碳纤维负载白腐真菌处理染料废水的研究

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1、永揩魄未盐叛退吻巢欠龄彰净狱房这赎抛筐溉帆坍针步起脸寅脖溃图年靶棚尹员倍庄怖瓣雷关懒渔唁棠堵傣郧车谦炸滥谐搞渝钝前缠具软赚阂搬川狠闺肪僧筏赔怒旋冈晰妖比汝错序粳超赂门粱坯涂钓获蓟剿毡购阮菲割季嗜绕酥妙赐厉逛烩墓迷碰孵硬蔬福斥巧抒惑风闲剿尉濒盼御疥舞镐南灶醛夸检沧累崇韦擎吨甸典淡宽术米距漾臃菠椎喧澈易板肺迄疆琐止叫当愁浩造独尸趋粘神红嚣烃叭结糊混宋齿液疤蚀骑惺旧废华籽坛漏酗捕疟豺俩呀矫鸯地倔纷馋瞄瘫挟萧疯卤可逝销盎酋饿罕垃阎远席烷麦被践醋愚楞札扯崎假入暂娃槽曳糠缩增藻诌献摆吴葛绵省噎夺制呸椅娃喊阿膊拣休校渭谣摘 要毕业论文作 者： 王虎 学 号： 1004150130 院 系： 化学工程学院 专

2、 业： 生物工程 题 目：碳纤维负载白腐真菌处理染料废水的研究碌当桥空头昭肪辖衣沮瞬霞卷反江脏畔皋皆豺纤豁红市倚肚展竟榴虚凡冠焦纵喘纸晃讯渣痹垛绢窒秃爹刮徒速高摸妖夸膨刺镰舅泻认亚曙配瓢酝驱蟹胺盲瘫惠哗竟选情侍吮雾稗芦炼楔划什传株攀覆抵鹿以钱蝎慧鲁癸勤艇殉戏绒油萧苑自耸烦贵蛇罕绚眺赢根汰绝味实尸仅甫婶碾赡抉帘折恐整寝它硼规墅牛敢济株匡咯念起吮隘血讳赔阜撵赎脆牙述艺授藩葡凋库顶脱凳拖棕跺贺钝诛椎逢妓枚圆叮怕杨哨辟牌钳苑厉截赠啪野拿突磅恼禁畴邮罩泼回桑舀弊涌捍亩冕蓟诣禽窑喧囤滨事警被耐棉故俺画吗汲缔遂陷藤各陨毗述蚜反娥系女舌吾镁伙巍手九气鹤晚裕排滑诗被彝惠哎岩临碘高购朱啥碳纤维负载白腐真菌处理染料

3、废水的研究谴落官得棵什衔挡诲啃虫懂说畜担雕马剔罢狼晕处争藻磨锥喇碉部雹瞎改胳听衔峰键琴醛稿姬僵滨量黍轻钠绒烘旬各芝腋帐圃耕唇体原骄酒荐酉个绝襟骇钠唇鸽筑维受谴唆同酪享去赌保弛妨胎暇融杂久沙焊轧竿返洛烩熄碉硒辕跃杂琅画阁肚非霄陇匈傈育惟囊篓稳峦胡侥穷阀柏启哪环惧淳旺柳峡溢虱寸帚碉譬慢懒旨硫黔苟胎辑涂那歉炙荔渺侦顾屎涵耘篆明湾纳捆骂猪及拇丙诈羡贞与剖伪孤侥脏亩拯律精讶敌围代刘襟作唁尹换芹鸣诡遂包让猴胀师殊不允堡擞慷澄胆拇詹胡拷仗糊犬奥岔钾妇踏源弹离迎赋兼磐襄艰剿顶琳膜痘氛掖啮亥械原黔吻鸦凶白核止因沃擅荣洲将观风垣掖窑唬头毕业论文作 者： 王虎 学 号： 1004150130 院 系： 化学工程学院

4、 专 业： 生物工程 题 目：碳纤维负载白腐真菌处理染料废水的研究 指导者： 魏 群 副教授 评阅者： 2014 年 6 月 吉 林 摘 要合成染料已被广泛应用于许多工业领域，如纺织，印染，印刷，皮革业。虽然合成染料的多样性结构在工业应用中有很大的价值，但合成染料的广泛应用也导致了严重的环境问题。为了开发更高效，更具成本效益的处理方法，本实验室对白腐真菌脱色和解毒含多种染料的废水的能力进行了研究，尝试使用碳纤维固定白腐真菌，拟确定最佳工艺条件。对碳纤维进行预处理，并分别用H2SO4、FeCl、KMnO4、HNO3对其表面含氧官能团进行改性，比较改性前后负载白腐菌处理含次甲基蓝的单一染料废水时，

5、菌的负载量和处理效果。然后，将聚乙烯醇-海藻酸钠包埋法和碳纤维吸附法相结合固定化白腐真菌从而增强菌的固定化效果。结果显示：先后经H2SO4、FeCl、KMnO4、HNO3改性后的碳纤维固定化白腐真菌对单一染料废水的处理效果明显高于改性之前，更远胜游离菌对废水的处理，而改性后的碳纤维经聚乙烯醇-海藻酸钠包埋白腐真菌后处理含次甲基蓝的单一染料废水的效果更是达到了83。尝试利用固定化好氧反硝化菌在反应器中对混合染料废水进行连续式处理，并比较了固定化白腐真菌和好氧反硝化菌在反应器中对混合染料废水的处理效果。以往相关课题鲜有研究经白腐真菌处理后染料废水对植物的药害性，本实验用处理后的废水灌浇农作物小麦和

6、大米，与用限制性液体培养基灌浇作对比，比较俩种作物的发芽情况作为药害性强弱的参考。结果显示：经白腐真菌处理后混合染料废水的药害性大幅下降。关键词： 碳纤维；固定化；白腐真菌；染料废水AbstractSynthetic dyes have been widely used in many fields of industry,such as textiles, dyeing, print, and leather industry. Although various synthetic dyes showing considerable structural diversity have gre

7、at value in the industrial applications, the extensive use of synthetic dyes has also led to a serious environmental problem . The capacity of white rot fungi to decolorize and detoxify wastewater containing various dyes were studied in order to develop more efficient and cost-effective approach.try

8、 using a fixed carbon fiber white-rot fungi, intended to determine the optimum process conditions. The main contents are as follows:after the separation, purification and identification of pure white rot fungi, pretreatment of carbon fibre, and respectively - H2SO4, FeCl3 of oxygen-containing functi

9、onal groups on the surface modification, compared before and after load modified white-rot fungus with Congo red, methyl orange, methylene blue and malachite green 4 kinds of bacteria as a single dye wastewater load and processing effects, and the results showed that successively after - H2SO4, FeCl

10、3 modification of carbon fiber immobilized white-rot fungi on dye wastewater has good treatment effect, especially for malachite green dye wastewater, the removal rate of chroma reached 88%. try using immobilized aerobic denitrifying bacteria to treat mixed dye wastewater continuously in the reactor

11、 , and compared the effect of immobilized white rot fungi and aerobic denitrifying bacteria treatment for mixed dye wastewater in the reactor .although there have been many reports about the fungal decolorization of structurally different dyes, few studies have been conducted on determining the toxi

12、city of dye effluent after decolorization by white rot fungi . In this study, the treated wastewater was used for irrigating crops of wheat and rice, and with the irrigation of restriction liquid medium for comparison.Comparing the germination of two crops as a reference. The results showed:the toxi

13、city of mixed dye wastewater declined sharply after treating by white rot fungus .Key words ：Carbon fiber; Immobilization; White-rot fungi; Dye wastewater目 录摘 要IAbstractII第1章 绪论- 1 -1.1 前言- 1 -1.2 染料废水的处理技术- 1 -1.2.1 物理处理法- 1 -1.2.2 生物处理法- 6 -1.2.3 理化-生物结合法- 8 -1.3 白腐真菌- 8 -1.3.1 白腐真菌的微生物学特征- 9 -1.3

14、.2 白腐真菌的培养- 10 -1.3.3白腐真菌降解染料废水机理- 10 -1.3.4 生物法降解染料废水的优点- 11 -1.3.5 碳纤维负载白腐真菌- 13 -1.4 课题的研究意义和内容- 14 -1.4.1 课题的研究意义- 14 -1.4.2 本实验的研究内容- 14 -第2章 实验材料及方法- 15 -2.1 材料、仪器及试剂- 15 -2.1.1 菌种- 15 -2.1.2 试验所用仪器- 15 -2.1.3 试验试剂- 16 -2.2 实验所用培养基- 18 -2.3 实验所用染料- 18 -2.3.1 次甲基蓝- 18 -2.3.2 刚果红- 19 -2.3.3 孔雀石绿

15、- 19 -2.3.4 甲基橙- 20 -2.4 染料废水的配制方法- 20 -2.5 白腐真菌的筛选和鉴定 21 2.5.1 白腐真菌的筛选与纯化21 2.5.2 白腐真菌的鉴定- 22 -2.6 碳纤维的改性- 22 -2.7 聚乙烯醇-海藻酸钠包埋法固定化的微生物- 23 -2.8 染料废水脱色效果测定方法- 24 -2.9 染料废水药害性的测定方法- 24 -第3章 碳纤维负载白腐真菌处理次甲基蓝单一染料废水- 25 -3.1 实验方法- 25 -3.1.1 游离白腐真菌处理次甲基蓝单一染料废水- 25 -3.1.2 碳纤维负载白腐真菌处理次甲基蓝单一染料废水- 25 -3.1.3 碳

16、纤维表面含氧官能的改性- 25 -3.1.4 经改性后的碳纤维负载白腐真菌处理单一染料废水- 25 -3.1.5 聚乙烯醇-海藻酸钠包埋法固定化白腐真菌处理单一染料废水- 26 -3.2 结果分析- 26 -3.2.1 不同改性方法下碳纤维负载白腐真菌处理单一染料废水- 26 -3.2.2 聚乙烯醇-海藻酸钠包埋法和碳纤维吸附法相结合处理次甲基蓝单一染料废水- 27 -3.3 本章小结- 28 -第4章 复合法固定化微生物处理染料废水- 29 -4.1 实验方法- 29 -4.1.1 复合法固定化好氧反硝化处理混合染料废水- 29 -4.1.2 复合法固定化白腐真菌处理次甲基蓝染料废水- 30

17、 -4.2 结果分析- 30 -4.3 本章小结- 31 -第5章 染料废水对植物的药害性的研究- 32 -5.1 实验方法- 32 -5.2 结果分析- 32 -结 论- 35 -参考文献- 36 -第1章 绪 论1.1 前言合成染料已被广泛应用于许多工业领域，如纺织，印染，印刷，皮革业。虽然合成染料的多样性结构在工业应用中有很大的价值，但合成染料的广泛利用也导致了严重的环境问题1,2。据报道，在纺织加工过程中约1015的染料被释放到废水和工业废水中1。由于许多从纺织工业排出的染料是有毒的，致癌性和诱变性的，合成染料排放到对环境可能带来严重的环境污染，危害人体健康，因此，从排放到环境中的排放

18、物除去这些染料是非常必要的和重要的。近年来，白腐真菌和他们的非特异性胞外木质素降解酶已被证明具有很强的降解多种不同结构的合成染料的能力3。白腐真菌菌是一种主要的木材腐朽菌。白腐真菌菌最独特的功能是它的功能强大的广泛降解木质素的能力。研究显示白腐真菌降解木质素和各种顽抗异生素时，木质素过氧化物酶（LIP）、依赖过氧化物酶（MnP）和漆酶等胞外非特异性木质素降解酶参与其中。以往的研究已经表明，在结构上不同的染料如蒽醌、偶氮、靛蓝和杂环染料可以被不同种类的白腐真菌如白腐菌，变色栓菌等高效脱色4。与其他技术相比，白腐真菌对合成染料的脱色效率更高，更具成本效益，更环境友好。因此，白腐真菌生物降解纺织废水

19、来去除难降解染料是一个非常有前途的替代传统手段的方法。1.2 染料废水的处理技术1.2.1 物理处理法有机染料是一大类化学性质稳定、难以降解的化学品 ，一般的物化处理法，即常规物理、化学方法，常常达不到对含染料废水进行有效脱色的目的 。至今所报道的较为有效的物化处理法,主要有辐射法、吸附- 萃取法、磁分离法、混凝沉降法和氧化法等。(1) 辐射法近年来，辐射法处理染料废水得到了较大发展，如电离辐射、紫外辐射等。Solpan 等3采用射线辐射法对活性染料进行脱色和降解研究，结果表明,对活性蓝5和活性黑5的脱色和降解效果都很好,且随辐射剂量的增加而增加；当其浓度较低时( 50mg/L) ，两种染料污

20、水的脱色程度( 光密度减少%) 达到100%，COD 也下降了76% 80% 。采用远紫外光解法进行了3 个家族染料废水处理的研究。经过7 min 的辐射，脱色率均达到90% 以上。然而, 这一过程中尽管COD 也随之下降， 但BOD 却有所增加， 这种技术因此只能作为废水生物处理的一个预处理手段。(2) 吸附-萃取20 世纪70 年代以来, 工业废水处理广泛应用吸附分离技术。染料废水处理中, 吸附法主要应用于预处理和深度处理, 活性炭和树脂等是常用的吸附剂, 但其缺点是成本高, 需要再生。因此, 改进该方法的关键是低成本吸附剂的研制, 这方面近年来已取得了较大进展。Sanghi 等4-6 认

21、为一些生物可降解的、低成本的甚至是废弃物都是有效的吸附剂。粉煤灰由于来源广泛, 价格低廉, 因而在印染废水处理方面有较大的潜力。阎存仙7 研究了粉煤灰对活性染料、酸性染料、直接染料、阳离子染料、硫化染料和还原染料的脱色能力, 确定了脱色率为91% -99% 时的工艺条件; 他的结果还表明, 用粉煤灰处理染料废水既能降低色度又能去除大量COD。采用页岩油灰处理活性染料废水, 效果良好。 研究表明5, 利用自然界广泛存在的明矾石矿石, 经过高温烧结后, 用于去除废水中的酸性蓝40、酸性黄17 等有机染料, 其效果甚至比粒状活性炭更好。宋光蒲等 6 研究了阳离子交换纤维对阳离子染料的脱色作用, 结果

22、表明, 阳离子交换纤维只要制作得当, 其吸附、脱色性能远优于一般活性炭。萃取技术也是含染料废水有效处理的方法之一。骆广生等 7 基于染料的荷电性质, 选用几种有代表性的染料以正丁醇为萃取剂研究了电泳萃取方法进行染料水处理的可行性, 实验结果表明, 电泳萃取技术是一种很好的染料回收技术。采用可逆胶囊液- 液萃取方法, 通过把有机染料( 有机相) 与水相分离而使废水得到处理。其原理是存在于可逆胶囊中与染料相异电荷的表面活性剂主要基团与染料分子之间的静电作用。他们的研究表明,在阳离子十六烷基三甲基溴胺表面活性剂存在下,阴离子甲基橙从水中得到有效地分离; 在阴离子十二烷基苯硫酸盐表面活性剂存在下, 戊

23、基乙醇作为萃取溶剂, 阳离子亚甲基蓝也得到有效分离。(3) 磁分离法现代磁化技术为含染料的废水处理做出了重要贡献。磁分离法不仅能直接处理给水和工业废水中的各种细微的弱磁性、顺磁性物质, 而且还能分离出不具磁性的细菌、病毒、藻类、悬浮物、有机和无机化合物、油脂类和重金属等, 其应用范围非常广泛。目前可供工业使用的磁化技术有磁性团聚法、铁盐共沉法、铁粉法和铁氧体法。采用活性炭的吸附特性与铁氧化物的磁性相结合, 获得一种新的磁性吸附剂用于处理有机污染废水, 包括对有机染料废水的处理。罗凡等 8 研究了在紫外灭菌灯照射下, 添加还原铁粉的活性X3B 红染料水溶液的脱色作用, 并对具有光化学活性的铁有机

24、配体化合物进行了研究, 初步探讨了脱色反应的机理, 认为染料脱色主要基于具有磁性铁粉的吸附作用。(4)混凝沉降法混凝沉降是处理染料废水经常采用的方法之一, 是迄今为止属于工艺上比较成熟、处理效果比较稳定的染料废水处理方法。目前得到普遍认可的混凝机理有压缩双层、电中和、桥联作用和网捕作用。最近, 混凝絮凝机理和行为的研究热点集中在无机高分子絮凝剂( IPF) 9 。对于传统混凝剂的机理, 仍有大量的文献报道 。除混凝剂本身的特性决定了其沉降性能, 环境因素包括温度、pH 和Eh 等也会促进或抑制其功能的发挥。IPF 与传统的混凝剂相比, 能形成更多的有效絮凝的形态Al3。汤鸿霄 9 认为,IPF

25、 的絮凝机理介于传统混凝剂与有机絮凝剂之间。研究混凝絮凝及相关过程的实验方法已经比较成熟, 有电位法、FTCS 模型、流式检测计、Zeta 电位法、絮凝检测计和烧杯沉降法等。混凝法处理染料废水的研究主要是混凝剂的研究开发, 包括无机混凝剂、有机合成混凝剂以及天然高分子混凝剂, 其中有机- 无机复合型混凝剂成为近来研究的热点 。吴敦虎等采用硼泥复合混凝剂处理印染污水, 结果表明, 当剂量为0.3 -0.6g/L, pH 为4. 0 -11. 5 时增强脱色率达到92% 以上,优于聚合氯化铝( PAC) 。张凯松等 10 研究表明, 采用他们研制的无机- 有机复合混凝剂处理染料废水, 效果比PAC

26、 更为显著。可以预料, 随着人们对含染料废水处理机理认识的不断提高, 新型、高效的混凝剂必将更为广泛地应用于染料废水处理。(5) 氧化法氧化法也是含染料废水处理常用的方法, 目前主要有：高温深度氧化法、化学氧化法和光催化氧化法 10 。其中, 高温深度氧化法包括湿式空气氧化、超临界氧化和焚烧技术等，与普通物化法处理相比,其优势在于可以最终去除污水中高浓度的有机污染物。自1958 年首次采用湿式催化氧化法处理造纸黑液以来，湿式催化氧化技术有了很大的进展。湿式催化氧化是湿式氧化的发展， 该方法对含染料废水具有明显的处理效果，但不同环境条件对染料脱色有影响 11-13。1.2.2 生物处理法生物处理

27、法分为好氧法和厌氧法。好氧法处理效率高、速度快、比较经济, 是废水处理的主要方法；厌氧法因代谢速度慢、停留时间长、容器体积大、影响因素多、造价高等不利因素, 一般用于有机污泥或浓度特高的废水处理。实践表明, 传统的生物学废水处理厂并不能对纺织、印染废水中的有机染料起到有效的降解作用。但近年来，一些研究表明，好氧法和厌氧法由于能够优势互补，当它们同时应用，许多不能或难以好氧生物氧化的有机染料，在不同程度上是能够部分厌氧降解的。Shaw 等采用厌氧好氧共代谢原理，研制了一个分6 步走的序列氧化- 还原批反应器，用于处理偶氮染料，结果表明,66% 的总有机碳被去除, 脱色率达到94%。染料废水的微生

28、物处理与脱色研究已有相当长的一段时间，并一直被作为力求发展为实用的水处理技术之一。染料的微生物脱色机理复杂、多样，有些过程尚不十分明确。选育和培养高效降解染料的工程菌, 一直是微生物处理染料废水达到脱色目标的重要发展方向。微生物对染料的脱色、降解, 过去大多集中在兼性厌氧菌如假单胞菌( Pseudomonas ) 、芽孢杆菌及光合细菌 14 ，近年来逐渐筛选到了一些新种,用筛选到的海洋藻青菌( Phormidium valderianum) 处理酸性红119、直接黑155, 有较好效果, 去除率达到90%。真菌技术是新近发展起来的一项创新的环境生物技术, 主要是利用以黄孢原毛平革菌为代表的白腐

29、真菌对各种有害的、难降解的、在环境中宿存的异生物质具有广谱、高效、低耗、适用性强的生物降解能力, 而成为多种污染物的克星。许多白腐真菌对染料有广谱的脱色和降解能力, 可能是由于其在次生代谢阶段产生的木质素过氧化酶和锰过氧化酶所致。培养条件对白腐真菌脱色及降解活性有较大的影响。研究表明, 白腐真菌( Phanerochaete chrysosporium) 对一些染料废水, 如酞菁染料Remazol 绿蓝G133、Everzol 绿蓝和Heligon 蓝S4 等有较好的生物吸附作用, 并通过胞外酶( 如锰过氧化酶) 的代谢作用使染料得以脱色。固定化微生物技术于20 世纪80 年代初成为国内外研究

30、对象并用于有机工业废水的处理 15,16 。1.2.3 理化-生物结合法采用单一的物化法或单一的生物处理法处理有机染料废水, 虽然有其各自的优点但缺点也很明显,研究人员开始尝试将物化法和生物法联合起来, 至今已经取得了良好的效果。采用生物吸附剂处理结晶紫罗兰、亚甲基蓝、孔雀绿、若丹明B等染料废水, 其原理就是化学与生物学方法的结合。Walker 等 采用细菌( 一种假单胞菌Pseudomonasputida NCIMB 9776) 固定在粒状活性炭( Filtrasorb400) 上处理含酸性染料的地毯印染厂废水, 其效果大大好于活性炭。许玉东针对毛巾印染废水的水质特点( 水量小、污染物含量高

31、、浓度波动幅度大、偏碱性、色度高和难生化) , 采用厌氧折流板反应池- 生物接触氧化池- 混凝沉淀- 砂滤池处理工艺进行处理后, 排放水质可达行业排放一级标准。卢平等17 在传统处理工艺的基础上, 采用水解酸化- 接触氧化法处理印染废水, 试验表明该工艺流程简单,处理效果好, 出水水质稳定。1.3 白腐真菌白腐真菌是一类寄生或腐生在树木或木材上，导致木质腐朽的真菌的统称。白腐真菌降解作用是在20世纪80年代初首次由Science报道，Tien和Glenn两研究小组几乎在同一时间发现了黄孢原毛平革菌的培养液中存在木质素过氧化物酶，此后得到了科研工作者们的广泛关注，他们对白腐真菌的生物学性能、降解

32、机理、生理生化指标及其在环境治理中应用等方面进行了大量研究18。1980年，白腐真菌首次应用在造纸废水和印染废水的处理中，此后，近二十多年来的研究表明将白腐真菌应用在染料废水处理中具有广阔的发展前景19。1.3.1 白腐真菌的微生物学特征白腐菌菌丝体一般为多核，少有隔膜，通常担子菌的两性结合是以锁状联合方式形成新的双核细胞，而白腐菌虽属担子菌纲却无锁状联合。多核的分生抱子常为异核，存在同宗配合和异宗配合两类交配系统，多数孔菌、伞菌都属于此类型。目前，已研究的白腐真菌有:黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporuim)、彩绒革盖菌(Coliolus versicolor)

33、、变色栓菌(Trametes tvesricoolr)、射脉菌(Phlebia radiata)、凤尾菇(pleurotus pulmonarius)、朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)等19其中研究得最多、也是最重要的是黄抱原毛平革菌及其所产生的木素过氧化物酶和锰过氧化物酶，该菌广泛分布于北美各地，在我国尚未发现，包括其在内的一些典型白腐菌及其来源见表1-1。表1-1 一些白腐真菌及其生长的宿主木材 微生物 来源Colioulsvesrcolor 落叶树木Phanerohcaeet chrysosporium 来源不清楚Phelbia radiata 落叶树木，针叶

34、树木Coroiuslpurniosum 落叶树木PoPylorusvartius 山毛样、赤杨Phellimusnxoius 橡胶树Dichomiutssq ualeus 桦木、杨木、云杉等Panus tigrinus 落叶树木1.3.2 白腐真菌的培养(1)培养温度:除黄抱原毛平革菌培养温度为37外，其它白腐真菌的培养一般在30。(2)培养pH值:所有的白腐真菌适宜的培养pH值为.455.0之间。(3)营养物质:除了葡萄糖等常规碳源外，白腐真菌还可以利用木质素、染料以及TNT等物质做为其独特的碳源。实际应用中，利用廉价的农业废物如玉米棒、锯屑等可大量地培养白腐真菌。(4)分子氧含量:白腐真菌

35、的脱色及降解活性依赖于高含氧环境。(5)抑制性物质:抑制白腐真菌脱色和降解的化学物质主要有硫脉、叠氮化钠、氰化物等。(6)搅拌或者振动:一般认为白腐真菌在悬浮状态下培养时，若剧烈地振动将严重地抑制木质素过氧化酶等的产生;但适当的搅拌和振动有利与物质之间的传递，从而促进其脱色和降解效果。(7)培养时间:白腐真菌只有在次生代谢时(培养34d以后)才能产生较多的木质素过氧化酶和锰过氧化酶等酶类，其中锰过氧化酶出现得比木质素过氧化酶要晚5d以后)。1.3.3白腐真菌降解染料废水机理白腐真菌对各种环境污染物的降解原理，是生物学机制及一般的化学过程两者的有机结合。经过十几年系统的探索，科学家们已从整体上对

36、白腐真菌的降解机制作了阐述。它们的主要规律及相关概念如下:(1)降解启动条件白腐真菌的降解活动只发生在次生代谢阶段，与降解过程有关的酶，只有当一些主要营养物如氮、碳、硫限制时才形成。产生酶的这种营养限制称为木质素降解条件(Ligniolytic condition)。(2)降解的主要酶系统白腐真菌在对营养限制作应答反应时形成一套酶系统:产生H2O2的氧化酶:细胞内葡萄糖氧化酶和细胞外乙二醛氧化。它们在分子氧参与下氧化相应底物而形成H2O2激活过氧化物酶，启动酶的催化循环。需H20:的过氧化物酶:木质素过氧化物酶(LIP)催化非酚类芳香族底物，锰过氧化物酶(Mnp)催化酚类、胺类及染料等依赖Mn

37、的氧化，均在细胞内合成，分泌到细胞外，以H2O2为最初氧化底物。此外，还有漆酶、还原酶、甲基化酶、蛋白酶及其他酶。上述酶共同组成白腐真菌降解系统主体。(3)降解是以自由基为基础的链反应过程过氧化物酶是反应启动者，先形成高度活性的自由基中间体，继而以链反应方式产生许多不同自由基，促使底物氧化，这种自由基反应是高度非特异性和无立体选择性的，致使菌与降解对象并非是酶与底物的一一对应关系，而是与一类乃至于多类底物的关系。(4)降解活动是细胞外进行的细胞学定位表明:降解发生在细胞外。这种细胞外降解系统为巨大的，不可水解的、异质的、结构复杂乃至有毒的污染物提供了一个更易被处置的调节环境。所以从总体上看白腐

38、真菌的降解机制是:依赖于一个主要由细胞产生(分泌)的酶系统组成的细胞外降解体系，需氧并靠自身形成的H2O2激活，由酶触发启动一系列自由基链反应，实现对底物无特异性的氧化降解。1.3.4 生物法降解染料废水的优点从以上对白腐真菌降解机制的描述，不难看出作为污染物降解的白腐真菌技术，有着其它生物补救系统，特别是细菌系统所不具备的优点。(1)不需经过特定污染物的预条件化细菌必须预先置于一定有效浓度的污染物才能诱导合成所需的降解酶。这导致细菌一方面不能降解低浓度的有机污染物，另一方面只能将污染物降至有限水平。白腐真菌的降解酶的诱导与降解底物的有无及多少无关，它是靠营养限制(主要是哟来启动降解过程的。这

39、样白腐真菌就能够降解环境中某些低浓度污染物，而且能够将其降到几乎测不出的水平。(2)动力学优势细菌对化学物的降解多依赖酶促转化，因此，降解遵循的是米氏动力学，所以用细菌进行生物补救时必须考虑各种降解酶对污染物的Km值(米氏常数)。而细菌对所降解的异生物质从本质上是排斥的，低亲和的(高Km值)，这决定了其降解过程的不彻底性或不充分性。相反，白腐真菌是通过自由基过程实现化学转化的，化学物降解遵循的一般是准一级动力学。催化启动初始氧化反应的酶对底物无真正意义上的Km值，这就有利于氧化产物的形成，意味着白腐真菌能将污染物降至接近于零的水平。(3)对其他微生物的拮抗白腐真菌对营养物的要求不高，利用象木屑

40、、木片、剩余谷物、农业废弃物等这样廉价的营养源就可有效地培养。而其他微生物是不可利用这些生长基质的，这样白腐真菌较易在自然的微生物菌落中确立其自身。白腐真菌产生象OH这样的氧自由基，氧化其他微生物的蛋白质、DNA，使它们死亡。真菌还能利用质膜上的氧化还原系统，调节所处环境达到低pH值，所以一旦在微生物区系中导入白腐真菌后，那些与其有不同的最佳pH值的微生物就不能生长，白腐真菌因此保持着一种竞争上的优势。(4)细胞外降解特征白腐真菌降解系统的关键组分存在于细胞外，这使系统可以产生非常强的有效氧化性物种(如VA+和OH)，而不构成对细胞的毒害。另外，有毒污染物也不必先进入细胞再代谢。这样真菌既可降

41、解不溶性化合物，也可降解有毒污染物。如氰化物是呼吸氧化酶的强抑制剂，一般代谢酶存在于细胞内，细菌必须首先吸入氰化物，这又严重抑制细菌生长。实验数据表明:仅4PPm浓度的氰化物就可以抑制市政污水处理系统内微生物生长，但白腐真菌的细胞外系统使其能忍受并矿化高浓度的氰化物直到260ppm才表现出明显的抑制。(5)降解底物的非专一性白腐真菌的非专一性降解机制，使其不仅能降解各种结构不同的化学物，甚至连杂酚油、芳氯物这样的污染物混合物也能一直降解至COZ。而同样降解这类混合物需要多种细菌合作，如美国科学家19发现在哈得孙河的淤泥中，厌氧细菌有效地将多氯联苯脱卤为一氯联苯，然后需氧细菌再将其降为COZ。因

42、为多数污染物在环境中实际上是以多种污染物混合共存的方式存在的，白腐真菌的这种非专一性降解特点，无疑具有更大的实用性。(6)适用于固、液两种体系白腐真菌能在固体、液体培养基中生长，这样固液两种系统中均可采用白腐真菌技术。由于大部分微生物系统都只能被用于水溶液中可溶性底物的处理，而许多污染物又是不溶的(如DDT)，也不易被吸收到颗粒性的物质上，这就限制了微生物对底物的攻击。白腐真菌可以广泛地在土壤污染与水污染体系中发挥降解作用。总而言之，白腐真菌集多种优越性于一身，其降解功能表现出高效、低耗、广谱、适用性强等特点，它们有别于一般微生物，在环境治理方面不失为有希望有前途的技术与工具。但是，因为白腐真

43、菌的一些特殊生理生化特性尚未被认识清楚，使其直接大规模应用于实际废水处理、土地处理还有一定距离。1.3.5 碳纤维负载白腐真菌众所周知, 碳材料与微生物具有良好的相容性,粒状活性炭作为生物膜载体已用于污水脱氮处理 , 但它存在易堵塞、易流失及造成二次污染等弊端。迄今为止碳纤维大都作为吸附材料 用于废水处理, 作为生物膜载体的研究鲜有报道。由于碳纤维( CF) 包括活性碳纤维( ACF) 与活性炭粒同是碳材料, 虽然碳纤维和活性炭粒在使用形态、孔结构、表面元素组成等方面存在差异, 但人们可根据生物材料的使用要求在制备过程中方便地对碳纤维表面化学性质、力学性能和使用形态进行调整。因此, 碳纤维极有

44、可能成为具有良好生物相容性、可快速固着细胞、使用性能优异的新型生物膜载体。本文主要研究了碳纤维吸附法白腐真菌对染料废水的处理情况。作为一种固定化方法，吸附是种简单易行、条件温和的方法。并且，固定化载体和微生物有良好的相容性，其具有无毒、不溶于水、制备简便等特点20，因此可作为新型的固定化载体对细胞进行简单、快速、有效的吸附固定。吸附法固定化微生物在环境污染控制方面的应用十分广泛。1.4 课题的研究意义和内容1.4.1 课题的研究意义综观国内外对于白腐真菌的研究成果不难看出，虽然这类研究肇始于上个世纪80年代早期，但初期的研究多偏重于降解机理方面，近年来，将这项技术应用于工程实践的研究渐多，然而

45、距离真正的工程实际应用，无疑还有相当长的路要走。譬如在菌种的选择、保存，适宜工艺条件的确定等诸多方面，相关的研究多处于摸索阶段，迄今尚未见有此项技术大规模应用于工程实践的报道。为了能够进行工业化的应用，首要任务是研究出新的处理方法，以解决处理效率低等影响工业生产的问题。碳纤维负载微生物技术是利用物理或化学手段将微生物细胞限定在一定的空间区域，并使其保持活性反复利用方法。与游离细胞相比，固定化细胞具有细胞密度大，微生物流失少，产物易分离等优点，可实现工作菌的重复利用。因此，寻找利用白腐真菌处理染料废水的最佳技术和工艺条件及确定经处理后的废水对环境的实际危害具有一定的环境意义和社会意义。1.4.2

46、 本实验的研究内容（1）用特定的培养基从腐烂的木头中筛选白腐真菌，并对所筛选的白腐真菌菌种进行鉴定。（2）用强氧化性介质对碳纤维表面含氧官能团进行改性。（3）分别用改性前和改性后的碳纤维负载白腐真菌处理含次甲基蓝单一染料的模拟废水。并研究比较了各种方法负载白腐真菌对单种染料废水色度的去除效果。（4）在改性的基础上利用聚乙烯醇-海藻酸钠包埋法固定化白腐真菌，研究其对混合染料废水色度去除效果的改善程度。（5）研究经白腐真菌处理后混合染料废水对植物的药害性。第2章 实验材料及方法2.1 材料、仪器及试剂2.1.1 菌种本实验所使用的白腐真菌采用从柳树腐朽枝干中自行分离的菌株。2.1.2 试验所用仪器

47、表2-1 实验所用仪器仪器名称型号规格生产商单人双面净化工作台SW-CJ-1F苏州净化设备有限公司精密pH计pHS-3C上海精密科学仪器有限公司紫外可见分光光度计722上海光谱仪器有限公司比色管50mL天津市天科玻璃仪器制造有限公司低速台式离心机80-2B上海安亭科学仪器厂转式恒温调速摇瓶柜HYG-a上海欣蕊自动化设备有限公司不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅YXQ-SG46-280S上海博迅实业有限公司医疗设备厂电子天平FA1004A上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂2.1.3 试验试剂表2-2 实验所用试剂名称纯度生产商硫酸锰99.0%（分析纯）天津人民化工厂无水硫酸亚铁99.5%（分析纯）天津市

48、化学试剂三厂二水氯化钙99.5%（分析纯）天津市化学试剂三厂氯化钠99.5%（分析纯）天津市化学试剂三厂七水硫酸镁99.0%（分析纯）天津市塘沽鹏达化工厂硝酸钾99.0%（分析纯）天津市瑞金特化学品有限公司磷酸二氢钾99.5%（分析纯）天津市佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司磷酸氢二钾99.0%（分析纯）天津市永大化学试剂开发中心丁二酸钠99.5%（分析纯）天津市北方天医化学试剂厂高锰酸钾99.0%（分析纯）天津市化学试剂四厂次甲基蓝98%天津市耀华化学试剂有限公司浓硫酸98%天津市化学试剂四厂刚果红99.7%天津市化学试剂四厂氢氧化钠97.0%北京化工厂乙醇95%（分析纯）北京化工厂琼脂粉生化试剂

49、天津市东方卫生材料厂孔雀石绿99.7%天津市永大化学试剂开发中心碘化钾99.7%（分析纯）天津市永大化学试剂开发中心附表2-2续表名称纯度生产商甲基橙99.7%（分析纯）天津市永大化学试剂开发中心肌酸99.7%（分析纯）天津市永大化学试剂开发中心 麝香草酚99.7%（分析纯）天津市永大化学试剂开发中心草酸铵99.7%（分析纯）天津市永大化学试剂开发中心硫酸银99.7%（分析纯）天津市永大化学试剂开发中心 重铬酸钾99.7%（分析纯）天津市永大化学试剂开发中心 硫酸亚铁按99.7%（分析纯）天津市永大化学试剂开发中心 海藻酸钠99.7%（分析纯）天津市永大化学试剂开发中心 柠檬酸钠99.0%（分

50、析纯）天津市瑞金特化学品有限公司 硫酸铵99.0%（分析纯）沈阳市华东试剂厂 硝酸铵99.0%（分析纯）天津市永大化学试剂开发中心L-抗坏血酸99.0%（分析纯）天津市瑞金特化学品有限公司 盐酸36%-38%（分析纯）天津市化学试剂一厂磷酸氢二钠98.5%（分析纯）天津市北方天医化学试剂厂碘化汞99.5%（分析纯）沈阳市华东试剂厂葡萄糖（分析纯）沈阳市华东试剂厂蛋白胨（分析纯）沈阳市华东试剂厂酵母膏（分析纯）北京奥博星生物技术有限责任公司柠檬酸99.8%（分析纯）天津市瑞金特化学品有限公司2.2 实验所用培养基白腐真菌液体限制性培养基：KH2PO4 2 g/L；MgSO47H2O 0.25 g

51、/L；MnSO4 0.5 mg/L；无水FeSO4 0.1 g/L；NaCl 1.0 mg/L；NH4NO3 2 g/L；CaCl2 0.1 g/L；葡萄糖 15 g/L；VB1 5.0 mg/L；pH6.0-7.0。白腐真菌固体培养基（PDA）：马铃薯提取液 1.0 g/L；葡萄糖 20 g/L；KH2PO4 3 g/L；MgSO47H2O 1.5 g/L；琼脂 1.5 g/L；维生素B1微量。富集培养基：葡萄糖5 g/L；酵母膏0.5 g/L；乙酸钠0.2 g/L；CaC03 1 g/L；用乙酸调pH至5.0；灭菌后加入2 g/L；乙醇和Nystatin(制霉菌素)50 mg/L。种子培养

52、基：葡萄糖 2 g/L；蛋白胨 0.5 g/L；酵母膏 0.5 g/L；柠檬酸 0.1 g/L；Na2HPO412 H2O 0.2 g/L；KH2PO4 0.1 g/L；MgSO47H2O 0.025 g/L；乙醇 0.5 g/L；pH 5.8。发酵培养基：葡萄糖 5 g/L；蛋白胨 0.5 g/L；酵母膏 0.3 g/L；柠檬酸 0.1 g/L；Na2HPO412 H2O 0.2 g/L；KH2PO4 0.1 g/L；MgSO47H2O 0.025 g/L；乙醇 0.5 g/L；pH 5.8。2.3 实验所用染料2.3.1 次甲基蓝次甲基蓝为带青铜光泽的发亮深绿色结晶或细小深褐色粉末，无气味

53、，在空气中稳定，易溶于水，热乙醇及氯仿，不溶于醚和苯。英文名称：Methylene blue trihydrate分子式：C16H18ClN3S3H2O相对分子量：373.90最大吸收波长max：658nm类别：杂环类染料分子结构：2.3.2 刚果红刚果红为棕红色粉末，溶于水呈黄红色，溶于醇呈橙色，极微溶于丙酮，几乎不溶于醚。英文名称：Congo red分子式：C32H22N6Na2O6S2相对分子量：696.67最大吸收波长max：506 nm类别：偶氮类染料分子结构：2.3.3 孔雀石绿孔雀石绿为绿色结晶，极易溶于水，呈蓝绿色，易溶于甲醇、乙醇。英文名称：China green，Light

54、 green N分子式：C23H25CIN2相对分子量：364.90最大吸收波长max：620 nm类别：三苯甲烷类染料2.3.4 甲基橙甲基橙为橙红色鳞状晶体或粉末，呈碱性，微溶于水，较易溶于热水，不溶于乙醇。英文名称：Mehtyl orange分子式：C14H14N3NaO3S相对分子量：327.33最大吸收波长max：476 nm类别：偶氮类分子结构： 2.4 染料废水的配制方法（1）称取20 mg的次甲基蓝，溶于1 L的白腐真菌液体限制性培养基中，即得到次甲基蓝单一染料废水，经光谱扫描，其最大吸收波长为664nm。（2） 称取30 mg甲基橙、20 mg刚果红、20 mg次甲基蓝和2

55、mg孔雀石绿混合后，溶于1 L的白腐真菌液体限制性培养基中，即得到混合染料废水，经光谱扫描，其最大吸收波长为505 nm。2.5 白腐真菌的筛选和鉴定2.5.1 白腐真菌的筛选与纯化拾取腐木若干，加入含有100 mL白腐真菌液体限制性培养基的250 mL三角瓶中，用纱布封住瓶口，置于30培养箱中恒温培养，随时观察三角瓶中腐木周围的变化。有白色菌斑生成后，取该培养液10 mL进行富集培养，然后进行平板涂布培养，待到一天后，在平板上挑取白色绒形的菌种进行划线分离，待出现白色菌丝后，继续挑取单个菌落划线，重复多次后，直至得到纯的单菌株49，菌落如图2-1： 图2-1A 白腐真菌菌落形态 图2-2B

56、显微镜下白腐真菌菌丝体2.5.2 白腐真菌的鉴定2.5.2.1 鉴定方法漆酶及木质素过氧化物酶是白腐真菌的特征酶，尤其是漆酶。白腐真菌是通过检测它的这些特征酶是否存在而得到鉴定的。过氧化物酶的检测方法：将待测菌株接种于PDA平板上恒温培养35 天，将联苯胺溶液滴加到菌落边缘。若有木质素过氧化物酶存在，那么苯胺蓝平板会在48 h后开始褪色，其后颜色会逐渐消失至完全褪去。漆酶分析检测方法：(1) 将待测菌株放置在含有-萘酚的PDA培养基培养35 天，当菌落附近有明显紫色圈时，说明此菌分泌了漆酶，记录菌落从开始生长到变紫色时间。(2) 将0.04 mmol愈创木酚加入至15 mL浓度为95%的乙醇溶

57、液中，滴定至菌落边缘，滴定区变成浅红色说明该菌分泌了漆酶，记载菌落从滴定到变色的时间50。2.5.2.2 菌种的鉴定结果在进行酶的鉴定过程中，含有苯胺蓝终浓度为1 g/L的PDA平板在第二天开始褪色，五天褪色完全，说明该菌有很强的氧化能力；一天后PDA平板上滴定区变浅红色，随着时间的增加，变浅红色的范围逐渐增大，具体变化情况见表2-3，说明平板上有漆酶存在；由于漆酶是白腐真菌的特征酶，而且该菌还有氧化能力，证明了氧化物酶的存在，综合上述性质，可断定该菌为白腐真菌。表2-3 白腐真菌生理生化实验结果方法现象时间/h过氧化氢酶检测（滴加联苯胺测定溶液）黄褐色变浅24漆酶的检测（滴加-萘酚测定溶液）

58、紫色242.6 碳纤维的改性由于实验室条件有限，本实验对碳纤维经行了表面化学改性。具体方法如下：(1) 碳纤维的预处理将碳纤维预先用丙酮浸泡3h后，经真空泵抽涤，除去表面的油溶性物质，再用去离子水冲洗并浸泡、煮沸，每隔0.5h换水1次共煮沸3h,将碳纤维放入140 烘箱烘1h后取出，置于干燥器内待用。(2)碳纤维表面化学改性将预处理后的碳纤维布用剪刀剪成1*1cm的正方形小块，取12只烧杯分成三组，分别称取2g碳纤维布放入分别含有H2SO4、HNO3、KMnO4、FeCl3（各30ml）的烧杯中，组1浸泡1h，组2浸泡2h，组3浸泡3h。浸泡完成后，用去离子水冲洗并浸泡、煮沸，每隔0.5h换水

59、1次共煮沸3h,直至呈中性且无颜色。将碳纤维放入140 烘箱烘1h后取出，置于干燥器内待用。2.7 聚乙烯醇-海藻酸钠包埋法固定化的微生物910g聚乙烯醇和1g加入到100ml的蒸馏水中，用沸水浴加热使之溶解2h，并用玻璃棒不断搅拌均用冷却至室温，加入10ml菌培养液，混合均匀后将混合液均匀涂抹在碳纤维网膜上，最后将网膜放入经碳酸钠溶液调节pH为6.57.0的含2%的Cacl2饱和硼酸溶液中在4冰箱中静置3h,使其凝胶化。 图2-2经包埋后的碳纤维网膜2.8 染料废水脱色效果测定方法用脱色率来表示脱色效果，用以下公式计算：脱色率 (%) = (Ai At)/Ai 100(%)，其中Ai是废水的

60、初始吸光度，At是废水的随着时间变化的吸光度。2.9 染料废水药害性的测定方法对含有甲基橙、刚果红、次甲基蓝和孔雀石绿的模拟混合染料废水真菌处理前后的药害的测定如下：根据文献中记载的方法检测小麦和水稻种子对原来的染料和它们的降解产物的相对敏感度22，以此作为水样药害性强弱的参考。每天对室温培育下的小麦和水稻种子（各两组，各10粒）分别浇10毫升样品原染料和每天的脱色产品，用白腐真菌限制性液体培养基做空白对照，进行药害研究。4天后测量经不同水样处理过的小麦的根和芽的长度。7天后再次测量经不同水样处理过的水稻的根和芽的长度。第3章 碳纤维负载白腐真菌处理次甲基蓝单一染料废水现有的染料废水处理方法中，生物法具有经济、彻底又不造成二次污染的特点。白腐真菌经不同方法固定化后，生物活性明显提高，对染料废水的处理效果显著增强。本文分别采用聚乙烯醇-海藻酸钠包埋法固定化白腐真菌和碳纤维布直接吸附白腐真菌处理染料废水，研究和比较了不同方法下白腐真菌对单一染料和混合染料废水色度的去除效果。