分子生物学：基础实验技能培训实验操作手册

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1、基础实验技能培训实验操作手册2014-08植物基因组DNA提取实验材料：植物样本，植物基因组DNA提取试剂盒，-巯基乙醇，氯仿，无水乙醇实验仪器、耗材：移液器、电泳仪、离心机、研钵、研钵棒、剪刀、天平、液氮实验前准备：1 Buffer GP1在使用前请加入-巯基乙醇，5 ml Buffer GP1加5 l -巯基乙醇。加入 -巯基乙醇的Buffer GP1室温可保存1个月。 2 预热水浴锅 65度，将加入配制好的巯基乙醇预热。3 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。4 称取植物样本约100 mg。5 在研磨植物材料前，向研钵中倒入酒精，

2、放入剪刀、钥匙高温消毒。6 研钵、剪刀、钥匙冷却后，将液氮加入在研钵中以预冷研钵。实验步骤：1. 取植物新鲜组织约100 mg，用剪刀将样本剪碎，放入研钵，加入液氮充分研磨至粉末状。将粉末转移到离心管中。注意：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移，否则内源性DNase有可能降解基因组DNA。2. 加入700 l 65预热的Buffer GP1（Buffer GP1在使用前请加入-巯基乙醇，5 ml Buffer GP1加5 l -巯基乙醇），迅速颠倒混匀后，将离心管置于65水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管混匀样品数次。3. 加入700 l 氯仿，充分混匀，12,000 rp

3、m（13,400g）离心5分钟。小心将上层水相转入一新的离心管中，加入700 l Buffer GP2，充分混匀。4. 将上步所得溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column DM）中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。10,000 rpm（11,500g）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。5. 向吸附柱中加入500 l Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。6. 向吸附柱中加入500 l Buffer GW2（使用前检查是否已加

4、入无水乙醇），10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。7. 12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。（乙醇一定要吹干, 否则电泳点样时, 样品上漂）8. 将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50l Buffer GE，室温放置2-5分钟，10,000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20保存DNA。9. 电泳检测。感受态制备实验材料：菌株：Top10 （Str+）、LB固体培养基，LB液体培养基，洗脱液，保存液实验方法：Cacl2法制备TOP10感受态实验仪器、耗材：4度离心机，分光光

5、度计、50ml离心管、-80度低温冰箱试剂配制方法：1 L 液体LB培养基：10 g蛋白胨+5 g酵母粉+10 g氯化钠，加蒸馏水至1000ml。100 ml 固体LB培养基：1 g蛋白胨+0.5 g酵母粉+1 g氯化钠+1.5 g琼脂粉，加蒸馏水至100ml。1 L洗脱液 ：16.264 g MgCl26H2O（80 mM）+ 2.94 g CaCl22H2O（20 mM）200 ml 保存液 ：2.205 g CaCl22H2O（75 mM）+ 30 ml甘油（15 %）灭菌条件：122 20 min实验步骤：1. 菌种的划线培养第一天下午4:30分 从-80取甘油菌，在一次性LB平板上进

6、行划线接菌，在37恒温培养箱过夜培养。2. 接菌小摇与培养基的制备第二天下午4:30分 取过夜培养平板，用枪头挑菌于50ml液体LB培养管内，37，250 rpm 摇菌过夜。3. 扩大培养第三天早上8:30分 取过夜小摇菌液 按1:100比例加入250ml三角瓶（含100 ml 液体LB培养基）进行扩大培养，期间监测OD值。4. 冰冻，离心，收菌当OD 600= 0.4 0.5之间时，将摇菌三角瓶置于冰上，冰浴30 min。然后将菌液分别加入50ml离心管中4，3500 rpm，离心10 min收集菌体。5. 洗脱，冰冻，离心将收集的菌体加入洗脱液 12.5 ml, 混匀，冰浴20 min。（

7、每100ml菌液量加12.5ml洗脱液，也可根据总体积调整洗脱液的大小。）4，3500 rpm，离心10 min，收集菌体。6. 分装保存加入保存液5ml（每100ml菌液量），混匀，分装细胞即可。PCR扩增实验材料：GFP模板（约750 bp），GFP Forward Primer，GFP Reverse Primer，Taq MasterMix实验仪器、耗材：PCR仪、移液器、PCR管、1.5ml离心管、电泳仪、照胶仪实验步骤：1. 配制PCR反应体系：每组做两个重复。试剂50 l反应体系2Taq MasterMix（含染料）25 lGFP Forward Primer，10 M1 l1

8、lGFP Reverse Primer，10 MGFP 模板1 lRNase-Free Water22 lTotal50 l2. PCR反应条件： 步骤温度时间预变性942 min变性9430个循环30 s退火5530 s延伸721 min终延伸722 min3. 结果检测：反应结束后，取35 l反应产物电泳检测，并准备进行琼脂糖凝胶回收。琼脂糖凝胶回收纯化实验材料：琼脂糖凝胶胶块、琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒、无水乙醇实验仪器、耗材：切胶仪/照胶仪、小刀、移液器、分光光度计、水浴锅、1.5ml离心管实验前准备：预热水浴锅至50度。实验步骤1、 取2个1.5ml干净的离心管，称取空管重量，将重量标

9、记于管壁上。2、 将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入离心管中，称重， 计算胶块重量。注意：若胶块的体积过大，可将胶块切成碎块。3、 向胶块中加入3倍体积Buffer PG（如凝胶重为100 mg，其体积可视为100 l，依此类推）。4、 50孵育10分钟，其间每隔2-3分钟温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解。如果 还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解。注意：1）当琼脂糖凝胶浓度2%时，适当延长孵育时间。2）胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。5、 柱平衡：向已装入收集管（C

10、ollection Tube）中的吸附柱（Spin Column DM）中加入200 l Buffer PS，17,900g（13,000 rpm）离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。6、 将步骤3或4所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，17,900g（13,000 rpm）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。注意：吸附柱容积为700 l，若样品体积大于700 l 可分批加入。7、 向吸附柱中加入500 l Buffer PG，17,900g（13,000 rpm）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。8、 向吸附柱中加

11、入750 l Buffer PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），17,900g（13,000 rpm）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。9、 17,900g（13,000 rpm）离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。10、 将吸附柱放到一个新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加35 l Buffer EB（pH 8.5），室温放置

12、2分钟。17,900g（13,000 rpm）离心1分钟，收集DNA溶液。-20保存DNA。注意：1） 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围）。2） 为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，重复步骤10。3） 洗脱体积不应小于30 l，体积过少会影响回收效率。4） 如果使用TE洗脱，需要考虑其中含有的EDTA是否会影响后续的酶促反应。5） 回收大于10 kb的DNA片段时，Buffer EB应在50水浴中预热，适当延长吸附和洗脱时间，可增加回收效率。11、 结果检测：1） 浓度检测：对回

13、收后的PCR产物进行浓度测定。2） 电泳检测：取4 l回收前的PCR产物、2.5 l回收前的PCR产物及5 l回收后的PCR产物进行电泳检测。TA克隆连接、转化、涂板、鉴定一、 连接：实验材料：pUC-T载体、回收纯化的DNA片段（750 bp）实验仪器、耗材：移液器、PCR管、PCR仪实验步骤：1. 计算插入片段的体积：1）在进行克隆时，载体pUC-T和插入片段的摩尔比一般为1:2-1:10，本实验我们选择1:3。2）本实验使用的载体pUC-T浓度为50ng/l，50ng的摩尔数约为0.03 pmol，因此本实验插入片段的摩尔数为0.09 pmol，插入片段为750bp，那么本实验插入片段D

14、NA的使用量（ng）=0.0910-3660750（插入片段bp数）=44.55 ng。3）插入片段的体积（l）=插入片段DNA的使用量（ng）/插入片段的浓度（ng/l）本次我们使用的插入片段为上次实验中胶回收片段，因此胶回收片段的浓度为40.6 ng/l，那么，插入片段的体积（l） =44.55/40.6=1.097，即在反应体系中加入1 l插入片段。2. 按以下体系配制反应液：每组做4个。试剂体积pUC-T （50 ng/l）1 ml插入片段（750bp）X mlRNase-Free WaterY mlSolution Buffer，25 mlTotal10 ml3. 混匀，22孵育30

15、分钟，或者16过夜连接。二、 转化：实验材料：TOP10感受态细胞、自制感受态细胞、LB液体培养基实验仪器、耗材：移液器、超净台、浮漂、摇床、水浴锅实验前准备：预热水浴锅至42度。实验步骤：1. 取TOP10感受态细胞置于冰浴中，待感受态细胞融化后，进行以下实验。2. 实验组：将10 l连接产物加入至100 l TOP10感受态细胞中，用移液器轻轻吹打混匀， 冰浴30分钟。每组共做2个。对照组：将10 l连接产物加入至100 l自制感受态细胞中，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。每组做2个。3. 将离心管置于42水浴，热击90秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。4. 向离心管中

16、加入900L的 LB液体培养基（不含抗生素），混匀后置于37摇床，150 rpm振荡培养45分钟，使菌体复苏。三、 涂板、培养：实验材料：LB固体培养基、LB液体培养基、氨苄、IPTG、X-gal实验仪器、耗材：涂布棒、超净台、移液器、培养箱实验步骤：1 倒板：在LB固体培养基中加入氨苄后，进行倒板。将100mg/mL的氨苄稀释1000倍使用。（300 ml培养基 + 300L的100mg/mL氨苄）注意！培养基温度应在50-60度时，再加入氨苄。2 将40L 的20mg/mL的X-gal和20L 50mg/mL的IPTG涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，用无菌的涂布棒均匀涂开。3 离心，倒掉上

17、清，将沉淀中全部转化后的培养物，加到平板上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开。4 将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平板，37培养箱，过夜培养。四、 观察、鉴定：1 观察蓝色和白色菌落，计算白色和蓝色菌落数。2 菌落PCR鉴定实验材料： Taq MasterMix、菌液、M13 Forward Primer、M13 Reverse Primer、LB液体培养基、氨苄实验耗材：超净台、15ml离心管、摇床、PCR仪、移液器、LB液体培养基实验步骤：选择平板，每个平板挑取白色菌落（4个）和蓝色菌落（2个），分别放入50 l RNase-Free Water中，取2 l 进行菌落PCR鉴定。剩下的4

18、8 l 等待菌落PCR结果，选取阳性克隆，于当日下午接种于5ml 含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37摇床，250 rpm振荡培养过夜，用于第二日提取质粒。1） 配制PCR反应体系：试剂20 l反应体系2Taq MasterMix10 lM13 Forward Primer，10 M0.5 lM13 Reverse Primer，10 M0.5 l菌液2 lRNase-Free Water7 lTotal20 l2）配制除菌液外的预混体系，并分装到PCR管中，每个管中加入18 l的预混体系。3）模板加入：每个管中分别加入2 l菌液。混匀，短暂离心。 4）PCR反应条件： 步骤温度时间预变性

19、942 min变性9430个循环30 s退火5530 s延伸721 min终延伸722 min5）结果检测：反应结束后，取5 l反应产物直接电泳检测结果。3 高纯质粒提取鉴定实验材料：菌液，高纯质粒提取试剂盒，无水乙醇实验仪器、耗材：移液器、电泳仪实验前准备：1） Buffer P1中加入RNase A。2） 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。实验步骤：1. 取3ml（根据培养菌体的浓度选择合适的量，建议最多不超过5 ml）过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000 rpm（13,400g）离心2-3分钟收集细菌，尽量吸弃全部上清。注意：质粒拷贝数较低或10

20、 kb时，可以使用更多菌液通过二次离心将菌体沉淀收集到同一个离心管中，同时后续所加试剂Buffer P1、P2及N3的量需加倍。所加试剂的量必须能够充分裂解菌体，菌体过多、裂解不充分都会降低质粒的提取效率。2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250 l Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。3. 向离心管中加入250 l Buffer P2，温和地上下颠倒混匀6-8次，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。注意：不要剧烈震荡，以免造成所提质粒中基因

21、组DNA污染。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。4. 向离心管中加入350 l Buffer N3，立即上下颠倒混匀6-8次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟。12,000 rpm离心10分钟。注意：Buffer N3 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。5. 柱平衡: 向已装入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column CM）中加入200 l Buffer PS，12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。6. 将步骤4中所得的上清液转移到吸附柱（已装入收集管）中，12,000 rpm离心1分钟

22、，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。注意：吸附柱的最大容积为700 l，所以第4步中所得溶液分2次过柱。7. 向吸附柱中加入500 l Buffer PB，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。注意： 如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5，TOP10 等），此步可省略。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21， HB101，JM101， ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步，如果提取低拷贝质粒推荐采用此步。8. 向吸附柱中加入600 l Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,

23、000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。9. 重复步骤8。10. 将吸附柱重新放回收集管中，12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温干燥5分钟。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。11. 将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入50-100 l Buffer EB，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20保存质粒。注意：1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤11。2）Buffer EB在6570水浴预热，适当延长吸附和洗脱

24、的时间，可以增加提取效率。3）洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率。4）洗脱缓冲液体积不应少于50 l，体积过小影响回收效率。12. 结果检测：取5 l产物进行电泳检测。植物总RNA提取材料：植物样本，超纯RNA提取试剂盒，氯仿，75%乙醇（无RNase的水配制）实验仪器、耗材：移液器、电泳仪、4度离心机、分光光度计、研钵、研钵棒、天平、液氮实验前准备：1 配制75%乙醇，用无RNase的水配制。2 称取植物样本100 mg。3 在研磨植物材料前，向研钵中倒入酒精，放入

25、剪刀、钥匙高温消毒。4 研钵、剪刀、钥匙冷却后，将液氮加入在研钵中以预冷研钵。实验步骤：注意：低温冰上操作1. 样品处理：称取植物样本100 mg，将植物样本剪碎后，放入研钵中，加入液氮，充分研磨，研磨充分后，加入1 ml Buffer RLT。注意：样品体积不超过Buffer RLT体积的10%。 2. 样品中加入Buffer RLT后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。 3. 每1 ml Buffer RLT加入200 l 氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟。 4. 4 12,000 rpm（13,400g）离心10分钟，此时样

26、品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管（自备）中。 5. 在得到的水相溶液中加入等体积的70%乙醇（无RNase的水配制），颠倒混匀。 6. 将上步所得溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RM）中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 7. 向吸附柱中加入700 l Buffer RW1，12,000 rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 8.

27、向吸附柱中加入500 l Buffer RW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 9. 重复步骤8。 10. 12,000 rpm离心2 分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。 11. 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中间部位加入30-50 l RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70保存RNA，防止降解。 12. 检测：1）电泳检测。2）RNA浓度和纯度测定：

28、纯度：OD260/OD280 = 1.9-2.1 2.2 RNA水解 浓度：RNA(g/l)=40OD260稀释倍数逆转录cDNA合成实验材料：HiFi-Script cDNA第一链合成试剂盒，RNA（植物RNA实验提取）实验仪器、耗材：PCR仪、PCR管、移液器实验步骤：1.将 RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-Script和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 l。RNA终浓度建议为1g，需要根据测定的RNA浓度，计算逆转录中需要的RNA体积。试剂20 l 反应体系dNTP

29、Mix，2.5 mM Each4 lPrimer Mix2 lRNA TemplateX l（1g）5RT Buffer4 lDTT，0.1 M2 lHiFi-Script，200 U/l1 lRNase-Free WaterYTotal20 l3. 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。4. 42孵育50分钟，85孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。5. 逆转录产物可直接用于PCR和荧光定量PCR，或置于-20长期保存。荧光定量PCR实验材料：UltraSYBR Green Mixture，cDNA，actin Forward Primer、actin Reverse

30、 Primer实验仪器、耗材：荧光定量PCR仪、PCR管、1.5ml离心管、移液器、八连管离心机实验步骤：1. 模板稀释：注意：每稀释一个倍数，需要将溶液混匀，并短暂离心。编号模板稀释倍数水用量模板用量110倍90 l10 l （原液）2100倍90 l10 l（从1号管取）2. 配制PCR预混反应体系：做8个样本，配制10个样本的预混体系，配制方式如下：试剂配制10个样本的预混体系20 l反应体系2UltraSYBR Mixture 100 l10 lForward Primer，10 M4 l0.4 lReverse Primer，10 M4 l0.4 l人cDNA0 l2 lRNase-

31、Free Water72 l7.2 lTotal180203. 将配制的预混体系，分装到八连管中。共8个孔，每个孔中加入18 l的预混体系。4. 模板加入：每个孔中分别加入2 l模板，加样顺序如下：加样孔12345678样品原液原液稀释10倍稀释10倍稀释100倍稀释100倍水水加入体积2 l2 l2 l2 l2 l2 l2 l2 l5. 混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。6. 荧光定量PCR反应程序： 步骤温度时间预变性9510 min 变性9540个循环10 s退火/延伸 601 min融解曲线分析 注意事项：1首先配制预混体系，再将预混体系分装到八连管中。2. 稀释模板时，需要混

32、匀。3. 不要直接在八连管管壁或管盖上做标记！植物总蛋白提取实验材料： 植物样本、植物蛋白抽提试剂实验仪器、耗材：研钵、研钵棒、移液器、1.5ml离心管、4度离心机、天平、液氮注意：低温冰上操作实验前准备：1. 将蛋白酶抑制剂混合物加入植物蛋白抽提试剂中，按照1:99比例加入，使蛋白酶抑制剂混合物在抽提试剂中成1工作液。配制方法：990 l植物蛋白抽提试剂 + 10 l蛋白酶抑制剂混合物，冰上放置待用。2. 称取植物样本约100 mg。3. 在研磨植物材料前，先将液氮加入在研钵中以预冷研钵。实验步骤：1. 称量100 mg植物组织，用剪刀将样本剪碎，放入研钵，加入液氮充分研磨至粉末状。将粉末转

33、移到离心管中。2. 按照组织：抽提试剂=1：5（g/ml）的比例加入蛋白抽提试剂，100 mg植物组织加入500l蛋白抽提试剂。 涡旋混匀，冰上孵育30分钟，期间涡旋混匀3次。3. 4 12,000 rpm，离心20分钟。4. 将上清转移至新的离心管中。冰上放置，准备蛋白定量，或将提取的蛋白-20保存。蛋白定量实验材料：提取的植物蛋白、BCA定量试剂盒实验仪器、耗材：移液器、酶标仪/分光光度计、酶标条、酶标板、1.5ml离心管、PCR管实验步骤：1. 标准品稀释（按照下表进行标准品稀释）。2. 样品稀释：将提取的蛋白样品稀释3倍。（60 l ddH2O + 20 l蛋白样品）3. 配置BCA工

34、作液：根据标准品和样品的数量，将试剂A和试剂B以50：1的体积比混匀（6 ml A液+120 l B液）微孔法：1) 将25 l稀释好的样品与稀释好的标准品分别添加于96孔板的微孔中。2) 各孔中加入200 l BCA工作液，充分混匀。3) 盖上96孔板盖，37孵育30分钟。4) 冷却至室温。5) 用酶标仪测定562nm处的吸光值。6) 绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。试管法：1）将100 l稀释好的样品与稀释好的BSA标准品分别加到作好标记的试管中。 2）各试管中各加入2 ml BCA工作液，充分混匀。3）37水浴中孵育30分钟或室温孵育2小时。4）将各管冷却至室温。5）用分光光度计测定

35、562nm处的吸光值。6）绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。注意事项：标准品测定需在10min内完成，否则会影响蛋白定量的准确度。蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳）实验材料：SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水实验仪器、耗材：蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管配制溶液：l 配制10%APS溶液：-20度保存0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25m

36、l蒸馏水 l 配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10）20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水l 配制1 ml loading buffer：200 ul 5loading buffer +800 ul蒸馏水实验步骤：一制胶：1. 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。2. 根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。SDS-PAGE分离胶的浓度与最佳分离范围SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD 3. 配制10

37、%分离胶：将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。配制SDS-PAGE分离胶分离胶浓度凝胶体积所需各组分体积（单位：ml）双蒸水30%Acr-Bis(29:1)分离胶缓冲液（4）10%APSTEMED10%5ml2.081.671.250.050.00210ml4.173.332.50.10.00415ml6.255.03.750.150.00620ml8.36.750.20.0084. 待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟至1小时。5. 待分离

38、胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。6. 配制5%浓缩胶： 配制5%SDS-PAGE浓缩胶凝胶体积所需各组分体积（单位：ml）双蒸水30%Acr-Bis(29:1)浓缩胶缓冲液（4）10%APSTEMED2ml1.140.340.50.020.0024ml2.280.6810.040.0046ml3.421.021.50.060.0068ml4.561.362.00.080.0087. 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。注意：灌胶速度要快，防止凝胶。8. 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。9. 待凝胶聚合后，

39、小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。二 SDS-PAGE电泳:1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。2. 制备样品：1） 植物蛋白样品：根据植物蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。蛋白提取液 + 5上样缓冲液 + 蒸馏水制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。2） 全细胞裂解液： 可以直接上样，上样20l，约40ug。 3. 上样： K562全细胞裂解液上样顺序如下： 泳道12345678910样品1上样缓冲液Marker样品1样品2样品3样品4样品5样品6样品71上样缓冲液体积10l5 l20l20l20l20l20l20l20l10l4.

40、电泳：浓缩胶80V，约20分钟，分离胶100V，约1小时。四、 考马斯亮蓝染色 注：将提取的植物蛋白进行电泳，电泳后进行考马斯亮蓝染色。全细胞裂解液电泳后，进行western blot检测。1. 将电泳后的PAGE 胶取出放入容器中，加入适量蒸馏水（以充分覆盖PAGE 胶为 宜），加热至沸腾后5分钟，弃去蒸馏水；2. 加入适量考马斯亮蓝染色液（液面覆盖凝胶即可）加热至沸腾后5分钟，弃染色液；3. 加入适量蒸馏水，加热至沸腾后5分钟，弃蒸馏水，重复此步骤至背景清晰。 4. 观察拍照。Western Blot溶液配制：l 配制500 ml 1TBST溶液：50 ml TBST（ph8.3,10）+

41、 450 ml 蒸馏水l 配制100 ml 5%牛奶封闭液：4度保存5克脱脂奶粉+ 100 ml 1TBSTl 配制100 ml转膜缓冲液（甲醇）：CW0044 Tris-Glycine（ph8.3,10）10 ml Tris-Glycine + 20 ml 甲醇 + 70 ml 蒸馏水 （4度保存）一转膜及染色实验材料：NC膜、滤纸、转膜缓冲液、丽春红染色试剂实验仪器、耗材：转膜仪实验步骤：1. 电泳完成后，小心打开玻璃板，去除浓缩胶，将分离胶剥离后，放入转膜缓冲液中平衡。2. 用剪刀剪相同大小的NC膜及滤纸，放入转膜缓冲液中平衡。3. 转膜：（半干转）1） 将平衡好的3层滤纸平铺于转膜槽底

42、部。滴加转膜液润湿。2） 将胶平铺在滤纸上，赶平去气泡。3） 将平衡好的NC膜平铺在胶上，用玻璃棒赶平，确保膜与胶之间没有气泡。4） 再将3层滤纸平铺于膜上，赶平。5） 盖好转膜槽上盖，压紧。插上电极，50mA/膜，转膜1小时。转膜：（湿转）150mA/膜，转膜1.5小时4. 丽春红染色1） 将转移后的膜完全浸入丽春红染色液中，摇动3-5分钟。2） 蒸馏水漂洗膜2-3次，直至膜上出现清晰条带。3） 再次用蒸馏水漂洗，去除染料。 二封闭实验材料：5%脱脂奶 封闭液实验步骤：用封闭液将膜室温封闭1小时三抗体检测：检测-actin，分子量43KDa实验材料：5%脱脂奶封闭液、抗-actin鼠单克隆抗

43、体、山羊抗鼠IgG（H+L）HRP、TBST实验步骤：1. 在6 ml 5%的脱脂奶中加入2 l抗-actin鼠单克隆抗体（稀释度为1:3000）。2. 将膜浸入到一抗稀释液中，室温孵育1小时，或者4 孵育过夜。3. TBST漂洗7次，每次5分钟。4. 在10 ml 5%的脱脂奶中加入1 l山羊抗鼠IgG（H+L）HRP（稀释度为1:10000）。5. 将膜浸入到二抗稀释液中，室温孵育1小时。6. TBST漂洗7次，每次5分钟。四显影实验材料：DAB显色液实验步骤：1. 将试剂A和B以1:19的体积比混匀后即为DAB显色工作液。2. 将配制好的DAB工作液滴加到印迹膜上，孵育1-5分钟，显色。

44、3. 将膜放入蒸馏水中，终止反应。ELISA检测实验材料： 包被液、蛋白、一抗、二抗、封闭液、漂洗液PBST、显色液TMB、终止液、脱脂奶粉实验所需试剂，仪器及耗材：酶标仪，酶标板，酶标条，恒温箱或者水浴锅，待测样本。实验前准备：1. 将水浴锅或者恒温箱调整温度至37度。2. 配制1PBST：50 ml PBST+ 450 ml 蒸馏水3. 配制封闭液10%封闭液：10g脱脂奶粉+ 100 ml 1PBST实验步骤：1. 包被：用包被液将蛋白稀释到2g/ml，每孔加入100l，4度过夜，或37度孵育2小时。蛋白原始浓度：3.2mg/ml每组蛋白需要量：（100l122 g/ml）/3.2 mg

45、/ml=0.75 l将0.75ul蛋白溶液加入至1.2ml包被液中，混匀即可。以上溶液配制时，需要扩大样本体积。2. 漂洗：每孔加入300 l PBST，漂洗3遍。3. 封闭：加入10%脱脂奶粉200 l，4度过夜，或37度孵育2小时。4. 漂洗：每孔加入300 l PBST，漂洗3遍。5. 一抗反应：（一抗稀释液PBST）每孔加入一抗100 l，37度孵育30-45分钟。一抗需进行5个梯度的浓度稀释，每个梯度设置2个重复，设置空白对照2个。具体如下：编号123456789101112稀释度1:5万1:5万1:25万1:25万1:125万1:125万1:625万1:625万1:3125万1:3125万水水6. 漂洗：每孔加入300 l PBST，漂洗3遍。7. 二抗反应：（二抗稀释液10%脱脂奶粉PBST）每孔加入二抗100 l，37度孵育20分钟。8. 漂洗：每孔加入300 l PBST，漂洗5遍。9. 显色：加入100 l TMB工作液，37度孵育10分钟。10. 终止：加入50 l 终止液。11. 检测：将样品放入酶标仪中，在450nm处检测。