果蔬中维生素C的提取和定量测定(

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1、实验八 果蔬中维生素C的提取和定量测定(2,6-二氯酚靛酚滴定法)【目的】1. 学习并掌握定量测定维生素 C 的原理和方法。2. 了解蔬菜、水果中维生素 C 含量情况。【原理】维生素 C 是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因 此又称为抗坏血酸(ascorbic acid)。它对物质代谢的调节具有重要的作用。近年 来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有化学致癌物的阻断作用。维生素C是不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。它分布很广，许多水果、 蔬菜中的含量更为丰富。维生素C具有很强的还原性。还原型抗坏血酸能还原染料2,6二氯酚靛酚 (dichloro-phenol-indo

2、phenol,简称DCIP)，本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中， 2,6二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。因此，当用此染料滴定含有维生素 C 的酸性溶液时，维生素 C 尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。 一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。 所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素 C 刚刚全部被氧化， 此时即为滴定终点。如无其它杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品 中所含还原型抗坏血酸量成正比。【试剂和器材】一、试剂2%草酸溶液： 草酸 2g 溶于 100mL 蒸馏水中。1%草酸溶液： 草酸 1g 溶于 100mL 蒸馏水中。

3、标准抗坏血酸溶液(O.lmg/mL)：准确称取50.0mg纯抗坏血酸(应为洁白色， 如变为黄色则不能用)溶于1%草酸溶液中，并稀释至500mL，贮于棕色瓶中， 冷藏。最好临用前配制。0.1% 2,6二氯酚靛酚溶液：250mg 2,6二氯酚靛酚溶于150mL含有52mg NaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至250mL，贮于棕色瓶中冷藏(4C),约可 保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。二、材料：水果、蔬菜三、器材 研钵，组织匀浆器，吸量管，抽滤设备，离心机，滤纸，容量瓶，滴定管，锥形瓶。【操作方法】一、提取 水洗干净待测的新鲜蔬菜或水果，用纱布或吸水纸吸干表面水分。 然后称取20g，

4、加入1020mL 2%草酸，研磨成浆状，抽滤，合并滤液，滤液总 体积定容至50mL。或者研磨后以2%草酸洗涤离心(4000r/min，10min)23次， 合并上清液于50mL容量瓶中，定容至刻度。二、标准液滴定 准确吸取标准抗坏血酸溶液1mL置50mL锥形瓶中，加 9mL 1%草酸，以 0.1% 2,6二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并保持15秒不褪色， 即达终点；取 10mL 1%草酸作空白对照，按以上方法滴定。由所用染料的体积 计算出1mL染料相当于多少毫克抗坏血酸。三、样品滴定 准确吸取滤液两份，每份10mL,分别放入2个锥形瓶内， 滴定方法同前。另取 10mL 1%草酸作空白对照滴定。【

5、计算】、(Va-Vb)XCXTX100维生素C含量(mg/100g样品)=DXW式中：VA为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数；VB为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数；C 为样品提取液的总毫升数；D 为滴定时所取的样品提取液毫升数；T为1mL染料能氧化抗坏血酸毫克数(由操作二计算出)；W 为待测样品的重量( g)。【注意事项】(1) 某些水果、蔬菜(如橘子、西红柿等)浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。(2) 整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料 不应小于1mL或多于4mL，如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释

6、 倍数。(3) 本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下，干扰物反应进行得很慢。(4) 2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而 1%草酸无此作用。(5) 干扰滴定因素有：若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加1mL氯仿，到达终点时，氯 仿层呈现淡红色。Fe2+可还原二氯酚靛酚。对含有大量Fe2+的样品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此时Fe2+不会 很快与染料起作用。样品中可能有其它杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸慢，因而滴定开始时，染料要迅速 加入，而后尽可能一点一点地加入，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于 15 秒内不消退为终点。【思考题】1为了测得

7、准确的维生素C含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤？为什么？ 2试简述维生素 C 的生理意义。【小资料】一、维生素 C维生素C是人类膳食中必需的维生素之一，如果缺乏维生素C,将导致坏血病发生。 因此，维生素C又称为抗坏血酸，有防治坏血病的功效。抗坏血酸在自然界分布十分广泛， 存在于新鲜水果和蔬菜中，尤其是柠檬果实和一些绿色植物（如青辣椒、菠菜等）中含量特 别丰富。抗坏血酸在机体同具有广泛的生理功能，已知体内许多重要物质的代谢反应都需要抗坏 血酸的参与。它是脯氨酸羟基化酶的辅酶，故有增进胶原蛋白合成的作用。机体中许多含疏 基的酶，需要依赖于作为还原剂的抗坏血酸的保护，使酶分子的疏基处于还原状态，

8、从而维 持其催化活性。由于抗坏血酸的氧化还原作用，它可促进免疫球蛋白的合成，增强机体的抵 抗力。同时还能使氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽（简称GSH）,而GSH可与重金 属结合而排出体外，因此维生素 C 常用于重金属的解毒。此外，抗坏血酸尚有许多其他生 理功能，但其作用机理还不十分清楚。抗坏血酸是一种不饱和的多羟基内酯化合物，稍有酸 味的糖类白色晶体，易溶于水，故属于水溶性维生素。在溶液中其分子内C2和C3之间的烯 醇式羟基上的氢极易解离并释放出H+ ,而被氧化成脱氢抗坏血酸，氧化后仍具有维生素C 的生理活性，但它易分解为二酮古洛糖酸，此化合物不再具有维生素C的生理活性。维生 素 C 有很

9、强的还原性，在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，易被氧化而破坏。还原型和 氧化型抗坏血酸可以互相转变，在生物组织中自成一氧化还原系统。由于维生素在营养学和临床方面的重要意义，故对食物和生物材料中维生素含量的测定 是十分必须的。抗坏血酸的定量测定方法很多，有2,6二氯酚靛酚（简称DCIP ）滴定法、 碘滴定法、2,4二硝基苯肼法、Folin试剂比色法、紫外吸收法等。其中广泛采用的是DCIP 滴定法，它具有简便、快速、比较准确等优点，适用于许多不同类型样品的分析。缺点是不 能直接测定样品中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的含量，易受其他还原物质的干扰。如果 样品中含有色素类物质，将给滴定终点的观察造成困

10、难。在酸性环境中，抗坏血酸（还原型） 能将染料2,6DCIP还原成无色的还原型2,6DCIP，而抗坏血酸则被氧化成脱氢抗坏血酸。 氧化型 2,6DCIP 在中性或碱性溶液中呈蓝色，但在酸性溶液中则呈粉红色。因此，当用 2,6DICP滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸未被全部氧化前,滴下的2,6DCIP 立即被还原成无色，一旦溶液中的抗坏血酸全部被氧化时，则滴下微量过剩的 2,6DCIP 便 立即使溶液显示淡粉红色或微红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被 氧化。依据滴定时2,6DCIP标准溶液的消耗量（mL）,可以计算出被测样品中抗坏血酸的 含量。氧化型2,6DCIP与还

11、原型抗坏血酸常在稀草酸或偏磷酸溶液中进行反应。即先将样 品溶于一定浓度的酸性溶液中或经抽提后，再用2,6DCIP标准溶液滴定至终点。食物和生物材料中常含有其他还原物质，其中有些还原物质可使2,6DCIP还原脱色。 为了消除这些还原物质对定量测定的干扰，可用抗坏血酸氧化酶处理，破坏样品中还原型抗 坏血酸后，再用2,6DCIP滴定样品中其他还原物质。然后从滴定未经酶处理样品时2,6 DCIP标准溶液的总消耗量中，减去滴定非抗坏血酸还原物质2,6DCIP标准溶液的消耗量， 即为滴定抗坏血酸实际所消耗的2,6DCIP标准溶液的体积，由此可以计算出样品中抗坏血 酸的含量。另外，还可利用抗坏血酸和其他还原

12、物质与2,6DCIP反应速度的差别，并通过 控制样品溶液在pHl 3范围内，进行快速滴定，可以消除或减少其他还原物质的作用， 一般在这样的条件下，干扰物质与2,6DCIP的反应是很慢的或受到抑制。生物体液（如血 液、尿等）中的抗坏血酸的测定比较困难，因为这些样品中抗坏血酸的含量很低，并且存在 许多还原物质的干扰，同时还必须预先进行脱蛋白处理。在生物体液中含有巯其、亚硫酸盐 及硫代硫酸盐等物质，它们都能与DCIP反应，但反应速度比抗坏血酸慢得多。样品中巯基 物质对定量测定的干扰，通常可以藉加入对一氯汞苯甲酸（简称PCMB）而得到消除。二、坏血病几百年前的欧洲，长期在海上航行的水手经常遭受坏血病的

13、折磨，患者常常牙龈出血， 甚至皮肤淤血和渗血，最后痛苦地死去，人们一直查不出病因。奇怪的是，只要船只靠岸， 这种疾病很快就不治而愈了。水手们为什么会得坏血病呢？一位随船医生通过细心观察发现，水手在航海中很难吃到新鲜的水果和蔬菜。这位医 生试着让水手天天吃一些新鲜的柑橘，奇迹出现了坏血病很快就痊愈了。那么，柑橘为 什么会有如此神奇的本领呢？经过长期的研究，科学家后来从新鲜的水果和蔬菜中提取出维 生素C (又叫抗坏血酸)，并证实坏血病就是维生素C缺乏症。疾病简介坏血病(scurvy),由维生素C缺乏引起，所以维生素C缺乏病主要是指坏血病。但维 生素 C 缺乏不仅能引起坏血病，还与炎症、动脉硬化、肿

14、瘤等多种疾患有关。坏血病在历 史上曾是严重威胁人类健康的一种疾病。过去几百年间曾在海员、探险家及军队中广为流行， 特别是在远航海员中尤为严重，故有“水手的恐怖”之称。关于坏血病的明确记载始于十三世 纪十字军东征时代，有的学者追溯至公元前希波克拉底(Hippocrates)时代。另据称，在 原始社会人类的遗体上也曾发现坏血病的遗迹。关于坏血病的防治，早在 17-18 世纪就已 经发现可以利用新鲜蔬菜、柑桔及柠檬等防治o 1753年Lind的坏血病名著问卷心菜、肾上 腺中提取出抗坏血病物质“已糖醛酸”(hexuronic acid)。与此同时，它的化学结构， 1933年Reichstein人工合成

15、成功，从而，人类终于征服了坏血病。但有关维生素C的理论 和应用的研究则远未结束。病因和发病情况：主要由于食物中缺乏维生素 C 而致病，人工哺乳婴儿及成人食物中长期缺乏新鲜果蔬 (嗜酒、偏食等)、或长期感染对维生素C需要量增多时，可患本病。症状：维生素 C 缺乏后数月，患者感倦怠、全身乏力，精神抑郁、虚弱、厌食、营养不良， 面色苍白，牙龈肿胀、出血，并可因牙龈及齿槽坏死而致牙齿松动、脱落，骨关节肌肉疼痛， 皮肤淤点、淤斑，毛囊过度角化、周围出血，小儿可因骨膜下出血而致下肢假性瘫痪、肿胀、 压痛明显、髋关节处展，膝关节半屈，足外旋，蛙样姿势。预防：(1) 选择含维生素C丰富的食物，改进烹调方法，减少维生素C在烹调中丧失。人工喂 养婴幼儿应添加含维生素C食物或维生素Co疾病，手术后，吸烟者、口服避孕药时、南 北极地区工作者均应适当增加维生素C摄入量。(2) 对症处理 如保持口腔清洁，预防或治疗继发感染，止痛，有严重贫血者可予输血， 给铁剂。重症病例如有骨膜下巨大血肿，或有骨折，不需要手术治疗，用维生素C治疗后 血肿可渐消失，骨折自能愈合。