图图 外圈：Hind III 酶切图：EcoR I 酶切图 内圈：BamH I 酶切图1.2 Ti质粒1.2.3 Ti质粒的基因图谱基因图谱：基因在Ti-DNA上的排列顺序。基因图谱构建：转座子标签法 利用细菌的转座子（transposon），使Ti

14、质粒发生嵌入突变和缺失突变。细菌转座子带有各种抗菌素抗性的基因，在转化过程中它们可嵌入Ti质粒，使根癌农杆菌带有相应的抗菌素抗性，因而可方便地筛选出转座子嵌入Ti质粒突变体。由于在转座子嵌入处的编码基因发生失活，因而可通过分析Ti质粒限制性内切酶片段的变化，如某些片段消失或电泳迁移率改变，确定这些基因插入位置，并且与突变体的表型相对应，从而建立Ti质粒的基因图。 目前已建立了十多个Ti质粒的基因图，其中主要是章鱼碱型和胭脂碱型两大类的Ti质粒基因图。1.2 Ti质粒Ti质粒的基因图谱 不同的Ti质粒有二个同源区： Vir区（转化所必须） 是毒性区，也叫毒性基因或Vir基因或致病基因。 TDNA

15、（transforming DNA） TDNA是Ti质粒的转化植物的DNA，故称TDNA。在转化植物细胞二倍体基因组中含有一个或几个（至多）TDNA拷贝。noc是编码细菌利用胭脂碱的基因。Figure 5-5 Map of the Ti plasmid showing the location ofsome genes important for crown gall induction1.2 Ti质粒1.2.4 Ti质粒的基因位点及其功能区域（1）TDNA区（transferred-DNA regions）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，

16、故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。（2）Vir区（virulence region）： 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。1.2 Ti质粒（3）Con区（regions encoding conjugations）： 该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。（4）Ori区（origin of replication）： 该区段基因调控Ti质粒的

17、自我复制起始。Ti 质粒的基因位点及其功能区域从图 5-6 可见各种 Ti 质粒都分为四个区：（1） TDNA 区（transferred-DNA regions） ：T-DNA 是农杆菌侵染植物细胞时，从 Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为转移 DNA。该 DNA 片段上的基因与肿瘤的形成有关。（2） Vir 区（virulence region） ：该区段上的基因能激活 T-DNA 转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA 区与 Vir 区在质粒 DNA 上彼此相邻，合起来约占 Ti 质粒 DNA 的三分之一。（3） Con 区（regions encod

18、ing conjugations） ：该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因（tra） ，调控 Ti 质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活 tra 基因，诱导 Ti 质粒转移，因此称之为接合转移编码区。（4） Ori 区（origin of replication） ：该区段基因调控 Ti 质粒的自我复制起始。关于 Ti 质粒上的部分基因及其功能见表 5-2。表表 5-2 Ti 质质粒粒上上的的部部分分基基因因及及其其功功能能基因缩写表 型 及 功 能在基因图上的近似位置（kb）pTiC58(21kb) pTiAch5(195kb)ape排斥噬菌体 API1111131012agr对 PAT-

19、K84 质粒编码的农杆菌素敏感138141arc分解精氨酸45910agc分解农杆碱5457noc分解胭脂碱1820nos合成胭脂碱01occ分解章鱼碱3941ocs合成章鱼碱01ori复制起点33359095psc分解磷酸化的糖136138roi(tmr)抑制长根206207190192shi(tms)抑制长芽202203187188traTi 质粒转移1211232130inc质粒不相容性333590951.3 TDNA1.3.1 结构： 胭脂碱型的T-DNA是15kb长的DNA连续片段，占Ti 的7-15，两边有23bp的定向重复序列。 章鱼碱型的T-DNA区分为两部分，左区（TL-DN

20、A）为13kb的单拷贝序列，是诱发和维持肿瘤所必需的。右区（TR-DNA）为7kb的多拷贝序列。 T-DNA通常较完整的且序列不改变地被整合到植物基因组中。1.3 TDNA1.3.2 T-DNA携带的遗传信息（1）致瘤基因：用于转化植物细胞的基因，使植物不受控制地繁殖致癌基因（onc基因）。（2）冠瘿碱合成酶及其分解基因：使植物细胞合成某种冠瘿氨基酸的基因。如nos（编码胭脂碱合酶的基因）和ocs（编码章鱼碱合酶的基因）1.3 TDNA1.3.3 Ti质粒来自细菌（原核）系统，为何其基因能在真核生物中表达？ 证据1. 由T-DNA产生mRNA均是典型的植物mRNA分子。可通过植物RNA聚合酶I

21、I被转录，并具有5 帽子结构和3polyA尾巴。 证据2. nos、ocs等基因的5末端具有真核特有的TATA-box和CAAT-box。 结论： T-DNA的基因序列只能被真核生物识别，不能被原核生物识别。由此说明这些基因可以在真核细胞中表达，且只能在转化到真核细胞后表达。1.4 Vir 区的基因结构与功能1.4.1 Vir的位置： 位于Ti质粒上T-DNA的左侧，两者之间的距离常随Ti质粒类型不同而有差异，章鱼碱型的距离较大，而胭脂碱型的间隔距离很小。1.4.2 Vir的基因结构： 章鱼碱型 Ti 的Vir区：40kb，含 8个操纵子，24个基因VirA(1)、B（11）、C（2）、D（4

22、）、E（2）、F（1）、G（1）、H（2）（PinF）、它们协同调节、形成一个调控子，共同起作用。 胭脂碱型有7个操纵子。1.4 Vir 区的基因结构与功能1.4.3 Vir 的基因功能（1）细菌附着到植物受伤细胞上。（2）Vir基因产物加工T-DNA形成单股DNA片段，（3） T股（T Strand）被转入植物细胞，整合到寄主基因组中，（4）TDNA基因被表达，使植物细胞增殖并产生冠瘤碱。1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理1.5.1 Vir基因的诱导1.5.2 VirA和VirG被结构性表达1.5.3 TDNA的加工及转移1.5.4 T-DNA链整合植物基因组1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机

23、理1.5.1 Vir基因的诱导 细菌处于易感受伤植物附近，受伤植物产生酚类物质（如烟草组织产生的乙酰丁香酮），诱导Ti 中Vir 基因的表达。 章鱼碱型（ocs） Ti 质粒具有8个Vir 操纵子：VirA，VirB，irC，VirD，VirE， VirF，VirG，Vir H 胭脂碱型（Nop）有7个Vir 操纵子： VirA，VirB，VirC，VirD，VirE，VirG，Tzs1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理1.5.2 VirA和VirG被结构性表达（1）VirA 基因产物VirA蛋白，是细菌细胞膜上的疏水蛋白，是植物酚类物质如乙酰丁香酮的受体。（2）VirA蛋白与酚类物质结合，导致

24、VirG基因产物VirG蛋白的磷酸化，VirG蛋白是个转录活化因子，其磷酸化形成一个DNA结合蛋白，能与其它Vir基因的启动子中的专一的12bp的序列结合，开启它们。因此，磷酸化把virG蛋白从非活性状态转变成活性状态。1.5.2 VirA和VirG结构性表达酚类激活VirA（膜上疏水蛋白）VirGVirG-P不表达的基因Vir活化，开始表达转录因子与专一的12bp序列结合1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理1.5.3 TDNA的加工及转移（1）农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA 首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞，并非整个Ti质粒都进入植物细胞。（2）Vir 基

25、因操纵子系统被活化，VirD(编码VirD1和VirD2两种蛋白，一起决定内切酶活性)表达，在边界重复序列的特定位点形成切点，产生单链断裂。1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理（3）T-DNA的复制 首先是在下链（或称底链bottom strand）25bp重复序列的右边界左起第3和第4碱基间缺口剪切，然后从缺口3端开始合成新的DNA链，并一直延伸到左边界第22碱基处，置换出原来的下链，形成ssDNA，即T链。TDNA的复制VirD蛋白的作用：（1）保护5端不被5核酸酶攻击；（2）T-DNA进入植物细胞核的向导VirE蛋白的作用： 编码ssDNA结合蛋白，与单链T-DNA结合，包被T链成核蛋白丝

26、，便于运转。1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理（4） T链复合物通过细胞膜的转运 穿膜通常需要在蛋白质N未端有一信号肽，信号肽可帮助跨越细菌内膜（IM）完成后特异肽酶切除信号肽，转运停止。 T链复合物运转的活性物质可能是VirB蛋白。VirB蛋白按功能可将Vir B蛋白分为5类：R：在内膜上或内膜内的某些蛋白，可能作为T复合体的受体。A：可能作为能源，作为一种ATP酶促使T复合体被泵出细菌细胞。VirB11可能是这种“A”类蛋白。C：起形成通道的作用。VirB4可能是一种“C”蛋白。VirB4是一种富集蛋白，无疏水区，无信号肽，可能在T链转运中起一种结构作用，形成至少一部分特殊的通道结构。S：

27、载体蛋白，起运载T复合体穿过通道的作用，这类蛋白可能与所有的膜成分（内膜及周质）有关。P：位于外膜上，可能作为结合植物细胞膜的一种受体。T复合体经Vir B通道输出示意图P. 细胞结合蛋白；S. T复合体运载蛋白；C. 通道蛋白；A. ATP酶；R.T复合体受体； VirD2.核定位信号； VirE2.保证T复合物在进入膜孔时不受干扰。 （引自Vogel等，1992）1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理1.5.4 T-DNA链整合植物基因组在靶DNA上形成一个缺刻，由于部分解旋，5-3外切酶消化形成缺口。单链T-DNA靠近缺口，由于两链存在短的DNA 互补顺序，于是退火形成异质双链。 T-DNA

28、末端与靶DNA连接靶DNA链的互补链产生缺刻以游离的3DNA末端为引物，修复合成第二条T-DNA链2.2 植物基因工程载体种类（1）目的基因克隆载体：目的基因克隆载体与微生物基因工程类同，通常是由多拷贝的E.coli小质粒为载体，其功能是保存和克隆目的基因。（2）中间克隆载体：中间克隆载体是由大肠杆菌质粒插入TDNA片段及目的基因、标记基因等构建而成。它是构建中间表达载体的基础质粒。2.2 植物基因工程载体种类（3）中间表达载体：中间表达载体是含有植物特异启动子的中间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。（4）卸甲载体：卸甲载体是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构建转化载体的受体质粒

29、。（5）植物基因转化载体：植物基因转化载体是最后用于目的基因导入植物细胞的载体，故亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成。根据它的结构特点又可分为两种转化载体，即一元载体系统和双元载体系统2.2 植物基因工程载体种类2.3.1 卸甲载体 卸甲载体：切除T-DNA上的onc基因（致瘤基因），即“解除”其“武装”的Ti载体，在这种载体中，已缺失的T-DNA部分被E.coli的一种常用载体pBR322取代。这样，任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段，都可通过与pBR322质粒DNA的同源重组，而被共整合到onc- Ti质粒载体上。2.3.2共整合质粒（1）首先构建中间载体，

30、如将大肠杆菌pBR322质粒带上一段与Ti质粒T区同源的一个片段，它在大肠杆菌和农杆菌中均能复制；（2）将目的基因插入该片段的适当位置，使目的基因两端带上与Ti质粒T-DNA同源的DNA序列；（3）然后将该质粒通过转化或接合引入含有Ti质粒的农杆菌中。（4）引入的衍生质粒和原细胞中Ti质粒具同源性，因而可产生无性配对重组，通过交换，可将目的基因转到Ti质粒上，使之产生真正的具有外源基因的Ti质粒，称共整合质粒。 2.3.3 双元载体 （1）双元载体，也称反式载体，是指由两个分别含T-DNA和Vir相容性Ti质粒构成的双质粒系统。（2）其中之一含有为T-DNA转移所必须的Vir区的质粒，另一个则

31、是含有T-DNA区段的寄主范围广泛的DNA转移载体质粒，后一种质粒较小，可在大肠杆菌中复制，因而易操作，可用来插入外源基因。（3）两种质粒同时存在时可恢复T-DNA的转移功能。2.3.4 载体盒 （1）所谓“载体盒”(Vector cassette)是将植物的标志基因、多插入位点、细菌标志基因和质粒的复制启动子位点等集于一身的质粒系统，象一个集装箱似的集合在一起。 （2）载体盒可以在大肠杆菌和农杆菌中保持，也易于插入到各类质粒载体、转座子或噬菌体中。2.4.1标记基因必须具备的条件 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶。 基因较小，可构成嵌合基因 能在转化体中得到充分表达 检测容易，并且能定量分析2.4.2常用的标记基因n冠瘿碱基因nGus基因(-葡糖苷酸酶基因)nCat(氯霉素乙酰转移酶基因)n(GFP)绿色荧光蛋白基因