蛋白质工程概述

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1、第 三 章蛋 白 质 工 程 概 述 蛋 白 质 工 程n 蛋 白 质 工 程 的 目 的 是 以 蛋 白 质 的 结 构 -功 能 研究 为 基 础 ， 运 用 基 因 工 程 技 术 定 向 改 造 天 然蛋 白 质 ， 或 设 计 创 造 全 新 蛋 白 质 ；n 蛋 白 质 工 程 常 被 称 为 第 二 代 基 因 工 程 ；n 1982年 ： 通 过 定 点 突 变 获 得 改 性 酪 氨 酸 tRNA合 成 酶 ；n 1983年 ： Science发 表 以 “ Protein engineering”为 题 的 专 论 。 生 物 技 术 制 药 基 因 工 程 与 蛋 白 质

2、 工 程 的 区 别 ：n 基 因 工 程 通 过 分 离 目 的 基 因 重 组 DNA分 子 ， 使 目 的基 因 更 换 宿 主 得 以 异 体 表 达 ， 从 而 创 造 新 类 型 ，但 这 只 能 合 成 自 然 界 固 有 的 蛋 白 质 。n 蛋 白 质 工 程 则 是 运 用 基 因 工 程 的 DNA重 组 技 术 ， 将克 隆 后 的 基 因 编 码 序 列 加 以 改 造 ， 或 者 人 工 合 成新 的 基 因 ， 再 将 上 述 基 因 通 过 载 体 引 入 适 宜 的 宿主 系 统 内 加 以 表 达 ， 从 而 产 生 数 量 几 乎 不 受 限 制 、有 特

3、 定 性 能 的 “ 突 变 型 ” 蛋 白 质 分 子 ， 甚 至 全 新的 蛋 白 质 分 子 。 蛋 白 质 工 程 药 物 发 展 三 个 阶 段 ：n 第 一 阶 段 ： 未 经 修 饰 的 天 然 蛋 白 质 被 开 发的 药 物 （ 胰 岛 素 、 促 红 细 胞 生 成 素 、 干 扰素 ）n 第 二 阶 段 ： 在 第 一 代 基 础 上 加 以 简 单 工 程技 术 修 饰 （ 促 红 细 胞 生 成 素 、 干 扰 素 ）n 第 三 阶 段 ： 优 化 药 物 的 生 物 学 活 性 和 理 化性 质 （ 一 级 结 构 的 处 理 、 化 学 修 饰 、 蛋 白质 翻

4、译 后 的 修 饰 及 融 合 蛋 白 的 应 用 ） 蛋 白 质 工 程 的 重 要 意 义 生 物 技 术 制 药n 为 蛋 白 质 结 构 -功 能 关 系 研 究 提 供 强 有 力 的 而 且 是不 可 替 代 的 手 段 。n 研 制 活 性 高 、 稳 定 性 好 和 毒 副 作 用 小 的 新 型 蛋 白类 药 物 ， 以 及 新 型 的 抗 生 素 、 定 向 免 疫 毒 素 和 工程 抗 体 。n 构 建 具 有 独 特 的 催 化 和 分 子 识 别 功 能 的 酶 制 剂 和生 物 传 感 器 。n 改 变 或 改 良 农 作 物 的 品 质 ， 设 计 生 产 新 型

5、 生 物 杀虫 剂 。 二 、 蛋 白 质 工 程 的 研 究 内 容蛋 白 质 工 程 4大 类 研 究 ： 1、 利 用 已 知 的 蛋 白 质 一 级 结 构 的 信 息 开 发 应 用 研 究 。 2、 定 量 确 定 蛋 白 质 结 构 -功 能 关 系 。 包 括 蛋 白 质 三 维 结 构模 型 的 建 立 ， 酶 催 化 性 质 、 蛋 白 质 折 叠 和 稳 定 性 研 究 、 蛋白 质 变 异 的 探 讨 等 。 3、 从 混 杂 变 异 体 库 中 筛 选 出 具 有 特 定 结 构 -功 能 关 系 的 蛋白 质 。 4、 根 据 已 知 结 构 -功 能 关 系 的

6、蛋 白 质 ， 用 人 工 方 法 合 成 它及 其 变 异 体 ， 完 全 人 为 控 制 蛋 白 质 的 性 质 。 蛋 白 质 工 程 技 术 在 新 药 研 究 中 应 用 ：n 提 高 药 效 活 性 （ TNF杀 伤 肿 瘤 细 胞 ）n 提 高 靶 向 性 （ 作 用 于 特 定 组 织 或 细 胞 ）n 降 低 蛋 白 质 类 药 物 引 起 的 免 疫 反 应 （ 人 源 化 重 组蛋 白 ）n 获 得 具 有 新 功 能 的 蛋 白 质 分 子 （ 不 同 功 能 的 部 分重 组 ）n 其 他 （ 提 高 药 物 稳 定 性 、 改 善 药 代 动 力 学 特 性 、使

7、之 易 于 生 产 纯 化 ， 减 低 成 本 ） 基 因DNA 氨 基 酸 序 列多 肽 链 蛋 白 质三 维 结 构 预 期 功 能生 物 功 能mRNA转 录 翻 译 折 叠DNA合 成 分 子 设 计 三 、 蛋 白 质 工 程 的 基 本 步 骤n 分 离 提 纯 目 标 蛋 白n 对 目 的 蛋 白 进 行 氨 基 酸 测 序n 借 助 核 磁 共 振 、 生 物 质 谱 获 得 蛋 白 质 的 二 级 和 三级 结 构n 设 计 编 码 蛋 白 质 的 基 因 改 造 方 案n 对 基 因 序 列 进 行 改 造 ， 并 将 经 过 改 造 的 基 因 片 段采 用 基 因 重

8、组 技 术 获 取 该 目 的 基 因 ， 表 达 新 蛋 白产 物n 分 离 提 纯 新 蛋 白 并 对 功 能 监 测 后 投 入 应 用 蛋 白 质 改 造 常 用 方 法 生 物 技 术 制 药n 理 性 方 法n 非 理 性 方 法 n随 机 广 泛 突 变n分 子 重 排n定 位 突 变n区 域 性 定 向 突 变n从 头 设 计 （ 一 ） 定 点 突 变 改 进 蛋 白 质生 物 技 术 制 药n 基 因 人 工 定 点 突 变 是 通 过 取 代 、 插 入 或 缺 失基 因 DNA序 列 中 任 一 特 定 的 核 苷 酸 序 列 来改 造 蛋 白 质 的 方 法 。n 前

9、 提 ： 已 知 蛋 白 质 分 子 的 结 构 和 功 能n 分 为 三 类 ： 核 苷 酸 引 物 诱 变 盒 式 诱 变 PCR诱 变 核 苷 酸 引 物 诱 变 以 化 学 合 成 的 含 有 突 变 核 苷 酸 的 核 苷 酸 短片 段 为 引 物 ， 对 单 链 DNA分 子 进 行 复 制 ，随 后 这 段 寡 核 苷 酸 引 物 便 成 了 新 合 成 的DNA子 链 的 一 个 组 成 部 分 ， 新 链 便 具 有 已发 生 突 变 的 核 苷 酸 序 列 。 盒 式 诱 变n 1985年 Wells提 出 的 一 种 基 因 修 饰 技 术 ， 一次 可 以 在 一 个

10、位 点 上 产 生 20种 不 同 氨 基 酸的 突 变 体 ， 可 以 对 蛋 白 质 分 子 中 重 要 氨 基酸 进 行 “ 饱 和 性 ” 分 析 。n 利 用 目 的 基 因 序 列 中 的 适 当 限 制 性 内 切 性酶 酶 切 位 点 ， 插 入 各 种 合 适 的 突 变 DNA片段 ， 用 以 取 代 目 标 基 因 中 特 定 的 DNA片 段 。 酶 切 割 蛋 白 基 因核 苷 酸 片 段新 突 变 质 粒同 时 获 得 多 个 突 变 体 PCR诱 变n 双 链 DNA变 性 94 oC， 1 minn 退 火 ， 引 物 结 合 54 oC， 45 sn 链 延

11、伸 72 oC， 2 min 生 物 技 术 制 药依 赖 高 保 真DNA高 温 聚合 酶 的 PCR直 接 点 突 变 （ 二 ） 采 用 融 合 蛋 白 技 术 改 进 蛋 白质 概 念 ： 是 由 一 条 短 的 原 核 多 肽 和 真 核 蛋 白结 合 在 一 起 所 形 成 的 蛋 白 质 ， 其 氨 基 端 是原 核 序 列 ， 羧 基 端 是 真 核 序 列 。 原 则 ： 将 一 个 蛋 白 质 基 因 序 列 的 终 止 密 码子 删 除 ， 在 接 上 带 有 密 码 子 的 第 二 个 蛋 白质 基 因 ， 可 实 现 2个 基 因 的 融 合 表 达 。 调 节 基

12、因 启 动 基 因 结 构 基 因连 接 酶完 整 基 因 融 合 蛋 白 技 术 的 内 容n （ 1） 进 行 目 的 基 因 的 克 隆 ， 根 据 基 因 测 序 列 互 补原 则 ， 设 计 合 理 的 引 物 序 列 ， 以 cDNA为 模 版 ， 利用 PCR技 术 扩 增 不 同 的 目 的 基 因 的 DNA片 段 ；n （ 2） 在 载 体 中 进 行 重 组 ， 通 过 限 制 性 内 切 酶 将 两个 DNA片 段 进 行 酶 切 并 回 收 ， 通 过 连 接 酶 将 两 个具 有 相 同 末 端 酶 切 点 的 基 因 片 段 进 行 体 外 连 接 ，并 克 隆

13、到 高 表 达 质 粒 载 体 中 ， 构 建 重 组 质 粒 。n (3)将 重 组 表 达 载 体 转 染 宿 主 细 胞 并 利 用 选 择 标 志进 行 筛 选 和 测 序 。 （ 4） 融 合 基 因 的 诱 导 表 达 及 蛋 白 质 的 纯 化 。 融 合 蛋 白 的 应 用 ：n 靶 向 药 物 ： （ 药 物 和 可 以 与 病 灶 特 异 结 合 的 配 基 ）将 这 两 者 融 合 ， 构 成 融 合 蛋 白 ， 它 可 以 特 异 性 地与 靶 细 胞 或 治 病 因 子 结 合 ， 并 把 药 物 引 导 至 病 灶 ，提 高 药 效 。n 构 建 多 功 能 新 细

14、 胞 因 子 ： 利 用 基 因 融 合 技 术 创 造出 自 然 界 原 本 不 存 在 的 活 性 更 佳 的 细 胞 因 子n 改 善 药 物 半 衰 期 （ 采 用 融 合 蛋 白 技 术 可 直 接 操 作分 子 大 小 的 方 法 是 蛋 白 质 自 身 共 价 结 合 ） ： 抗 血栓 的 水 蛭 素 （ 40倍 ） 其 他 2、 水 蛭 素 改 造 3、 生 长 激 素 改 造 4、 胰 岛 素 改 造 5、 致 癌 酶 的 改 造 6、 金 属 硫 蛋 白 的 改 造 7、 人 白 细 胞 介 素 -2的 改 造 8、 组 织 纤 溶 酶 原 激 活 因 子 的 改 造 9、 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 的 改 造