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1、 实验九、实验九、实验九、实验九、细胞骨架的显示和观察细胞骨架的显示和观察细胞骨架的显示和观察细胞骨架的显示和观察目的要求目的要求目的要求目的要求1 1 1 1、掌握细胞骨架显示的原理。、掌握细胞骨架显示的原理。、掌握细胞骨架显示的原理。、掌握细胞骨架显示的原理。2 2 2 2、熟悉细胞骨架显示的方法。、熟悉细胞骨架显示的方法。、熟悉细胞骨架显示的方法。、熟悉细胞骨架显示的方法。实验用品实验用品实验用品实验用品 光学显微镜、恒温水浴锅、小烧杯、载玻片、光学显微镜、恒温水浴锅、小烧杯、载玻片、光学显微镜、恒温水浴锅、小烧杯、载玻片、光学显微镜、恒温水浴锅、小烧杯、载玻片、PBSPBSPBSPBS
2、液、液、液、液、1%1%1%1%的的的的TritonX-100TritonX-100TritonX-100TritonX-100、0.2%0.2%0.2%0.2%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250R250R250、M M M M缓冲液、缓冲液、缓冲液、缓冲液、3%3%3%3%的戊二醛、洋葱的戊二醛、洋葱的戊二醛、洋葱的戊二醛、洋葱实验原理实验原理实验原理实验原理 细胞骨架（细胞骨架（细胞骨架（细胞骨架（cytoskeletoncytoskeletoncytoskeletoncytoskeleton）是指细胞质中纵横交）是指细胞质中纵横交）是指细胞质中纵横交）是指细
3、胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成和形态结构的不同分为错的纤维网络结构，按组成和形态结构的不同分为错的纤维网络结构，按组成和形态结构的不同分为错的纤维网络结构，按组成和形态结构的不同分为微微微微管（管（管（管（microtubulemicrotubulemicrotubulemicrotubule，MTMTMTMT）、微丝（）、微丝（）、微丝（）、微丝（microfilamentmicrofilamentmicrofilamentmicrofilament，MFMFMFMF）、中间纤维（）、中间纤维（）、中间纤维（）、中间纤维（intermediatefilamentintermediate
4、filamentintermediatefilamentintermediatefilament，IFIFIFIF）。它。它。它。它们对细胞的形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、们对细胞的形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、们对细胞的形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、们对细胞的形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质的运输等起重要作用。观察和研究细胞骨分化和物质的运输等起重要作用。观察和研究细胞骨分化和物质的运输等起重要作用。观察和研究细胞骨分化和物质的运输等起重要作用。观察和研究细胞骨架可用光镜、电镜、间接免疫荧光技术、细胞化学技架可用光镜、电镜、间接免疫荧光技术、细胞化学技架可用光
5、镜、电镜、间接免疫荧光技术、细胞化学技架可用光镜、电镜、间接免疫荧光技术、细胞化学技术等方法。对光镜下细胞骨架的形态学观察多用术等方法。对光镜下细胞骨架的形态学观察多用术等方法。对光镜下细胞骨架的形态学观察多用术等方法。对光镜下细胞骨架的形态学观察多用1%1%1%1%的的的的TritonX-100TritonX-100TritonX-100TritonX-100（聚乙二醇辛基苯醚）处理细胞，使（聚乙二醇辛基苯醚）处理细胞，使（聚乙二醇辛基苯醚）处理细胞，使（聚乙二醇辛基苯醚）处理细胞，使95%95%95%95%以上的可溶性蛋白质以及全部脂质被抽提，再以蛋白以上的可溶性蛋白质以及全部脂质被抽提，
6、再以蛋白以上的可溶性蛋白质以及全部脂质被抽提，再以蛋白以上的可溶性蛋白质以及全部脂质被抽提，再以蛋白质染料考马斯亮蓝质染料考马斯亮蓝质染料考马斯亮蓝质染料考马斯亮蓝R250R250R250R250染色，使细胞内细胞骨架得以染色，使细胞内细胞骨架得以染色，使细胞内细胞骨架得以染色，使细胞内细胞骨架得以清晰显现。清晰显现。清晰显现。清晰显现。实验内容和方法实验内容和方法实验内容和方法实验内容和方法1 1、取材：撕取小块洋葱鳞茎、取材：撕取小块洋葱鳞茎内皮内皮(约约1cm1cm2 2大小若干片大小若干片)，浸于，浸于6 6 mmolmmol/L/L PBSPBS中，使其下沉，处理中，使其下沉，处理5
7、-10min5-10min。2 2、抽提：吸去、抽提：吸去PBSPBS，加，加2 ml 1%2 ml 1%的的TritonX-100TritonX-100，于，于3737水浴处理水浴处理30min30min。3 3、冲洗：、冲洗：吸去吸去TritonX-100TritonX-100，用，用M M缓冲液缓冲液轻轻洗轻轻洗3 3次，每次次，每次5min5min。4 4、固定：、固定：3%3%戊二醛戊二醛固定固定20min20min。5 5、冲洗：弃戊二醛，用、冲洗：弃戊二醛，用6mmol/L PBS6mmol/L PBS液洗液洗3 3次，每次次，每次5min5min。6 6、染色：吸去、染色：吸去
8、PBSPBS，用，用0.2%0.2%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250R250染色染色10min10min。7 7、制片：倒掉染液，用水洗、制片：倒掉染液，用水洗2-32-3次，在载玻片上铺展开，加盖玻次，在载玻片上铺展开，加盖玻片。镜检观察。片。镜检观察。8 8、实验绘图：、实验绘图：在光学显微镜下，细胞骨架呈淡蓝色。在光学显微镜下，细胞骨架呈淡蓝色。思考题思考题一、说明实验中所用一、说明实验中所用TritonX-100、考马斯亮、考马斯亮蓝蓝R250、M缓冲液、戊二醛的作用。缓冲液、戊二醛的作用。二、实验操作的注意事项二、实验操作的注意事项M缓冲液使细胞骨架保持稳定。咪唑：稳定PH值，缓冲作用。
9、KCL：提供离子，对骨架起聚合作用。MgCL2:提供离子，对骨架起聚合作用。EGTA：螯合Ca离子 Ca离子对聚合不利。EDTA：螯合Ca离子 Ca离子对聚合不利。巯基乙醇：起还原作用，稳定骨架结构。配方：配方：试剂试剂 相对分子质量相对分子质量 所需浓度所需浓度 每升加量每升加量 备注备注 咪唑咪唑 68.08 50mmol/L 3.40g 68.08 50mmol/L 3.40g KCL 74.55 50mmol/L 3.73g KCL 74.55 50mmol/L 3.73g MgCl2MgCl2。6H2O 203.30 0.5mmol/L 0.1g 6H2O 203.30 0.5mmo
10、l/L 0.1g EGTA 380.40 1.0mmol/L 0.38g EGTA 380.40 1.0mmol/L 0.38g EDTAEDTA。2H2O 372.24 0.1mmol/L 0.04g 2H2O 372.24 0.1mmol/L 0.04g B-B-巯基乙醇巯基乙醇 78.13 1.0 78.13 1.0 mmolmmol/L 70ul/L 70ul 甘油甘油 92.09 4.0mmol/L 294.8ml 92.09 4.0mmol/L 294.8ml 加水定容至加水定容至1L1L，PHPH调至调至7.2 7.2(1)2(1)2(1)2(1)2考考考考马马马马斯斯斯斯亮亮亮
11、亮蓝蓝蓝蓝R250R250R250R250染染染染色色色色液液液液：称称称称考考考考马马马马斯斯斯斯亮亮亮亮蓝蓝蓝蓝R2501gR2501gR2501gR2501g，溶溶溶溶于于于于250ml250ml250ml250ml无无无无水水水水乙乙乙乙醇醇醇醇中中中中，加加加加 冰冰冰冰醋醋醋醋酸酸酸酸35ml.35ml.35ml.35ml.再再再再加加加加蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏至至至至500ml.500ml.500ml.500ml.(2)(2)(2)(2)磷磷磷磷酸酸酸酸缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液(pH(pH(pH(pH 6 6 6 68)8)8)8)：6 6 6 60mmol0mmol0mmol0mmo
12、lL L L L 磷磷磷磷酸酸酸酸缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液，调至调至调至调至pH6.8.pH6.8.pH6.8.pH6.8.(3)M(3)M(3)M(3)M缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液(pH(pH(pH(pH 7 7 7 72)50mmol2)50mmol2)50mmol2)50mmolL L L L咪咪咪咪唑唑唑唑，50mmol/L)50mmol/L)50mmol/L)50mmol/L)氯氯氯氯化化化化钾钾钾钾、0 0 0 05mmol5mmol5mmol5mmolL L L L氯氯氯氯化化化化镁镁镁镁、1mmol/L 1mmol/L 1mmol/L 1mmol/L 乙乙乙乙二二二二醇醇醇醇(a
13、-(a-(a-(a-氨氨氨氨基基基基乙乙乙乙基基基基)醚醚醚醚四四四四乙乙乙乙酸酸酸酸、0.1mmol/L0.1mmol/L0.1mmol/L0.1mmol/L乙乙乙乙二二二二胺胺胺胺四四四四乙乙乙乙酸酸酸酸；1mmol1mmol1mmol1mmolL L L L巯基乙醇，调至巯基乙醇，调至巯基乙醇，调至巯基乙醇，调至pH 7pH 7pH 7pH 72.2.2.2.(4)1%Trion X-100(4)1%Trion X-100(4)1%Trion X-100(4)1%Trion X-100：用：用：用：用M M M M缓冲液配制。缓冲液配制。缓冲液配制。缓冲液配制。(5)3%(5)3%(5)3%(5)3%戊二醛：用磷酸缓冲液配制戊二醛：用磷酸缓冲液配制戊二醛：用磷酸缓冲液配制戊二醛：用磷酸缓冲液配制.
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