其它标记免疫分析技术.ppt

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1、第九章其它标记免疫分析技术,李士军 教授 大连医科大学附属第一医院检验科,返回总目录,目录,第一节 放射免疫技术 （radioimmunoassay）,放射免疫技术基本类型： 经典的放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA） 免疫放射分析或免疫放射度量分析（immunoradiometric assay, IRMA）,放射性核素是指原子核能自发产生成分或能级的变化，变成另一种核素，同时伴有射线发射的元素。 放射性核素根据其衰变方式分为、三种，用于放射标记的有（14C、3H）、（131I和125I）两种，分别用液体闪烁技术和计数器测定。 目前以125I应用最为广泛。,一、放射性核素

2、标记物,（一）常用的放射性核素,用于标记的抗原纯度要高，有完整的 免疫活性，抗体的亲和常数要高，抗体滴度高并且交叉反应率低。,（二）抗原或抗体,在RIA中，标记抗原质量的优劣，直接影响测定结果，必须制备比放射性强、纯度高的标记抗原，并保持免疫活性不受丧失。 常用的标记方法： 直接标记法 间接标记法,（三）放射性核素标记物的制备,（四）放射性核素标记物的纯化与鉴定,（1）标记物的纯化,常用的纯化方法： 凝胶过滤法或薄层层析法 离子交换法 透析法 电泳法（聚丙烯酰胺凝胶电泳法） 高效液相色谱法。,（2）标记物的鉴定,标记化合物的质量指标： 放射性核纯度 放射化学纯度 放射性比活度 生物活性和免疫活

3、性 标记位置和定量分布情况,（3）抗体的选用,抗体亲和性,抗体特异性,抗体的效价,抗体亲和性,是抗体与抗原之间相互作用的一种结合能力或强度。亲和力的大小用亲和常数Ka值来表示。 抗体Ka值越大，放射免疫分析的灵敏度越高，抗体Ka值达到10-910-12mol/L，才适合放射免疫分析。,抗体特异性,抗体特异性：指抗体分别与相应抗原和抗原结构类似物的结合能力的比较。抗体与相应抗原结合能力强，而与该抗原结构类似物(同类物、前体、降解物和代谢物等)结合能力弱，则特异性高。 交叉反应是指抗体与抗原结构类似物的结合。 交叉反应率 = ED50（B）/ ED50（A） 100%,抗体的效价,抗体效价： 是抗

4、体和抗原发生反应的抗体最高稀释度。 是反映血清中有效抗体含量的相对参数。,二、放射免疫分析,（一）放射免疫分析原理,（二）实验方法,（三）方法学评价,（一）放射免疫分析原理,竞争性结合反应的经典标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与限量抗体(Ab)竞争性结合 Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力,Ab限量，Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab结合位点，二者 通过竞争方式与Ab 结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放 射量降低,二者变化 成函数关系。,（二）实验方法,Ag*,Ag,Ab,反应条件 体积 温度 时间 pH,平衡法 非平衡法,抗原抗体反应,免疫复合物（B）

5、与游离标记物（F）的分离,双抗体法,化学沉淀法,PR 试剂法,吸附法,固相分离法,晶体闪烁计数器包括了NaI闪烁晶体、光电倍增管以及计数器 测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分钟计数(cpm),计算,参数 cpm B/T (%) F/T (%) B/F (%) B/B0 (%),拟合,注：T即是B与F的总和,标准曲线,放射强度测定 数据处理,（三）方法学评价,RIA进行体外检测微量物质，灵敏度高特异性强，重复性好，但需注意放射性核素对环境造成的污染。,三、免疫放射分析,（一）免疫放射分析原理,（二）实验方法,（三）方法学评价,（四）IRMA和RIA的比较,（一）免疫放射分析原理,免疫

6、放射分析的基本原理是非竞争性免疫结合反应。 放射性核素标记于抗体上，用过量的标记抗体*Ab与待测抗原Ag反应，待反应完成后，去除剩余的游离标记抗体，则Ag-*Ab复合物的放射性强度与待测抗原的量成正比关系，通过检测免疫复合物的放射性，从而得到待测样本的浓度。,单位点IRMA,双位点IRMA,（二）实验方法,抗原抗体反应 免疫复合物与游离标记物的分离 放射性强度测定和数据处理,（三）方法学评价,IRMA的灵敏度和特异性均比RIA更好，且操作程序简单，但是应用的抗体量较大。,IRMA和RIA的比较,小 结,放射免疫技术是以放射性核素为示踪剂的标记免疫技术，分为放射免疫技术和免疫放射分析。 放射免疫

7、分析是待测抗原和定量的标记抗原竞争性结合限量的抗体，免疫放射分析是将放射性物质标记在抗体上，免疫放射分析分为单位点和双位点两种类型。 放射性免疫技术灵敏度高、特异性强，常用于微量物质的定量测定。,返回章目录,人民卫生出版社,第二节金标记免疫分析技术,28,一、 胶体金的一般特性,免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。 胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金（colloidal gold）,不同粒径胶体金的制备和特性,二、斑点金免疫渗滤试验

8、,（一）原理,（二）试验方法,技术要点 1）将反应板平放于实验台面上，于小孔内滴加含待测抗原标本12滴，待完全渗入，与膜上的抗体反应而结合在膜上。2）于小孔内滴加胶体金标记抗体试剂12滴，待完全渗入，使胶体金标记抗体与结合在膜上抗原反应。3）于小孔内滴加洗涤液23滴，待完全渗入，洗去未结合的胶体金标记抗体。4）结果观察 在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点显示者判为阳性反应，反之则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。,三、 斑点金免疫层析试验,（一）原理,（二）试验方法,（一）原理,斑点免疫层析试验 （dotimmunochromatographic assay，DICA） 简称免疫层析

9、试验（ICA），也以硝酸纤维素膜为载体，但利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜一端的液体慢慢向另一端渗移，如同层析。,（二）试验方法,免疫层析试验以单克隆双抗体夹心法为例。,四、 临床应用及评价,免疫胶体金技术的发展前景自免疫胶体金层析技术作为诊断试剂广泛应用到临床后，由于它的快速简便、准确，具有高度特异性和高敏感性，结果直观可靠，而且试剂和样品用量极少，每个样品只需12l,无需仪器设备，简化了烦琐的常规操作过程，同时也减小了因操作引起的误差，是一种目前发展最快的复合型免疫层析技术。在临床医学检验广泛应用，新项目正在不断发展中。,小 结,胶体金免疫技术是以胶体金作为标记物的免疫标记技术，本章主

10、要介绍了斑点金渗滤试验和斑点金免疫层析试验。斑点金免疫渗滤试验是在将硝酸纤维素膜包被了抗原或抗体，将其置于渗滤装置中，进行免疫结合试验，斑点金免疫层析试验是以硝酸纤维素膜为载体将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合免疫分析技术。 金免疫技术简便、快捷，应用广泛，适合“床边检验”。,返回章目录,放射免疫技术,酶免疫技术,发光免疫技术,三大经典标记技术,第三节 发光免疫分析技术,发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。 根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: 光照发光、生物发光、化学发光等。,一、概述,光照发光（ph

11、otoluminescence）：发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。,光照发光,生物发光（bioluminescence） ：是反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在恢复到基态时多余的能量以光子形式放出。典型例子为萤火虫发光。,生物发光,化学发光（chemiluminescence）：在常温下由化学反应产生的光的发射。 化学发光是一个多步骤的过程，其机制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（

12、即发光）。,化学发光,一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态。 反应过程可简单地描述如下： A十B C* C* C h 其中为光子，C*表示C处于单线激发态,（一）直接化学发光,若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光。 反应过程可表示如下： A十B C* C*十D C十D* D* D十h,（二）间接化学发光,该反应必须提供足够的激发能, 并由某一步骤单独提供, 因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光; 要有有利的反应过程, 使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态; 激发

13、态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子, 或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子。,（三）化学发光条件,化学发光强度（ICL）取决于化学反应的速率（dc/dt）和反应的化学发光量子效率（ CL ） ICL= CLdc/dt CL=rf r:生成激发态产物的量子产率，也就是每一个参加反应的分子产生的激发态； f :激发态产物分子的发光量子产率，也就是每一个激发态产生的光子数，对于一定的化学发光反应，为一定值。,（四）化学发光强度,在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物称为化学发光剂或发光底物。,化学发光剂,发光的量子产率高； 物理-化学特性

14、要与被标记或测定的物质相匹配； 能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； 其化学发光常是氧化反应的结果； 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。,作为化学发光剂的条件,在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。,（一）直接化学发光剂,在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。,1. 吖啶酯,三联吡啶钌 RU(bpy)32+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。,2. 三联吡啶钌,是利用标记

15、酶的催化作用，使发光剂（底物）发光。 1鲁米诺及其衍生物 2AMPPD,（二）酶促反应发光剂,（luminol，5-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下,1. 鲁米诺,鲁米诺的衍生物主要有异鲁米诺、 4 氨基已基 N 一乙基异鲁诺及 AHEI 和 ABEI 等。鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化学发光反应，辐射出最大发射波长为 425nm 的化学发光。,鲁米诺增强发光反应原理,3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷,2AMPPD,化学发光剂标记技术,1. 碳二亚胺（EDC）缩合法,只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠

16、将多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。,2. 过碘酸钠氧化法,在酸性条件下，可在实验室内临时制成一种重氮盐（重氮化反应），这种重氮盐在与一种芳香胺或苯酚化合时，生成偶氮化合物，称为偶联反应。,3. 重氮盐偶联法,4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法,发光剂的选择； 被标记蛋白质的性质； 标记方法的选择； 原料比； 标记率； 温度； 纯化与保存。,影响标记的因素：,类型： 第一种以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。 第二种是以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反应增强测定的

17、敏感性。,化学发光免疫分析系统,夹心法为例,直接化学发光免疫分析,化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。,二、化学发光酶免疫分析,该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标

18、记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。,（一）HRP标记的CLEIA,该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。,（二）ALP标记的CLEIA,增强发光酶免疫分析(enhanced luminescence enzyme immunoassay, ELEIA ) 在发光系统中加入增强

19、发光剂, 如对2碘苯 酚等, 以增强发光信号, 并在较长时间内保持稳定, 便于重复测量, 从而提高分析灵敏度和准确性。,（三）增强发光酶免疫分析,电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA） 是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。,三、电化学发光免疫分析,（一）电化学发光原理,在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)，用三联吡啶钌标记抗体(抗原)，在反应体系内待测标本与相应的抗原 (抗体)发生免疫反应

20、后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。,（二）电化学发光免疫分析,电化学发光免疫测定示意图,1.免疫标记技术日益融合 （1）蛋白质、激素和肿瘤检测 （2）病毒、毒物检测 （3）其它方面应用 2.与生物化学固定化技术日益融合 3.与微细加工技术日益融合,（三）电化学发光免疫分析的应用与发展,敏感度高，甚至超过RIA； 精密度和准确性均可与RIA相比； 试剂稳定，无毒害； 测定耗时短； 测定项目多； 已发展成自动化测定系统。,四、在医学检验中的应用,返回章目录,小 结,发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再返回到基态，并释放光子的过程。化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发光。化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。,返回章目录,THANK YOU FOR YOUR ATTENTION!,返回总目录,