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1、实验十四血清胆固醇测定（胆固醇氧化酶法）胆固醇的测定方法很多；通常可分为化学试剂比色法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法五大类。化学试剂比色法中有直接法和间接法；前者可用血清直接测定， 后者是用溶剂或其它方法提取胆固醇后再作定量。 酶法由于操作简便、 结果准确，试剂无腐蚀性，而且因使用特异性酶，大大减少了血液中其它成分的干扰，目前已成为测定胆固醇的主要方法。【目的】1了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理，能进行血清胆固醇测定的操作。2. 掌握血清胆固醇测定的临床意义。【原理】血清中总胆固醇 （ TC）包括胆固醇酯 (CE) 和游离型胆固醇 (FC), 酯型占 70%，游离型占
2、30%。胆固醇酯酶（CEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶（ COD）的作用下氧化生成4- 胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（POD）催化氢与4- 氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下：胆固醇酯CEH胆固醇 脂肪酸胆固醇OCOD4- 胆甾烯酮 H2O222H2 O2 4- 氨基安替比林 酚POD红色醌亚胺【器材】试管、吸管、试管架、微量加样器、恒温水浴箱、分光光度计。【试剂】酶法测定胆固醇多采用市售试剂盒。1.酶应用液胆固醇酶
3、试剂的组成为：pH6.7 磷酸盐缓冲液50mmol/L胆固醇酯酶 200U/L胆固醇氧化酶 100U/L过氧化物酶 3 000U/L14- 氨基安替比林0.3 mmol/L苯酚5 mmol/L此外还含有胆酸钠和Triton X-100，胆酸钠是胆固醇酯酶的激活剂，表面活性剂Triton X-100能促进脂蛋白释放胆固醇和胆固醇酯，有利于胆固醇酯的水解。2 5.17 mmol/L（ 200mg /dl ）胆固醇标准液精确称取胆固醇200mg 溶于无水乙醇， 移入 100ml 容量瓶中， 用无水乙醇稀释至刻度( 也可用异丙醇等配制) 。【操作】取试管 3 支，编号，按下操作。表 3-15酶法测定血
4、清胆固醇操作步骤加入物（ ml）测定管标准管空白管血清0.02胆固醇标准液0.02蒸馏水0.02酶应用液2.002.002.00混匀后， 37水浴保温 15 分钟，在 500nm波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。【计算】血清胆固醇 (mmol/L)测定管吸光度× 5.17标准管吸光度【注意事项】1. 黄疸血清过高的胆红素可还原部分反应中的 H2O2 ，降低显色反应，使结果偏低。但测定胆固醇，胆红素对酶法的干扰比化学法小。2. 用胆固醇标准液引起的误差较大，故目前提倡采用胆固醇定值血清为标准。3.轻度溶血对测定结果无影响，但明显溶血可使结果增高，此时可用一个不加COD的空白管从结果中减去后纠正。4.其它影响因素，如维生素C、谷胱甘肽、氟化物引起负偏差。【正常参考范围】3.10 5.70mmol/L【临床意义】21.血清胆固醇增高常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症、糖尿病、肾病综合征、胆管阻塞、甲状腺功能减退。2.血清胆固醇降低常见严重贫血、甲状腺功能亢进、长期营养不良等。【结果及分析】【思考题】1胆固醇有哪些重要的生理功能，血清胆固醇升高对机体最严重的危害是什么？2胆固醇在体内可转变为哪些物质，如何排泄？3实验中需要哪几种酶参加，各有什么作用？3
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