第十一章 荧光分析法.ppt2

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1、第十一章第十一章荧荧 光光 分分 析析 法法本章基本要求：理解分子荧光的基本原理；理解分子荧光的基本原理；理解分子荧光激发光谱、发射光谱的含义；理解分子荧光激发光谱、发射光谱的含义；掌握分子荧光发射光谱的特征；掌握分子荧光发射光谱的特征；了解荧光光谱仪的组成及部分作用；了解荧光光谱仪的组成及部分作用；掌握荧光分析法的主要应用范围。掌握荧光分析法的主要应用范围。第一节基本原理第一节基本原理一、分子荧光一、分子荧光一、分子荧光一、分子荧光分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程n n若分子的电子数是偶数，则分子中电子净的若分子的电子数是偶数，

2、则分子中电子净的若分子的电子数是偶数，则分子中电子净的若分子的电子数是偶数，则分子中电子净的自旋之和为自旋之和为自旋之和为自旋之和为S=0S=0，即基态分子的电子是自旋成对即基态分子的电子是自旋成对即基态分子的电子是自旋成对即基态分子的电子是自旋成对的。的。的。的。由分子多重性的定义有由分子多重性的定义有由分子多重性的定义有由分子多重性的定义有MM=2S+1=1,=2S+1=1,称之为单称之为单称之为单称之为单重态。重态。重态。重态。基态单重态以基态单重态以基态单重态以基态单重态以S S0 0表示，表示，表示，表示，S S1 1和和和和S S2 2则分别代表分则分别代表分则分别代表分则分别代表

3、分子的第一和第二激发单重态。子的第一和第二激发单重态。子的第一和第二激发单重态。子的第一和第二激发单重态。当分子处于激发态时，若分子的电子自旋与当分子处于激发态时，若分子的电子自旋与当分子处于激发态时，若分子的电子自旋与当分子处于激发态时，若分子的电子自旋与基态相同，仍然是单重态，即分子处于基态相同，仍然是单重态，即分子处于基态相同，仍然是单重态，即分子处于基态相同，仍然是单重态，即分子处于S S1 1和和和和S S2 2。n n 在激发态中，分子的某个电子也有可能改变自在激发态中，分子的某个电子也有可能改变自在激发态中，分子的某个电子也有可能改变自在激发态中，分子的某个电子也有可能改变自旋，

4、即自旋平行则旋，即自旋平行则旋，即自旋平行则旋，即自旋平行则S=1S=1，所以多重性所以多重性所以多重性所以多重性M=2S+1=3,M=2S+1=3,分子分子分子分子处于这样的激发态称为三重态，处于这样的激发态称为三重态，处于这样的激发态称为三重态，处于这样的激发态称为三重态，图中最低三重态以符号图中最低三重态以符号图中最低三重态以符号图中最低三重态以符号T T1 1表示，表示，表示，表示，T T2 2代表较高的激代表较高的激代表较高的激代表较高的激发三重态。发三重态。发三重态。发三重态。由于自旋平行比自旋配对的状态更稳定，故三重由于自旋平行比自旋配对的状态更稳定，故三重由于自旋平行比自旋配对

5、的状态更稳定，故三重由于自旋平行比自旋配对的状态更稳定，故三重态的能级比单重态的能量略低。态的能级比单重态的能量略低。态的能级比单重态的能量略低。态的能级比单重态的能量略低。每个电子能级都有多个振动能级，在同一个电子每个电子能级都有多个振动能级，在同一个电子每个电子能级都有多个振动能级，在同一个电子每个电子能级都有多个振动能级，在同一个电子能级中，最低的线代表该能级的振动基态。能级中，最低的线代表该能级的振动基态。能级中，最低的线代表该能级的振动基态。能级中，最低的线代表该能级的振动基态。吸收过程发生在吸收过程发生在吸收过程发生在吸收过程发生在1010-15-15s s左右的时间内。左右的时间

6、内。左右的时间内。左右的时间内。分子吸收和发射过程的分子吸收和发射过程的分子吸收和发射过程的分子吸收和发射过程的JablonskiJablonski能级能级能级能级能级图能级图能级图能级图S032103210T2S1321021043210S2T11234 吸收吸收 吸收吸收 荧光荧光 磷光磷光 分子的去激发过程分子的去激发过程分子的去激发过程分子的去激发过程 分子被激发到较高的能级后不稳定，将以不同分子被激发到较高的能级后不稳定，将以不同分子被激发到较高的能级后不稳定，将以不同分子被激发到较高的能级后不稳定，将以不同途径释放多余的能量回到基态，该过程为分子的去途径释放多余的能量回到基态，该过

7、程为分子的去途径释放多余的能量回到基态，该过程为分子的去途径释放多余的能量回到基态，该过程为分子的去激发过程。去激发包括下面几个可能的途径。激发过程。去激发包括下面几个可能的途径。激发过程。去激发包括下面几个可能的途径。激发过程。去激发包括下面几个可能的途径。振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫在凝聚相体系中，被激发到激发态的分子通过在凝聚相体系中，被激发到激发态的分子通过在凝聚相体系中，被激发到激发态的分子通过在凝聚相体系中，被激发到激发态的分子通过与溶剂分子的碰撞迅速以热的形式把多余的振动能与溶剂分子的碰撞迅速以热的形式把多余的振动能与溶剂分子的碰撞迅速以热的形式把多余的振动能与溶剂分子的碰撞

8、迅速以热的形式把多余的振动能量传递给周围的分子，而自身返回该电子能级的最量传递给周围的分子，而自身返回该电子能级的最量传递给周围的分子，而自身返回该电子能级的最量传递给周围的分子，而自身返回该电子能级的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。低振动能级，这一过程称为振动弛豫。低振动能级，这一过程称为振动弛豫。低振动能级，这一过程称为振动弛豫。振动弛豫过程发生大约为振动弛豫过程发生大约为振动弛豫过程发生大约为振动弛豫过程发生大约为1010-12-12s s。内部能量转换内部能量转换内部能量转换内部能量转换当当当当S S2 2的较低振动能级与的较低振动能级与的较低振动能级与的较低振动能级与S S1 1

9、的较高振动能级的的较高振动能级的的较高振动能级的的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从能量相当或重叠时，分子有可能从能量相当或重叠时，分子有可能从能量相当或重叠时，分子有可能从S S2 2的振动能级的振动能级的振动能级的振动能级以无辐射方式过渡到以无辐射方式过渡到以无辐射方式过渡到以无辐射方式过渡到S S1 1的能量相等的振动能级上的能量相等的振动能级上的能量相等的振动能级上的能量相等的振动能级上该过程为内部能量转换。该过程为内部能量转换。该过程为内部能量转换。该过程为内部能量转换。内转换发生的时间约为内转换发生的时间约为内转换发生的时间约为内转换发生的时间约为1010-12-12s

10、s。内转换过程同样也发生在激发三重态的电子能内转换过程同样也发生在激发三重态的电子能内转换过程同样也发生在激发三重态的电子能内转换过程同样也发生在激发三重态的电子能级间。级间。级间。级间。由于振动弛豫和内转换过程极为迅速由于振动弛豫和内转换过程极为迅速由于振动弛豫和内转换过程极为迅速由于振动弛豫和内转换过程极为迅速(10(10-12-12s),s),因此，激发后的分子很快回到第一激发单重态因此，激发后的分子很快回到第一激发单重态因此，激发后的分子很快回到第一激发单重态因此，激发后的分子很快回到第一激发单重态S S1 1的最低振动能级。所以高于第一激发态的荧光发的最低振动能级。所以高于第一激发态

11、的荧光发的最低振动能级。所以高于第一激发态的荧光发的最低振动能级。所以高于第一激发态的荧光发射十分少见射十分少见射十分少见射十分少见。荧光发射荧光发射荧光发射荧光发射 当分子处于第一激发单重态当分子处于第一激发单重态当分子处于第一激发单重态当分子处于第一激发单重态S S S S1 1 1 1的最低振动能的最低振动能的最低振动能的最低振动能级时，分子可能通过发射光子跃迁回到基态级时，分子可能通过发射光子跃迁回到基态级时，分子可能通过发射光子跃迁回到基态级时，分子可能通过发射光子跃迁回到基态S S S S0 0 0 0的的的的各振动能级上，这个过程称为荧光发射。各振动能级上，这个过程称为荧光发射。

12、各振动能级上，这个过程称为荧光发射。各振动能级上，这个过程称为荧光发射。荧光发射过程约为荧光发射过程约为荧光发射过程约为荧光发射过程约为10101010-8-8-8-8s.s.s.s.外部能量转换外部能量转换外部能量转换外部能量转换激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该外转换过程是荧光或磷光的竞

13、争过程，因该外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该过程发光强度减弱或消失，该现象称为过程发光强度减弱或消失，该现象称为过程发光强度减弱或消失，该现象称为过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭猝灭猝灭猝灭”或或或或“熄灭熄灭熄灭熄灭”。体系间跨越体系间跨越体系间跨越体系间跨越系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多

14、该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多重性发生变化的结果。重性发生变化的结果。重性发生变化的结果。重性发生变化的结果。当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几率增大。率增大。率增大。率增大。S S S S1 1 1 1TTTT1 1 1 1即是单重态到三重态的跃迁，即较低单即是单重态到三重态的跃迁，即较低单即是单重态到三重态的跃迁，即较低单即是单重态到三重态的跃迁，即较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠，这重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠，这重态振动能级与较

15、高的三重态振动能级重叠，这重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠，这种跃迁是种跃迁是种跃迁是种跃迁是“禁阻禁阻禁阻禁阻”跃迁。跃迁。跃迁。跃迁。磷光发射磷光发射磷光发射磷光发射 激发态分子经过系间跨越到达激发三重态激发态分子经过系间跨越到达激发三重态激发态分子经过系间跨越到达激发三重态激发态分子经过系间跨越到达激发三重态后，并迅速的以振动弛豫到达第一激发三重态后，并迅速的以振动弛豫到达第一激发三重态后，并迅速的以振动弛豫到达第一激发三重态后，并迅速的以振动弛豫到达第一激发三重态(T T T T1 1 1 1)的最低振动能级上，的最低振动能级上，的最低振动能级上，的最低振动能级上，第一激发三重态

16、第一激发三重态第一激发三重态第一激发三重态分子分子分子分子经发射光子返回基态。此过程称为磷光。经发射光子返回基态。此过程称为磷光。经发射光子返回基态。此过程称为磷光。经发射光子返回基态。此过程称为磷光。磷光发射是不同多重态之间的跃迁磷光发射是不同多重态之间的跃迁磷光发射是不同多重态之间的跃迁磷光发射是不同多重态之间的跃迁(T(T(T(T1 1 1 1 S S S S0 0 0 0)属于属于属于属于“禁阻禁阻禁阻禁阻”跃迁，因此磷光的寿命比荧光要跃迁，因此磷光的寿命比荧光要跃迁，因此磷光的寿命比荧光要跃迁，因此磷光的寿命比荧光要长长长长的多，约为的多，约为的多，约为的多，约为10101010-3

17、-3-3-3s s s s10s10s10s10s。所以，将激发光从磷所以，将激发光从磷所以，将激发光从磷所以，将激发光从磷光样品移走后，还常可观察到发光现象，而荧光样品移走后，还常可观察到发光现象，而荧光样品移走后，还常可观察到发光现象，而荧光样品移走后，还常可观察到发光现象，而荧光发射却观察不到该现象。光发射却观察不到该现象。光发射却观察不到该现象。光发射却观察不到该现象。二、荧光寿命和荧光效率二、荧光寿命和荧光效率荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要发光参数荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要发光参数荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要发光参数荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要发光参数荧光寿命

18、荧光寿命荧光寿命荧光寿命荧光寿命是当除去激发光源后，分子的荧光荧光寿命是当除去激发光源后，分子的荧光荧光寿命是当除去激发光源后，分子的荧光荧光寿命是当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的强度降低到最大荧光强度的强度降低到最大荧光强度的强度降低到最大荧光强度的1/e1/e所需的时间，常所需的时间，常所需的时间，常所需的时间，常用用用用 f f 表示。表示。表示。表示。当荧光物质受到一个极其短暂的光脉冲激发当荧光物质受到一个极其短暂的光脉冲激发当荧光物质受到一个极其短暂的光脉冲激发当荧光物质受到一个极其短暂的光脉冲激发后，荧光强度的变化可用下列公式表示：后，荧光强度的变化可用下列公式

19、表示：后，荧光强度的变化可用下列公式表示：后，荧光强度的变化可用下列公式表示：若若若若t t=f f,此时此时此时此时Ft Ft=（1/e1/e）F F0 0，则上式为：则上式为：则上式为：则上式为：则则则则K=K=1/1/f f，将其带入将其带入将其带入将其带入则得：则得：则得：则得：以以以以对对对对t t 作图，直线斜率即为：作图，直线斜率即为：作图，直线斜率即为：作图，直线斜率即为：1/1/f f ,由此计算荧光寿命。利用分子荧光寿命的差由此计算荧光寿命。利用分子荧光寿命的差由此计算荧光寿命。利用分子荧光寿命的差由此计算荧光寿命。利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光混合物的分析。别，可以

20、进行荧光混合物的分析。别，可以进行荧光混合物的分析。别，可以进行荧光混合物的分析。荧光效率荧光效率荧光效率荧光效率荧光效率也称荧光量子效率，是发射荧光的分子数与荧光效率也称荧光量子效率，是发射荧光的分子数与荧光效率也称荧光量子效率，是发射荧光的分子数与荧光效率也称荧光量子效率，是发射荧光的分子数与总的激发态分子数之比。也可定义为物质吸光后发射的总的激发态分子数之比。也可定义为物质吸光后发射的总的激发态分子数之比。也可定义为物质吸光后发射的总的激发态分子数之比。也可定义为物质吸光后发射的荧光的光子数与吸收的激发光的光子数之比。荧光的光子数与吸收的激发光的光子数之比。荧光的光子数与吸收的激发光的光

21、子数之比。荧光的光子数与吸收的激发光的光子数之比。荧光的去激发过程：荧光的去激发过程：荧光的去激发过程：荧光的去激发过程：发射荧光返回基态发射荧光返回基态发射荧光返回基态发射荧光返回基态(强的荧光物）强的荧光物）强的荧光物）强的荧光物）无辐射跃迁回到基态无辐射跃迁回到基态无辐射跃迁回到基态无辐射跃迁回到基态(低荧光物质低荧光物质低荧光物质低荧光物质)荧光效率与荧光发射过程的速率及无辐射过程的荧光效率与荧光发射过程的速率及无辐射过程的荧光效率与荧光发射过程的速率及无辐射过程的荧光效率与荧光发射过程的速率及无辐射过程的速率有关。速率有关。速率有关。速率有关。式中，式中，式中，式中，K K K Kf

22、 f f f是荧光发射过程速率常数，是荧光发射过程速率常数，是荧光发射过程速率常数，是荧光发射过程速率常数，K K K Ki i i i是系间是系间是系间是系间跨越和外转换等有关无辐射跃迁过程的速率常数总跨越和外转换等有关无辐射跃迁过程的速率常数总跨越和外转换等有关无辐射跃迁过程的速率常数总跨越和外转换等有关无辐射跃迁过程的速率常数总和。其中和。其中和。其中和。其中K K K Kf f f f主要取决于分子的化学结构，而主要取决于分子的化学结构，而主要取决于分子的化学结构，而主要取决于分子的化学结构，而K K K Ki i i i主要主要主要主要取决于化学环境。取决于化学环境。取决于化学环境。

23、取决于化学环境。化学环境能使体系的化学环境能使体系的化学环境能使体系的化学环境能使体系的K K K Kf f f f升高、升高、升高、升高、K K K Ki i i i降低，从而可使降低，从而可使降低，从而可使降低，从而可使体系的荧光增强；反之，则使体系的荧光减弱。体系的荧光增强；反之，则使体系的荧光减弱。体系的荧光增强；反之，则使体系的荧光减弱。体系的荧光增强；反之，则使体系的荧光减弱。三、荧光的激发光谱和发射光谱三、荧光的激发光谱和发射光谱任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激

24、发光谱和荧光光谱。发光谱和荧光光谱。发光谱和荧光光谱。发光谱和荧光光谱。荧光激发光谱荧光激发光谱荧光激发光谱荧光激发光谱激发光谱是通过固定发射波长，扫描激发波激发光谱是通过固定发射波长，扫描激发波激发光谱是通过固定发射波长，扫描激发波激发光谱是通过固定发射波长，扫描激发波长而获得的荧光强度长而获得的荧光强度长而获得的荧光强度长而获得的荧光强度(F)F)激发波长激发波长激发波长激发波长(exex)的关系的关系的关系的关系曲线。曲线。曲线。曲线。激发光谱反映了在某一固定的发射波长下，激发光谱反映了在某一固定的发射波长下，激发光谱反映了在某一固定的发射波长下，激发光谱反映了在某一固定的发射波长下，不

25、同激发波长激发的荧光的相对效率。不同激发波长激发的荧光的相对效率。不同激发波长激发的荧光的相对效率。不同激发波长激发的荧光的相对效率。激发光谱可以用于荧光物质的鉴别，并作为激发光谱可以用于荧光物质的鉴别，并作为激发光谱可以用于荧光物质的鉴别，并作为激发光谱可以用于荧光物质的鉴别，并作为进行荧光测定时供选择恰当的激发波长。进行荧光测定时供选择恰当的激发波长。进行荧光测定时供选择恰当的激发波长。进行荧光测定时供选择恰当的激发波长。荧光发射光谱荧光发射光谱荧光发射光谱荧光发射光谱通过固定激发波长，扫描发射通过固定激发波长，扫描发射通过固定激发波长，扫描发射通过固定激发波长，扫描发射(即荧光测定即荧光

26、测定即荧光测定即荧光测定)波长所获得的荧光强度波长所获得的荧光强度波长所获得的荧光强度波长所获得的荧光强度(F F)发射波长发射波长发射波长发射波长(emem)的关的关的关的关系的曲线为荧光发射曲线。系的曲线为荧光发射曲线。系的曲线为荧光发射曲线。系的曲线为荧光发射曲线。荧光光谱反映了在相同的激发条件下，不同荧光光谱反映了在相同的激发条件下，不同荧光光谱反映了在相同的激发条件下，不同荧光光谱反映了在相同的激发条件下，不同波长处分子的相对发射强度。波长处分子的相对发射强度。波长处分子的相对发射强度。波长处分子的相对发射强度。荧光光谱可用于荧光物质的鉴别，并作为荧荧光光谱可用于荧光物质的鉴别，并作

27、为荧荧光光谱可用于荧光物质的鉴别，并作为荧荧光光谱可用于荧光物质的鉴别，并作为荧光测定时选择恰当的测定波长或滤光片。光测定时选择恰当的测定波长或滤光片。光测定时选择恰当的测定波长或滤光片。光测定时选择恰当的测定波长或滤光片。同步荧光光谱同步荧光光谱同步荧光光谱同步荧光光谱19711971年年年年LloydLloyd提出用同步扫描技术来绘制光谱图。提出用同步扫描技术来绘制光谱图。提出用同步扫描技术来绘制光谱图。提出用同步扫描技术来绘制光谱图。该技术是在同时扫描激发和发射单色器波长的条件下，测该技术是在同时扫描激发和发射单色器波长的条件下，测该技术是在同时扫描激发和发射单色器波长的条件下，测该技术

28、是在同时扫描激发和发射单色器波长的条件下，测绘光谱图，所得到的荧光强度绘光谱图，所得到的荧光强度绘光谱图，所得到的荧光强度绘光谱图，所得到的荧光强度激发波长激发波长激发波长激发波长(或发射波长或发射波长或发射波长或发射波长)曲线曲线曲线曲线为同步荧光光谱。为同步荧光光谱。为同步荧光光谱。为同步荧光光谱。荧光信号荧光信号荧光信号荧光信号同步信号同步信号同步信号同步信号测定同步荧光光谱的三种方法：测定同步荧光光谱的三种方法：测定同步荧光光谱的三种方法：测定同步荧光光谱的三种方法：固定波长同步扫描法：在扫描过程中，激发固定波长同步扫描法：在扫描过程中，激发固定波长同步扫描法：在扫描过程中，激发固定波

29、长同步扫描法：在扫描过程中，激发波长和发射波长有一个固定的波长差，波长和发射波长有一个固定的波长差，波长和发射波长有一个固定的波长差，波长和发射波长有一个固定的波长差，即即即即=emem exex=常数常数常数常数固定能量同步扫描法：使发射单色器与激发固定能量同步扫描法：使发射单色器与激发固定能量同步扫描法：使发射单色器与激发固定能量同步扫描法：使发射单色器与激发单色器之间保持一个恒定的波数差，单色器之间保持一个恒定的波数差，单色器之间保持一个恒定的波数差，单色器之间保持一个恒定的波数差，即（即（即（即（1/1/exex 1/1/emem）10107 7=常数。常数。常数。常数。可变波长同步扫

30、描法：使两单色器在扫描过可变波长同步扫描法：使两单色器在扫描过可变波长同步扫描法：使两单色器在扫描过可变波长同步扫描法：使两单色器在扫描过程中以不同的速率同时进行扫描，即波长可变。程中以不同的速率同时进行扫描，即波长可变。程中以不同的速率同时进行扫描，即波长可变。程中以不同的速率同时进行扫描，即波长可变。同步荧光光谱的特点：同步荧光光谱的特点：同步荧光光谱的特点：同步荧光光谱的特点：使光谱简化；使光谱简化；使光谱简化；使光谱简化；使谱带窄化；使谱带窄化；使谱带窄化；使谱带窄化；减小光谱的重叠现象；减小光谱的重叠现象；减小光谱的重叠现象；减小光谱的重叠现象；减小散色光的影响。减小散色光的影响。减

31、小散色光的影响。减小散色光的影响。这种光谱提高了分析测定的选择性，避免这种光谱提高了分析测定的选择性，避免这种光谱提高了分析测定的选择性，避免这种光谱提高了分析测定的选择性，避免了其它谱带所引起的干扰。但对光谱学的研究了其它谱带所引起的干扰。但对光谱学的研究了其它谱带所引起的干扰。但对光谱学的研究了其它谱带所引起的干扰。但对光谱学的研究不利，因为它损失了其它光谱所含的信息。不利，因为它损失了其它光谱所含的信息。不利，因为它损失了其它光谱所含的信息。不利，因为它损失了其它光谱所含的信息。四、荧光光谱的特征四、荧光光谱的特征斯托克斯斯托克斯斯托克斯斯托克斯(Stokes)(Stokes)位移位移位

32、移位移在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收的吸收的吸收的吸收(或激发或激发或激发或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长光谱的波长长。荧光发射这种波长光谱的波长长。荧光发射这种波长光谱的波长长。荧光发射这种波长位移的现象称为位移的现象称为位移的现象称为位移的现象称为StokesStokes位移。位移。位移。位移。原因：原因：原因：原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫处于激发态的分子一方面由于振动弛豫处于激发态的分子一方面由于振动弛豫处于激发态的分子一方面由于振动弛

33、豫等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的位移。位移。位移。位移。StokesStokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生位移表明在荧光激发和发射之间所产生位移表明在荧光激发和发射之间所产生位移表明在荧光激发和发射之间所产生的能量损失。（见的能量损失。（见的能量损失。（见的能量损失。（

34、见P P220220图图图图11-311-3）镜像对称规则镜像对称规则 一般而言，分子的荧光发射光谱与其吸收光一般而言，分子的荧光发射光谱与其吸收光谱之间存在着镜像关系。（见谱之间存在着镜像关系。（见P220图图)镜像对称规则的产生是由于大多吸收光谱的镜像对称规则的产生是由于大多吸收光谱的形状表明了分子的第一激发态的振动能级结构，形状表明了分子的第一激发态的振动能级结构，而荧光发射光谱则表明了分子基态的振动能级结而荧光发射光谱则表明了分子基态的振动能级结构。一般情况下，分子的基态和第一激发单重态构。一般情况下，分子的基态和第一激发单重态的振动能级结构类似，因此吸收光谱的形状与荧的振动能级结构类

35、似，因此吸收光谱的形状与荧光发射光谱的形状呈镜像对称关系。光发射光谱的形状呈镜像对称关系。荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关 用不同波长的激发光激发荧光分子，可以观用不同波长的激发光激发荧光分子，可以观察到形状相同的荧光发射光谱。察到形状相同的荧光发射光谱。这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激发态的分子经振动弛豫及内转换等过态，处于激发态的分子经振动弛豫及内转换等过程后最终回到第一激发态的最低振动能级。而分程后最终回到第一激发态的最低振动能级。而分子的荧光发射总是从第一激发态的最低振动能级子的荧光发射总是从第一激发态的最低

36、振动能级跃迁到基态的各振动能级上。跃迁到基态的各振动能级上。五、影响荧光强度的因素五、影响荧光强度的因素 荧光是由具有荧光结构的物质吸收光后产生的，其发荧光是由具有荧光结构的物质吸收光后产生的，其发荧光是由具有荧光结构的物质吸收光后产生的，其发荧光是由具有荧光结构的物质吸收光后产生的，其发光强度与该物质分子的吸光作用及荧光效率有关，影响物光强度与该物质分子的吸光作用及荧光效率有关，影响物光强度与该物质分子的吸光作用及荧光效率有关，影响物光强度与该物质分子的吸光作用及荧光效率有关，影响物质荧光强度的因素主要有两个：质荧光强度的因素主要有两个：质荧光强度的因素主要有两个：质荧光强度的因素主要有两个

37、：分子结构分子结构分子结构分子结构一般具有强荧光的分子都具有大的共轭一般具有强荧光的分子都具有大的共轭一般具有强荧光的分子都具有大的共轭一般具有强荧光的分子都具有大的共轭键结构、供键结构、供键结构、供键结构、供电子取代基、刚性的平面结构等。分子中至少具有一个芳电子取代基、刚性的平面结构等。分子中至少具有一个芳电子取代基、刚性的平面结构等。分子中至少具有一个芳电子取代基、刚性的平面结构等。分子中至少具有一个芳环或具有多个共轭双键的有机化合物才容易发射荧光，而环或具有多个共轭双键的有机化合物才容易发射荧光，而环或具有多个共轭双键的有机化合物才容易发射荧光，而环或具有多个共轭双键的有机化合物才容易发

38、射荧光，而饱和的或只有孤立双键的化合物，不呈现显著的荧光。饱和的或只有孤立双键的化合物，不呈现显著的荧光。饱和的或只有孤立双键的化合物，不呈现显著的荧光。饱和的或只有孤立双键的化合物，不呈现显著的荧光。发光分子所处的环境发光分子所处的环境发光分子所处的环境发光分子所处的环境荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影响。因此适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的灵敏响。因此适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的灵敏响。因此适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的灵敏

39、响。因此适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的灵敏度和选择性。度和选择性。度和选择性。度和选择性。分子结构分子结构分子结构分子结构跃迁类型：跃迁类型：跃迁类型：跃迁类型：大多数荧光化合物多是由大多数荧光化合物多是由大多数荧光化合物多是由大多数荧光化合物多是由或或或或nnnn跃跃跃跃迁所致的激发态去活后，发生迁所致的激发态去活后，发生迁所致的激发态去活后，发生迁所致的激发态去活后，发生或或或或n n n n跃迁产生的。跃迁产生的。跃迁产生的。跃迁产生的。跃迁的量子效率高，是由于跃迁的量子效率高，是由于跃迁的量子效率高，是由于跃迁的量子效率高，是由于跃迁的摩尔吸光系数比跃迁的摩尔吸光系数比跃迁的摩

40、尔吸光系数比跃迁的摩尔吸光系数比nnnn跃迁大跃迁大跃迁大跃迁大1001001001001000100010001000倍倍倍倍,跃迁的寿命跃迁的寿命跃迁的寿命跃迁的寿命(10(10(10(10-7-7-7-7 10101010-9-9-9-9s)s)s)s)又比又比又比又比nnnn(10(10(10(10-5-5-5-5 10101010-7-7-7-7）跃迁寿命短，因此跃迁寿命短，因此跃迁寿命短，因此跃迁寿命短，因此K K K Kf f f f较大；其次，系间跨越较大；其次，系间跨越较大；其次，系间跨越较大；其次，系间跨越的速率常数小，有利于发射荧光。的速率常数小，有利于发射荧光。的速率常

41、数小，有利于发射荧光。的速率常数小，有利于发射荧光。共轭效应共轭效应共轭效应共轭效应含有含有含有含有跃迁能级的芳香族化合物的荧光最跃迁能级的芳香族化合物的荧光最跃迁能级的芳香族化合物的荧光最跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强，最有用。强，最有用。强，最有用。强，最有用。含脂肪族和脂环族羰基结构的化合物也会发射荧含脂肪族和脂环族羰基结构的化合物也会发射荧含脂肪族和脂环族羰基结构的化合物也会发射荧含脂肪族和脂环族羰基结构的化合物也会发射荧光，但这类化合物的数量比芳香族少。光，但这类化合物的数量比芳香族少。光，但这类化合物的数量比芳香族少。光，但这类化合物的数量比芳香族少。稠环化合物一般会产生荧光。稠

42、环化合物一般会产生荧光。稠环化合物一般会产生荧光。稠环化合物一般会产生荧光。最简单的杂环化合物（吡啶、呋喃、噻吩、吡最简单的杂环化合物（吡啶、呋喃、噻吩、吡最简单的杂环化合物（吡啶、呋喃、噻吩、吡最简单的杂环化合物（吡啶、呋喃、噻吩、吡咯）等不产生荧光。咯）等不产生荧光。咯）等不产生荧光。咯）等不产生荧光。当苯环被稠化至杂环核上时，吸收峰的摩尔吸光当苯环被稠化至杂环核上时，吸收峰的摩尔吸光当苯环被稠化至杂环核上时，吸收峰的摩尔吸光当苯环被稠化至杂环核上时，吸收峰的摩尔吸光系数增加，因此喹啉、吲哚等会产生荧光。系数增加，因此喹啉、吲哚等会产生荧光。系数增加，因此喹啉、吲哚等会产生荧光。系数增加，

43、因此喹啉、吲哚等会产生荧光。取代基效应取代基效应取代基效应取代基效应 苯环上的取代基会引起最大吸收波长的位移苯环上的取代基会引起最大吸收波长的位移苯环上的取代基会引起最大吸收波长的位移苯环上的取代基会引起最大吸收波长的位移及相应荧光峰的改变。及相应荧光峰的改变。及相应荧光峰的改变。及相应荧光峰的改变。给电子基团，使荧光增强。给电子基团，使荧光增强。给电子基团，使荧光增强。给电子基团，使荧光增强。如如如如:NHNHNHNH2 2 2 2,OH,OH,OH,OH,OCHOCHOCHOCH3 3 3 3,NHCHNHCHNHCHNHCH3 3 3 3和和和和 N(CHN(CHN(CHN(CH3 3

44、3 3)2 2 2 2等，等，等，等，吸电子基团，吸电子基团，吸电子基团，吸电子基团，使荧光减弱使荧光减弱使荧光减弱使荧光减弱 如如如如:ClClClCl,Br,Br,Br,Br,I,I,I,I,NHCOCHNHCOCHNHCOCHNHCOCH3 3 3 3,NONONONO2 2 2 2和和和和 COOHCOOHCOOHCOOH等，。等，。等，。等，。分子的刚性效应分子的刚性效应分子的刚性效应分子的刚性效应在同样长共轭分子中，分子的刚性越强，荧光效率在同样长共轭分子中，分子的刚性越强，荧光效率在同样长共轭分子中，分子的刚性越强，荧光效率在同样长共轭分子中，分子的刚性越强，荧光效率越大。越大。

45、越大。越大。本来不发生荧光或荧光较弱的物质与金属离子形成本来不发生荧光或荧光较弱的物质与金属离子形成本来不发生荧光或荧光较弱的物质与金属离子形成本来不发生荧光或荧光较弱的物质与金属离子形成配位化合物后，如果刚性共平面性增加，则可以产生配位化合物后，如果刚性共平面性增加，则可以产生配位化合物后，如果刚性共平面性增加，则可以产生配位化合物后，如果刚性共平面性增加，则可以产生荧光或增强荧光。荧光或增强荧光。荧光或增强荧光。荧光或增强荧光。如：如：如：如：8-8-8-8-羟基喹啉本身是弱荧光物质，与羟基喹啉本身是弱荧光物质，与羟基喹啉本身是弱荧光物质，与羟基喹啉本身是弱荧光物质，与MgMgMgMg2+

46、2+2+2+、AlAlAlAl3+3+3+3+形成形成形成形成配位化合物后，荧光增强。配位化合物后，荧光增强。配位化合物后，荧光增强。配位化合物后，荧光增强。顺反异构体的荧光性顺反异构体的荧光性顺反异构体的荧光性顺反异构体的荧光性联苯联苯联苯联苯芴芴芴芴=0.2=0.2=1.0=1.0环境因素环境因素荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析

47、的影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的灵敏度和选择性。灵敏度和选择性。灵敏度和选择性。灵敏度和选择性。溶剂效应溶剂效应溶剂效应溶剂效应溶剂的极性：溶剂的极性：溶剂的极性：溶剂的极性：溶剂的极性增大，溶剂的极性增大，溶剂的极性增大，溶剂的极性增大，跃迁的能量减小，红跃迁的能量减小，红跃迁的能量减小，红跃迁的能量减小，红移。移。移。移。溶剂的粘度溶剂的粘度溶剂的粘度溶剂的粘度溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐射跃迁几率增加，荧光减弱。射跃迁几率增加，荧光减弱。射跃迁

48、几率增加，荧光减弱。射跃迁几率增加，荧光减弱。温度的影响温度的影响温度的影响温度的影响由于当温度降低时，溶剂的粘度增大，溶剂由于当温度降低时，溶剂的粘度增大，溶剂由于当温度降低时，溶剂的粘度增大，溶剂由于当温度降低时，溶剂的粘度增大，溶剂的弛豫作用大大减小，荧光发射几率增加；当温的弛豫作用大大减小，荧光发射几率增加；当温的弛豫作用大大减小，荧光发射几率增加；当温的弛豫作用大大减小，荧光发射几率增加；当温度升高时，碰撞频率增加，外转换的去激发几率度升高时，碰撞频率增加，外转换的去激发几率度升高时，碰撞频率增加，外转换的去激发几率度升高时，碰撞频率增加，外转换的去激发几率增加，荧光发射几率变小。增

49、加，荧光发射几率变小。增加，荧光发射几率变小。增加，荧光发射几率变小。一般地，随温度降低，溶液中荧光效率和荧一般地，随温度降低，溶液中荧光效率和荧一般地，随温度降低，溶液中荧光效率和荧一般地，随温度降低，溶液中荧光效率和荧光强度将增大，并伴随光谱的蓝移。光强度将增大，并伴随光谱的蓝移。光强度将增大，并伴随光谱的蓝移。光强度将增大，并伴随光谱的蓝移。因此，选择低温条件进行荧光检测将有利于因此，选择低温条件进行荧光检测将有利于因此，选择低温条件进行荧光检测将有利于因此，选择低温条件进行荧光检测将有利于提高分析的灵敏度。提高分析的灵敏度。提高分析的灵敏度。提高分析的灵敏度。pHpHpHpH的影响的影

50、响的影响的影响对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言，对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言，对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言，对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言，溶液的溶液的溶液的溶液的pHpHpHpH将对这类物质的荧光强度产生较大的将对这类物质的荧光强度产生较大的将对这类物质的荧光强度产生较大的将对这类物质的荧光强度产生较大的影响。影响。影响。影响。如：在如：在如：在如：在pH7pH7pH7pH712121212的溶液中，苯胺以分子形式存的溶液中，苯胺以分子形式存的溶液中，苯胺以分子形式存的溶液中，苯胺以分子形式存在，产生蓝色荧光；在，产生蓝色荧光；在，产生蓝色荧光；在，产生蓝色荧光；当

51、当当当pHpHpHpH3 3 3 3、pHpHpHpH13131313时，苯胺以阳离子、时，苯胺以阳离子、时，苯胺以阳离子、时，苯胺以阳离子、阴离子形式存在，均无荧光。阴离子形式存在，均无荧光。阴离子形式存在，均无荧光。阴离子形式存在，均无荧光。溶液的溶液的溶液的溶液的pHpHpHpH也影响金属配合物的荧光性质。也影响金属配合物的荧光性质。也影响金属配合物的荧光性质。也影响金属配合物的荧光性质。荧光猝灭荧光猝灭荧光猝灭荧光猝灭 荧光猝灭：荧光猝灭：荧光猝灭：荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互荧光分子与溶剂或其它

52、溶质分子之间相互作用，使荧光强度减弱的作用。作用，使荧光强度减弱的作用。作用，使荧光强度减弱的作用。作用，使荧光强度减弱的作用。荧光猝灭剂：荧光猝灭剂：荧光猝灭剂：荧光猝灭剂：能引起荧光强度降低的物质。能引起荧光强度降低的物质。能引起荧光强度降低的物质。能引起荧光强度降低的物质。动态猝灭：被激发的荧光分子与猝灭剂发生碰撞，使荧动态猝灭：被激发的荧光分子与猝灭剂发生碰撞，使荧动态猝灭：被激发的荧光分子与猝灭剂发生碰撞，使荧动态猝灭：被激发的荧光分子与猝灭剂发生碰撞，使荧光分子以无辐射形式跃迁回到基态而使荧光猝灭。光分子以无辐射形式跃迁回到基态而使荧光猝灭。光分子以无辐射形式跃迁回到基态而使荧光猝

53、灭。光分子以无辐射形式跃迁回到基态而使荧光猝灭。静态猝灭：荧光分子与猝灭剂形成不发光的基态配合物静态猝灭：荧光分子与猝灭剂形成不发光的基态配合物静态猝灭：荧光分子与猝灭剂形成不发光的基态配合物静态猝灭：荧光分子与猝灭剂形成不发光的基态配合物从而使荧光猝灭。从而使荧光猝灭。从而使荧光猝灭。从而使荧光猝灭。氧是最常见的碰撞猝灭剂，因此在较严格的荧光实验室氧是最常见的碰撞猝灭剂，因此在较严格的荧光实验室氧是最常见的碰撞猝灭剂，因此在较严格的荧光实验室氧是最常见的碰撞猝灭剂，因此在较严格的荧光实验室中，需要除氧。中，需要除氧。中，需要除氧。中，需要除氧。利用荧光的这两种猝灭作用可以检测猝灭剂的浓度。利

54、用荧光的这两种猝灭作用可以检测猝灭剂的浓度。利用荧光的这两种猝灭作用可以检测猝灭剂的浓度。利用荧光的这两种猝灭作用可以检测猝灭剂的浓度。自猝灭：自猝灭：自猝灭：自猝灭：当荧光物质的浓度较大时，会产生当荧光物质的浓度较大时，会产生当荧光物质的浓度较大时，会产生当荧光物质的浓度较大时，会产生激发态的荧光分子与基态的荧光分子碰撞从而激发态的荧光分子与基态的荧光分子碰撞从而激发态的荧光分子与基态的荧光分子碰撞从而激发态的荧光分子与基态的荧光分子碰撞从而使荧光猝灭。使荧光猝灭。使荧光猝灭。使荧光猝灭。因此在荧光测量中，荧光物质的浓度不应太因此在荧光测量中，荧光物质的浓度不应太因此在荧光测量中，荧光物质的

55、浓度不应太因此在荧光测量中，荧光物质的浓度不应太大。大。大。大。当物质中存在能与荧光分子发生能量转移的当物质中存在能与荧光分子发生能量转移的当物质中存在能与荧光分子发生能量转移的当物质中存在能与荧光分子发生能量转移的物质时，有时也使体系的荧光强度下降。物质时，有时也使体系的荧光强度下降。物质时，有时也使体系的荧光强度下降。物质时，有时也使体系的荧光强度下降。内滤作用内滤作用内滤作用内滤作用 内滤作用：内滤作用：内滤作用：内滤作用：当溶液中存在能吸收荧光物质的当溶液中存在能吸收荧光物质的当溶液中存在能吸收荧光物质的当溶液中存在能吸收荧光物质的激发光或发射光的物质时，会使体系荧光减弱激发光或发射光

56、的物质时，会使体系荧光减弱激发光或发射光的物质时，会使体系荧光减弱激发光或发射光的物质时，会使体系荧光减弱的现象。的现象。的现象。的现象。散射光散射光散射光散射光 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光。选择适当的激发波长射光波长更长的拉曼光。选择适当的激发波长射光波长更长的拉曼光。选择适当的激发波长射光波长更长的拉曼光。选择适当的激发波长可消除此干扰。可消除此干扰。可消除此干扰。可消除此干扰。例：见书例：见书例：见书例：见书224224224224225225

57、225225页页页页第二节第二节荧光定量分析方法荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系I I I I0 0 0 0 I I I I F F F F在在在在ECl0.05ECl0.05ECl0.05ECl0.05时，时，时，时，F F F F=K K K K C,C,C,C,溶液的荧光强度与溶溶液的荧光强度与溶溶液的荧光强度与溶溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；液中荧光物质的浓度呈线性关系；液中荧光物质的浓度呈线性关系；液中荧光物质的浓度呈线性关系；在在在在EClEClEClECl0.050.

58、050.050.05，溶液的荧光强度与溶液中荧光物溶液的荧光强度与溶液中荧光物溶液的荧光强度与溶液中荧光物溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度不呈线性关系；质的浓度不呈线性关系；质的浓度不呈线性关系；质的浓度不呈线性关系；荧光分析法的测定灵敏度高。荧光分析法的测定灵敏度高。荧光分析法的测定灵敏度高。荧光分析法的测定灵敏度高。二、定量分析法二、定量分析法校正曲线法校正曲线法校正曲线法校正曲线法比例法比例法比例法比例法 联立方程式法联立方程式法联立方程式法联立方程式法 第三节第三节荧光分光光度计荧光分光光度计第四节第四节荧光分析新技术简介荧光分析新技术简介n n掌握内容：掌握内容：掌握内容：掌握内

59、容：分子荧光的发生过程；分子荧光的发生过程；分子荧光的发生过程；分子荧光的发生过程；激发光谱和发射光谱；激发光谱和发射光谱；激发光谱和发射光谱；激发光谱和发射光谱；激发光谱的特征；激发光谱的特征；激发光谱的特征；激发光谱的特征；影响荧光强度的内、外部因素。影响荧光强度的内、外部因素。影响荧光强度的内、外部因素。影响荧光强度的内、外部因素。n n熟悉内容：熟悉内容：熟悉内容：熟悉内容：分子从激发态返回基态的各种途径；分子从激发态返回基态的各种途径；分子从激发态返回基态的各种途径；分子从激发态返回基态的各种途径；荧光寿命与荧光效率；荧光寿命与荧光效率；荧光寿命与荧光效率；荧光寿命与荧光效率；荧光定

60、量分析法。荧光定量分析法。荧光定量分析法。荧光定量分析法。n n了解内容：了解内容：了解内容：了解内容：荧光分光光度计与荧光分析新技术。荧光分光光度计与荧光分析新技术。荧光分光光度计与荧光分析新技术。荧光分光光度计与荧光分析新技术。习题：习题：1.1.为什么荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高为什么荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高为什么荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高为什么荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高?2.2.分子处于受激态后，在去活化过程有哪些方式？分子处于受激态后，在去活化过程有哪些方式？分子处于受激态后，在去活化过程有哪些方式？分子处于受激态后，在去活化过程有哪些方式？分子荧光是如何发生的？分子荧光是如何发生的？分子荧光是如何发生的？分子荧光是如何发生的？3.3.荧光法测定硫酸奎宁时，激发光波长若选择在荧光法测定硫酸奎宁时，激发光波长若选择在320nm，拉曼光波长拉曼光波长360nm；若选在若选在350nm，拉曼拉曼光波长为光波长为400nm，荧光波长为荧光波长为448nm，则测定时选则测定时选择择激激发发光光波波长长应应为为nm，荧荧光光波波长长应应为为nm。