分支杆菌属细菌检验.ppt

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1、刘 垣 目 录v第 一 节 、 结 核 分 枝 杆 菌v第 二 节 、 麻 风 分 枝 杆 菌v第 三 节 、 非 典 型 分 枝 杆 菌 v分 枝 杆 菌 属 是 一 类 细 长 略 弯 曲 的 ， 有 分 枝 生 长 趋 势 的杆 菌 。v本 属 细 菌 的 主 要 特 点 是 细 胞 壁 含 有 大 量 脂 质 ， 因 此 不易 着 色 ， 若 经 加 热 或 延 长 染 色 时 间 而 着 色 后 能 抵 抗 3%（ 强 脱 色 剂 )盐 酸 乙 醇 的 脱 色 ， 故 又 称 抗 酸 杆 菌 。分 枝 杆 菌 属 共 性 缓 慢 生 长 菌 迅 速 生 长 菌 不 能 培 养 菌 麻

2、 风 分 枝 杆 菌龟 脓 肿 分 枝 杆 菌 群偶 发 分 枝 杆 菌 分枝杆菌属 结 核 分 枝 杆 菌牛 分 枝 杆 菌非 洲 分 枝 杆 菌坎 纳 分 枝 杆 菌田 鼠 分 枝 杆 菌卡 介 苗鸟 分 枝 杆 菌 复 合 群堪 萨 斯 分 枝 杆 菌戈 登 分 枝 杆 菌 非结核分枝杆菌结 核分 枝杆 菌复 合 群 迅 速 生 长 分 菌 （ Runyon IV群 ）光 产 色 菌 （ Runyon I群 ）暗 产 色 菌 （ Runyon II群 ）不 产 色 菌 （ Runyon III群 ） 分 枝 杆 菌 属 分 类 第 一 节 、 结 核 分 枝 杆 菌v核 分 枝 杆 菌

3、简 称 结 核 杆 菌 ， 是 引 起 结 核 病 的 病 原菌 。 对 人 致 病 的 主 要 有 人 型 、 牛 型 和 非 洲 型 分 支杆 菌 。 其 中 人 型 结 合 分 支 杆 菌 的 发 病 率 最 高 。 结核 分 枝 杆 菌 经 多 途 径 感 染 ， 侵 入 全 身 多 个 器 官 ，但 以 肺 结 核 为 最 多 见 。v结 核 分 枝 杆 菌 通 过 呼 吸 道 、 消 化 道 和 破 损 的 皮 肤粘 膜 进 入 机 体 ， 侵 犯 多 种 组 织 器 官 ， 引 起 相 应 器官 感 染 ， 其 中 以 肺 结 核 最 常 见 三 大 传 染 疾 病 全 球三 大

4、 传 染 疾 全 球 疾全 球 三 大 传 染 疾 病 爱 滋 病 （ AIDS）结 核 病 （ TB）疟 疾 （ Malaria）结 核 病 近 年 来 发 病 成 上 升 趋 势 ， 已 成 为 危 胁 人 类 健康 的 严 重 的 全 球 性 重 大 公 共 卫 生 问 题结 核 分 枝 杆 菌 复 合 群 中 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 发 病 率最 高 ， 约 占 90% 案 例 患 者 ， 女 ， 19岁 。 就 诊 时 主 诉 ： 近 一 个 多 月 来 咳 嗽 ，痰 中 带 有 血 丝 ， 无 胸 痛 ， 但 又 明 显 乏 力 ， 消 瘦 ， 食 欲 不 振， 自 觉

5、 午 后 微 热 ， 盗 汗 。 查 体 ： 体 温 38.2 ， 慢 性 病 容 。实 验 室 检 查 ： 白 细 胞 8x109/L， 血 沉 70mm/h。 X射 线 透 视 ：右 肺 尖 有 多 发 性 小 斑 片 状 阴 影 ， 边 缘 模 糊 。 去 清 晨 咳 痰 进行 抗 酸 染 色 ， 镜 下 可 见 红 色 略 长 微 弯 的 杆 菌 。请 问 ： 1.患 者 可 能 患 何 种 疾 病 ？ 引 起 本 病 的 病 原 体 是 什 么 ？ 2.应 做 哪 些 微 生 物 学 检 查 已 确 诊 ？ 知 识 链 接v结 核 病 至 今 仍 为 重 要 的 传 染 病 。 据

6、WHO报 道 ， 每 年约 有 800万 -1000万 新 病 例 发 生 ， 至 少 有 300万 人 死于 该 病 。 我 国 建 国 前 死 亡 率 达 200-300人 /10万 ，居 各 种 疾 病 死 亡 原 因 之 首 ， 建 国 后 人 民 生 活 水 平提 高 ， 卫 生 状 态 改 善 ， 特 别 是 开 展 了 群 防 群 治 ，儿 童 普 遍 接 种 卡 介 苗 ， 结 核 病 的 发 病 率 和 死 亡 率大 为 降 低 。 但 应 注 意 ， 世 界 上 有 些 地 区 因 艾 滋 病、 吸 毒 、 免 疫 抑 制 剂 的 应 用 、 酗 酒 和 贫 困 等 原 因

7、， 发 病 率 又 有 上 升 趋 势 。 一 、 生 物 学 特 性1.形 态 与 染 色 菌 体 细 长 略 弯 曲 ， 呈 单 、 分 支 状 、 束 状 、 索 状 排 列 的 杆 菌 。无 芽 胞 、 无 鞭 毛 、 有 荚 膜 。 革 兰 染 色 阳 性 ， 但 不 易 着 色 。 常用 萋 尼 抗 酸 染 色 后 菌 体 呈 红 色 。 萋 尼 氏 抗 酸 性 染 色 法染 色 ， 菌 体 染 成 红 色 荧 光 染 料 金 胺 O染 色 ， 在荧 光 下 菌 体 呈 橘 黄 色 2.培 养 特 性馋 :专 性 需 氧 ,营 养 要 求 高 （ L-J培 养 基 ）懒 :生 长

8、温 度 35 ,生 长 缓 慢 ,18小 时 繁 殖 一 代丑 :液 体 培 养 基 呈 粗 糙 皱 纹 状 菌 膜 生 长 ,固 体 培 养 基 上 形 成 形 似 菜 花 样 典 型 菌 落 3、 生 化 反 应 1） 生 化 反 应 不 活 泼 。 不 发 酵 糖 类 。2） 热 触 酶 试 验 对 区 别 结 核 分 枝 杆 菌 与 非 结 核 分 枝 杆 菌 有重 要 意 义 。 结 核 分 枝 杆 菌 大 多 数 触 酶 试 验 阳 性 ， 而 热 触 酶 试 验 阴性 ； 非 结 核 分 枝 杆 菌 则 大 多 数 两 种 试 验 均 阳 性 。3） 与 牛 分 枝 杆 菌 的

9、区 别 在 于 结 核 分 枝 杆 菌 可 合 成 烟 酸 和还 原 硝 酸 盐 ， 而 牛 分 枝 杆 菌 不 能 。 “ 三 耐 三 不 耐 ”对 某 些 理 化 因 子 的 抵 抗 力 较 强 ：v耐 干 燥v耐 酸 碱v耐 染 料v湿 热v紫 外 线v酒 精4.抵 抗 力 不 耐 受 典 型 形 态 多 形 性 R型 菌 落 S型 菌 落 有 毒 无 毒 （ 卡 介 苗 ） 抗 结 核 药 敏 感 耐 药5、 变 异 性卡 介 苗 ： 是 有 毒 力 的 牛 型 结 核 分 枝 杆 菌 在 甘 油 、胆 汁 和 马 铃 薯 的 培 养 基 中 经 13年 230次 传 代 而 获 得的

10、 减 毒 变 异 株 脂 质 ： 磷 脂 索 状 因 子 蜡 质 硫 酸 脑 苷 酯蛋 白 质荚 膜1、 致 病 物 质 尚 未 发 现 产 生 内 外 毒 素 及 侵 袭 性 酶 ，主 要 由 菌 体 成 分 导 致 的 炎 症 和 免 疫 损 伤 引 起 病 变主 要 致 病 物 质二 、 临 床 意 义 2.所 致 疾 病2、 所 致 疾 病 结 核 分 枝 杆 菌 通 过 呼 吸 道 、 消 化 道 和 破 损 的 皮 肤 粘膜 进 入 机 体 ， 侵 犯 多 种 组 织 器 官 ， 引 起 相 应 器 官 感 染 ，其 中 以 肺 结 核 最 常 见 。 结 核 分 支 杆 菌 可

11、经 淋 巴 -血 液 播 散 ， 引 起 脑 结 核 、 肾结 核 、 结 核 性 胸 膜 炎 等 3.免 疫 性 抗 体 无 保 护 作 用 ， 临 床 辅 助 诊 断 有 意 义 。 细 胞 免 疫 发挥 重 要 抗 感 染 作 用 TB菌 的 感 染 率 很 高 ， 发 病 率 却 较 低 。 抗 结 核 的 免 疫 称为 有 菌 免 疫 ， 菌 体 及 其 成 分 消 失 ， 免 疫 力 也 随 之 消 失 4、 结 核 菌 素 试 验v结 核 菌 素 即 结 核 杆 菌 蛋 白 质 ， 目 前 常 用 结 核 菌 素 制 剂 是 纯蛋 白 衍 生 物 （ PPD）v1） 原 理 ：

12、结 核 菌 素 试 验 是 应 用 结 核 菌 素 进 行 皮 肤 试 验 来测 定 机 体 对 结 核 分 枝 杆 菌 是 否 能 引 起 超 敏 反 应 的 一 种 试 验v2） 试 验 方 法 与 意 义 ： 受 试 者 前 臂 掌 侧 皮 内 注 射 PPD5U， 48 72h后 ， 观 察 结 果 。 v3） 结 果 及 意 义 ： 红 肿 硬 结 超 过 5mm者 为 阳 性 ， 15mm为 强阳 性 ， 对 临 床 诊 断 有 意 义 。 若 PPD-C侧 红 肿 大 于 BCG-PPD侧为 感 染 。 反 之 ， BCG-PPD侧 大 于 PPD-C侧 ， 可 能 系 卡 介

13、苗 接种 所 致 。v4） 用 途 ： 选 择 卡 介 苗 的 接 种 对 象 和 测 定 接 种 效 果 ； 辅 助 诊 断 婴 幼 儿 结 核 病 ； 在 流 行 病 学 中 ， 作 为 调 查 人 群感 染 结 核 杆 菌 的 一 个 指 标 ； 测 定 肿 瘤 患 者 的 细 胞 免 疫 功能 。 结 核 菌 素 试 验v 纯 蛋 白 衍 生 物 (PPD)， 是 用 三 氯 醋 酸 沉 淀 结 核 分 枝 杆 菌 培 养滤 液 后 的 纯 化 物 。 注 入 皮 内 后 如 受 试 者 已 感 染 结 核 ， 则 结 核菌 素 与 致 敏 淋 巴 细 胞 特 异 性 结 合 ， 形

14、成 迟 发 型 超 敏 反 应 性 炎症 根 据 注 射 部 位 是 否 出 现 红 肿 判 断 结 果 5mm为 阴 性 5mm为 阳 性48小 时 后 三 、 微 生 物 检 查1、 标 本 采 集 ： 根 据 病 变 部 位 不 同 采 集 不 同 的 标 本 。 常 见 标 本 为痰 、 尿 、 胸 腹 水 等 。 1） 痰 ： 留 取 清 晨 第 一 口 痰 3-5ml。 合 格 的 痰 标 本 应 使 患 者 深吸 气 后 ， 由 肺 部 深 处 一 干 咳 痰 、 血 痰 或 黏 液 痰 为 合 格 标 本 。用 WHO推 荐 的 国 际 通 用 螺 旋 盖 痰 瓶 ， 或 用

15、密 封 塑 料 盒 、 蜡 纸 盒收 集 后 送 检 。 2） 其 他 ： 无 菌 抽 取 脑 脊 液 、 胸 水 、 腹 水 及 关 节 液 等 盛 无 菌 试 管 送 检 。 脑 脊 液 标 本 静 置 后 ， 表 面 可 有 细 薄 凝 块 ， 取 凝 块 作涂 片 或 接 种 培 养 临 床 标 本 涂 片 检 查 分 离 培 养 HPLC 分 子 鉴 定 免 疫 学 鉴 定直 接 涂 片 集 菌 涂 片 处 理 标 本 或 无 污 染 标 本 染 色 液 体 培 养 基 固 体 培 养 基 动 物 试 验 （ L-J培 养 基 ）抗 酸 . 金 胺 O. 35 涂 片 镜 检 仪 器

16、 培 养 7天 生 长 7天 生 长 快 速 生 长 菌 慢 生 长 菌 初 步 鉴 定 抗 酸 染 色 菌 落 特 点 鉴 定 试 验 药 敏 试 验 2、 检 验 程 序 3、 检 验 方 法（ 1） 抗 酸 染 色 镜 检1） 直 接 涂 片 薄 涂 片 ： 0.01ml， 10mmX10mm, 厚 涂 片 ：0.1ml， 20mmX15mm2） 集 菌 涂 片 ： 将 标 本 浓 集 后 再 涂 片 ， 提 高 阳 性 检 出 率 沉 淀集 菌 法 ； 漂 浮 集 菌 法（ 2） 荧 光 染 色 镜 检 ： 用 金 胺 O染 色 ， 在 暗 背 景 下 ， 抗 酸 杆 菌发 出 荧 光

17、 （ 优 点 ： 简 便 、 快 速 、 视 野 覆 盖 面 大 和 阳 性 率 检 出高 ） 结 核 分 枝 杆 菌 痰 涂 片 抗 酸 染 色（ 1000） （ 3） 分 离 培 养1） 培 养 基 选 择 ： 通 常 使 用 的 固 体 培 养 基 有 改 良 罗 氏 （ L-J）培 养 基 、 小 川 培 养 基 、 米 氏 7H10和 7H11， 液 体 培 养 基 有 米氏 7H9和 苏 通 氏 培 养 基 。2） 标 本 的 前 处 理 ： 前 处 理 的 目 的 ： 一 是 杀 死 杂 菌 ， 二 是 液化 标 本 。 常 见 的 方 法 ： 40g/LNaOH法 ： 1份 痰

18、 +2份 40g/LNaOH溶 液 ， 35 水 浴 消 化15-30分 钟 ， 震 荡 2-3次 ， 3000r/min离 心 15min， 弃 上 清 ，沉 淀 物 接 种 4%H 2SO4法 ： 多 用 于 尿 标 本 的 前 处 理 ， 1份 标 本 +2-4倍4%H2SO4， 室 温 20min， 震 荡 2-3次 ， 3000r/min离 心 15min，弃 上 清 ， 沉 淀 物 接 种 胰 酶 -苯 扎 溴 铵 法 3） 接 种 与 培 养取 碱 处 理 过 的 标 本 ， 接 种 于 酸 性 罗 氏 培 养 基 斜 面 上酸 处 理 过 的 标 本 则 接 种 在 改 良 罗

19、 氏 培 养 基 斜 面 上4） 结 果 ： 3天 内 有 菌 落 生 长 ， 可 报 告 非 分 枝 杆 菌 生 长 。 7天 内 发 现 菌 落 生 长 者 ， 经 过 抗 酸 染 色 证 实 后 可 报 告 快 速生 长 抗 酸 杆 菌 。 7天 以 后 发 现 菌 落 生 长 者 ， 经 过 抗 酸 染 色证 实 后 可 报 告 抗 酸 杆 菌 生 长 。 满 8周 后 仍 未 见 菌 落 生 长 者 可 报 告 培 养 阴 性 。（ 4） 鉴 定 ： 依 据 生 化 反 应 鉴 定（ 5） 动 物 实 验（ 6） 其 他 诊 断 技 术 抗 酸 染 色 （ 1000） 结 果 报 告

20、 0 300视 野 1 2条 300视 野 1 9条 /100视 野 2 1 9条 /10视 野 3 1 9条 /每 个 视 野 4 9/每 个 视 野 第 二 节 、 麻 风 分 枝 杆 菌麻 风 分 枝 杆 菌 是 麻 风 病 的 病 原 菌 。麻 风 是 一 种 慢 性 传 染 病 。主 要 表 现 为 皮 肤 、 粘 膜 和 神 经 末 梢 的 损 害 。晚 期 可 侵 犯 深 部 组 织 和 器 官 ， 形 成 肉 芽 肿 1、 形 态 与 染 色 较 结 核 杆 菌 粗 而 短 ， 抗 酸 染 色 阳 性 ， 呈 束状 或 团 状 排 列 ， 革 兰 阳 性 ， 无 鞭 毛 、 荚

21、 膜 和 芽 胞 。 典 型 细 胞内 寄 生 菌 ， 可 形 成 麻 风 细 胞 （ 即 有 麻 风 杆 菌 存 在 、 呈 泡 沫 状的 细 胞 ）2、 培 养 特 性 ： 目 前 不 能 人 工 培 养 ， 可 用 动 物 犰 狳 （ qiu yu）接 种 建 立 模 型 。一 、 生 物 学 特 性 二 、 临 床 意 义v传 染 源 ： 麻 风 患 者v传 播 途 径 ： 直 接 接 触 、 飞 沫 传 播v易 感 人 群 ： 多 为 免 疫 缺 陷 个 体3种 临 床 类 型 :1)瘤 型 麻 风 ： 传 染 性 强 且 病 情 严 重 ， 细 胞 免 疫 功能 缺 陷 而 体 液

22、 免 疫 正 常 。 在 皮 肤 和 黏 膜 下 形 成 结 节 性 红 斑 ，称 为 麻 风 结 节 。 面 部 结 节 融 合 可 呈 “ 狮 面 ” 状 。 2） 结 核 样 型 麻 风 3） 界 线 类 综 合 征 v根 据 临 床 表 现 、 免 疫 病 理 变 化 和 细 菌 检 查 结 果 等 将 麻 风 分为 瘤 型 、 结 核 样 型 、 界 线 综 合 征 两 种 病 型结 核 样 型 麻 风 患 者 手 部 病 变 体 征 第 三 节 、 非 典 型 分 支 杆 菌非 典 型 分 枝 杆 菌 分 为 光 产 色 菌 （ I群 ） 、 暗 产 色 菌 （ II群 ）、 不

23、产 色 菌 （ III群 ） 和 速 生 菌 （ IV群 ） 4群 。 广 泛 分 布 在自 然 界 ， 致 病 性 较 弱 ， 可 寄 居 与 人 体 。 当 机 体 抵 抗 力 低 下时 ， 可 导 致 肺 内 、 外 或 淋 巴 结 类 似 结 核 的 病 变 。 特 点 结 核 分 枝 杆 菌 非 典 型 分 支 杆 菌菌 落 特 征 粗 糙 、 颗 粒 状 光 滑 或 粗 糙菌 落 颜 色 乳 白 色 或 米 白 色 黄 色 或 橘 黄 色耐 热 触 酶 试 验 - +中 性 红 试 验 + -索 状 因 子 + +/- 豚 鼠 致 病 性 + - 本 章 小 结 分 枝 杆 菌 属

24、 的 细 菌 因 其 细 胞 壁 富 含 脂 质 ， 经 加 温 或 延 迟 染 色 时 间后 能 抵 抗 一 定 浓 度 盐 酸 乙 醇 的 脱 色 作 用 ， 故 称 抗 酸 杆 菌 。 该 属 细 菌 培养 时 专 性 需 氧 ， 营 养 要 求 特 殊 ， 大 多 数 生 长 缓 慢 ， 其 中 的 麻 风 分 枝 杆菌 目 前 尚 不 能 人 工 培 养 。 该 属 细 菌 中 临 床 最 常 见 的 是 结 核 分 枝 杆 菌 ，该 菌 经 萋 尼 抗 酸 染 色 后 呈 红 色 ， 用 荧 光 染 料 金 胺 O染 色 后 ， 在 荧 光显 微 镜 下 菌 体 发 出 黄 绿 色

25、 荧 光 。 结 核 分 枝 杆 菌 常 用 罗 琴 培 养 基 进 行培 养 ， 该 菌 在 罗 琴 培 养 基 上 生 长 缓 慢 ， 一 般 2 4周 才 能 形 成 肉 眼 可见 菌 落 ， 菌 落 外 观 类 似 “ 菜 花 样 ” ； 在 液 体 培 养 基 中 生 长 较 为 迅 速 ，一 般 1 2周 即 可 生 长 ， 常 形 成 表 面 菌 膜 ， 有 毒 力 菌 株 可 呈 束 状 生 长 结 核 分 枝 杆 菌 典 型 生 化 特 征 表 现 为 烟 酸 累 积 试 验 阳 性 、 还 原 硝 酸盐 为 亚 硝 酸 盐 、 触 酶 阳 性 。 该 菌 不 被 T2H抑

26、制 、 吡 嗪 酰 胺 酶 阳 性 ， 而牛 结 核 分 枝 杆 菌 正 好 相 反 。 结 核 分 枝 杆 菌 易 发 生 变 异 ， 卡 介 苗 是 其 减毒 活 疫 苗 。 该 菌 对 理 化 因 素 有 较 强 抵 抗 力 ， 耐 干 燥 、 耐 一 定 浓 度 酸 碱和 孔 雀 绿 或 结 晶 紫 等 染 料 ， 但 对 乙 醇 、 紫 外 线 、 湿 热 等 敏 感 。 该 菌 是结 核 病 的 病 原 体 ， 可 侵 犯 全 身 各 个 器 官 ， 但 以 肺 结 核 最 为 多 见 。 其 致病 物 质 主 要 与 其 菌 体 成 分 如 荚 膜 、 脂 质 和 蛋 白 质 等

27、 有 关 ， 结 核 的 免 疫属 于 有 菌 免 疫 ， 结 核 菌 素 试 验 通 过 检 测 机 体 对 结 核 菌 素 有 无 迟 发 型 超敏 反 应 ， 从 而 了 解 机 体 是 否 有 过 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 ， 或 对 结 核 分 枝 杆菌 是 否 具 有 免 疫 力 结 核 分 枝 杆 菌 的 实 验 室 检 查 主 要 包 括 临 床 标 本 涂 片 抗 酸 染 色后 直 接 显 微 镜 检 查 和 分 离 培 养 鉴 定 两 大 类 ， 免 疫 学 方 法 如 结 核 菌素 试 验 、 抗 原 、 抗 体 检 测 等 也 可 辅 助 该 菌 的 临 床 诊

28、断 ， PCR技 术可 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 DNA的 快 速 检 测 非 结 核 分 枝 杆 菌 主 要 包 括 不 产 色 菌 、 暗 产 色 菌 和 光 产 色 菌 三大 类 ， 前 两 者 均 包 含 快 生 长 菌 群 和 慢 生 长 菌 群 ， 而 后 者 均 为 慢 生长 菌 群 。 这 类 抗 酸 菌 作 为 条 件 致 病 菌 常 引 起 有 潜 在 肺 部 疾 病 、 免疫 抑 制 或 缺 陷 （ 如 艾 滋 病 ） 等 患 者 的 感 染 。 麻 风 分 枝 杆 菌 形 态 和染 色 性 与 结 核 分 枝 杆 菌 类 似 ， 但 不 能 进 行 人 工 培 养 ， 是 典 型 细 胞内 寄 生 菌 ， 主 要 引 起 慢 性 传 染 病 麻 风