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1、第四章第四章 微生物细胞破碎微生物细胞破碎 微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物、细茵产生的碱性蛋白酶、霉菌产生小分子代谢物、细茵产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。但有些目的产物存在的糖化酶等，称为胞外产物。但有些目的产物存在于细胞内部、如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素于细胞内部、如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等，称为胞内产物。等，称为胞内产物。许多基因工程产品都是胞内产物。分离提取胞许多基因工程产品都是胞内产物。分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能
2、进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤。关键步骤。第四章 微生物细胞破碎 微生物代谢1第一节第一节 细胞壁的组成与结构细胞壁的组成与结构 细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的。物其细胞壁的结构特性是不同的。一、细菌细胞壁主要化学成分一、细菌细胞壁主要化学成分：肽聚糖；肽聚糖；主要阻力主要阻力肽聚糖的网状结构。肽聚糖的网状结构。二、酵母菌细胞壁主要化学成分二、酵母菌细胞壁主要化学成分：葡聚糖葡聚糖(30一一34)、甘露聚、甘露聚糖糖(30)、蛋白质蛋白质(6一
3、一8)和脂类；和脂类；主要阻力主要阻力壁结构交联的紧密程度和它的厚度。壁结构交联的紧密程度和它的厚度。三、霉菌细胞壁主要化学成分三、霉菌细胞壁主要化学成分：几丁质和葡聚糖；几丁质和葡聚糖；主要阻力主要阻力几丁质或纤维素的纤维状结构。几丁质或纤维素的纤维状结构。细胞壁结构与细胞破碎：细胞壁结构与细胞破碎：细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。第一节 细胞壁的组成与结构 2生物工程下游技术第4章-微生物细胞破碎ppt课件3生物工程下游技术第4章-微生物细胞破碎ppt课件4生物工程下游技术第4章-微生物细胞破碎ppt课件5几丁质结
4、构几丁质结构几丁质结构6生物工程下游技术第4章-微生物细胞破碎ppt课件7第二节第二节 常用破碎方法常用破碎方法 方法很多，按其是否使用外加作用力可分为机械方法很多，按其是否使用外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。法和非机械法两大类。机械法：机械法：有珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法等。在机械有珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法等。在机械破碎法中，由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，破碎法中，由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，在大多数情况下要采用冷却措施，以防止生物产品受热在大多数情况下要采用冷却措施，以防止生物产品受热破坏。破坏。非机械法：非机械法：有酶溶法、化学法、物理法和干燥法等，其
5、中有酶溶法、化学法、物理法和干燥法等，其中某些方法的应用受到限制。某些方法的应用受到限制。目前人们仍在探寻新的细胞破碎方法。目前人们仍在探寻新的细胞破碎方法。第二节 常用破碎方法 方法很多，按其是否使用外8一、珠磨法一、珠磨法一、珠磨法9珠磨法特点v破碎率较高v适合大规模细胞破碎v碎片较小，胞内物质释放完全v温度容易急剧上升，需要良好的降温配套设备v相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和藻类珠磨法特点破碎率较高10影响细胞破碎的因素影响细胞破碎的因素v搅拌速度（7001450r/min）v料液的循环速度（50500L/h）v细胞浓度（0.30.5g/mL）v珠粒大小和填充量（0.451mm；
6、7090)影响细胞破碎的因素搅拌速度（7001450r/min）11二、高压匀浆法二、高压匀浆法二、高压匀浆法12高压匀浆器高压匀浆器高压匀浆器13高压匀浆法特点v破碎率较高v适合大规模细胞破碎v碎片细小，胞内物质释放完全v适合格兰氏阳性菌和酵母的破碎，不适合霉菌合格兰氏阴性菌高压匀浆法特点破碎率较高14影响因素v操作压力（5070MPa）v细胞浓度（20）v温度v循环次数(25)影响因素操作压力（5070MPa）15生物工程下游技术第4章-微生物细胞破碎ppt课件16三、超声破碎法三、超声破碎法 超声破碎通常采用的超声破碎机在超声破碎通常采用的超声破碎机在1525kHz的频率的频率下操作。其
7、破碎机理尚未完全清楚，可能与空化现象引起下操作。其破碎机理尚未完全清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切作用有关。的冲击波和剪切作用有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。对不同菌种的发酵液超声破碎的效果差别较大。一般等因素有关。对不同菌种的发酵液超声破碎的效果差别较大。一般地，杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细菌细胞比革兰氏阳性细菌细地，杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细菌细胞比革兰氏阳性细菌细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。优点优点：操作简便，液量损失少，适合实验室规模。：
8、操作简便，液量损失少，适合实验室规模。缺点缺点：易引起温度的剧烈上升，在大规模操作中，声能传递：易引起温度的剧烈上升，在大规模操作中，声能传递和散热困难，产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物和散热困难，产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。质失活。三、超声破碎法 超声破碎通常采用17电声超声波发生器电声超声波发生器电声超声波发生器18四、酶溶法四、酶溶法 利用酶反应利用酶反应,分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。破壁的目的。1.外加酶法外加酶法:常用的溶酶有溶菌酶、常用的溶酶有溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶
9、、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等，而细胞壁溶解酶是几种酶的复合物。切酶、壳多糖酶等，而细胞壁溶解酶是几种酶的复合物。其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用较显著。其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用较显著。2.自溶法自溶法:影响自溶过程的主要因素有温度、时间、影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH、激、激活剂和细胞代谢途径等。微生物细胞的自溶法常采用加热活剂和细胞代谢途径等。微生物细胞的自溶法常采用加热法或干燥法。法或干燥法。四、酶溶法 利用酶反应,分解破坏细胞壁上的特19五、化学渗透法五、化学渗透法(1)表面活性物质表面活性物质
10、:可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。有助于细胞的破碎。(2)EDTA螯合剂螯合剂:革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离子离子Ca2+或或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将将Ca2+或或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。从而导致内层膜通透性的增强。(3)有机溶剂有机溶剂:能分解或溶解细胞壁中的类脂
11、。能分解或溶解细胞壁中的类脂。(4)变性剂变性剂:变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。五、化学渗透法(1)表面活性物质:可促使细胞某些组分溶解，20生物工程下游技术第4章-微生物细胞破碎ppt课件21化学渗透法有如下优缺点：化学渗透法有如下优缺点：优点优点：(1)对产物释放具有一定选择性。对产物释放具有一定选择性。(2)细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。离和进一步提取。缺点缺点：(1)通用性差，某种
12、试剂只能作用于某些特定类型的细胞。通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。(2)时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过 50。(3)有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中需有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中需设法分离除去。设法分离除去。化学渗透法有如下优缺点：优点：22生物工程下游技术第4章-微生物细胞破碎ppt课件23第三节第三节 破碎率的测定与破碎破碎率的测定与破碎 技术的研究方向技术的研究方向一、破碎率的测定一、破碎率的测定 1直接测定法直接测定法 2目的产物测定法目的产物测定法 3导电率测定法导电率测定法二、破碎技术的研究方向二、破碎技术的研究方向 1多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合 2与上游过程相结合与上游过程相结合 3与下游过程相结合与下游过程相结合第三节 破碎率的测定与破碎 技术的研究方向一、破碎24
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