目的基因导入受体细胞

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1、 第三节 重组子的筛选 在 重 组 DNA分 子 的 转 化 、 转 染 或 转 导 过程 中 ， 一 般 仅 有 少 数 受 体 细 胞 成 为 克 隆 子 。必 须 采 用 合 适 的 方 法 从 大 量 的 细 胞 背 景 中 筛选 出 期 待 的 克 隆 子。概 念克 隆 子转 化 子重 组 子 将 摄 取 外 源 DNA分 子 并 能 使 该 分 子 在 其 中 稳 定 维 持 的 受体 细 胞 统 称 为 克 隆 子 。 把 采 用 各 种 转 化 方 法 或 转 导 方 法 获 得 的 克 隆 子 叫 做 转化 子 （ 导 入 外 源 DNA分 子 后 能 稳 定 存 在 的 受

2、 体 细 胞 称 为转 化 子 ）， 现 在 这 两 者 有 通 用 的 趋 向 。 含 有 重 组 DNA分 子 的 克 隆 子 被 称 为 重 组 子 ， 如 果 重 组 子中 含 有 外 源 目 的 基 因 则 又 称 为 阳 性 克 隆 子 或 期 望 重 组子 。 经 过 各 种 方 法 将 外 源 DNA分 子 导 入 受 体 细 胞 后 ， 获 得 所需 阳 性 克 隆 子 的 过 程 称 为 克 隆 子 的 筛 选 。 一 、 遗 传 表 型 直 接 筛 选 法 （ 一 ） 根 据 载 体 选 择 标 记 初 步 筛 选 转 化 子 在 构 建 基 因 工 程 载 体 系 统

3、时 ， 通 常 在 载 体 DNA分 子中 组 装 了 一 种 或 两 种 选 择 标 记 基 因 ， 在 受 体 细 胞内 进 行 表 达 ， 呈 现 出 特 殊 的 表 型 或 遗 传 学 特 性 ，作 为 筛 选 转 化 子 的 依 据 。 一 般 的 做 法 是 : 将 转 化 处 理 后 的 受 体 细 胞 接 种 在 含 适量 选 择 药 物 的 培 养 基 上 ， 在 最 适 生 长 温 度条 件 下 培 养 一 定 时 间 ， 根 据 菌 落 生 长 情 况挑 选 出 转 化 子 。 选 择 培 养 基 是 ： 根 据 宿 主 细 胞 类 型 配 置 的 培 养 基 ， 对 于

4、细 菌 受 体 细 胞 而 言 ， 通 常 用 LB培 养 基 ， 在LB培 养 基 中 加 入 适 量 的 某 种 选 择 物 ， 即 为选 择 培 养 基 。选 择 物 ： 是 由 载 体 DNA分 子 上 携 带 的 选 择 标 记 基因 所 决 定 。 （ 一 ） 根 据 载 体 选 择 标 记 初 步 筛 选 转 化 子 （ 1） 抗 药 性 筛 选 （ 2） 插 入 失 活 筛 选 法 （ 3） 插 入 表 达 筛 选 法 （ 4） 显 色 互 补 筛 选 法 （ 5） 利 用 报 告 基 因 筛 选 植 物 转 化 细 胞 （ 6） 利 用 遗 传 选 择 标 记 筛 选 哺 乳

5、 动 物转 基 因 细 胞 （ 1） 抗 药 性 筛 选 正向选择方式 注 意 ： 利 用 含 一 种 选 择 药 物 的 选 择 培 养 基 无 法区 分 重 组 子 和 非 重 组 子 ， 只 能 区 分 转 化 子和 非 转 化 子 。 （ 2）插入失活筛选法 双抗药性筛选双 （ 3） 插 入 表 达 筛 选 法利 用 外 源 目 的 基 因 插 入 特 定 载 体 后 能 激 活筛 选 标 记 基 因 的 表 达 ， 由 此 进 行 转 化 子 的筛 选 。有 些 载 体 在 设 计 时 ， 在 筛 选 标 记 基 因 前 面连 接 上 一 段 负 调 控 序 列 ， 当 插 入 失

6、活 该 负调 控 序 列 时 ， 其 下 游 的 筛 选 标 记 基 因 才 能表 达 。 例 如 pTR262质 粒 载 体 ， 它 由 pBR322衍 生 而 来 ， 其Tcr基 因 的 上 游 含 有 一 段 噬 菌 体 DNA的 CI阻 遏 蛋 白 编 码基 因 及 其 调 控 序 列 ， CI基 因 表 达 的 阻 遏 蛋 白 可 以 抑 制Tcr基 因 的 表 达 。 当 外 源 DNA片 段 插 入 CI基 因 的 Hin d或 Bgl 位 点 上 时 ， CI基 因 失 活 。 Tcr基 因 因 阻 碍 解 除 而得 以 表 达 ， 故 阳 性 重 组 子 为 Tcr表 型 。

7、 质 粒 本 身 因 为 Tcr基 因 受 阻 碍 为 Tcs表 型 ， 当 转 化 细菌 涂 布 在 Tc平 板 上 时 ， 只 有 含 有 外 源 DNA插 入 片 段 的 阳性 重 组 子 的 转 化 菌 才 能 生 长 成 菌 落 。 （ 4） 显 色 互 补 筛 选 法 lacZ 基 因 上 缺 失 操 纵 基 因 区 段 的 突 变 体 与 带 有 完整 的 近 操 纵 基 因 区 段 的 -半 乳 糖 苷 酶 阴 性 突 变 体之 间 实 现 互 补 ， 这 种 互 补 现 象 称 为 -互 补 。 具 有 完 整 乳 糖 操 纵 子 的 菌 体 能 转 译 -半 乳 糖 苷 酶

8、(Z)、 IPTG和 X-gal时 ， 产 生 兰 色 沉 淀 物 ， 使 菌 落成 为 蓝 色 。 如 果 在 载 体 DNA上 组 入 -半 乳 糖 苷 酶基 因 （ lacZ)部 分 缺 失 的 片 段 (lacZ ) 则 重 组DNA分 子 转 化 lacZ 互 补 型 菌 落 ， 会 在 含 有 X-gal和 IPTG的 培 养 基 中 得 到 的 转 化 子 是 蓝 色 菌 落 。 lac Z 是 -半 乳 糖 苷 酶 基 因 部 分 缺 失 的 DNA片 段 ，含 lac Z 的 重 组 载 体 转 化 lac Z 互 补 型 菌 株 ，可 转 译 -半 乳 糖 苷 酶 ， 在

9、含 有 X-gal（ 5-溴 -4-氯-3-吲 哚 - -D-半 乳 糖 苷 ） 和 IPTG（ 异 丙 基 - -硫代 半 乳 糖 苷 ） 的 培 养 基 上 使 转 化 子 成 为 蓝 色 菌 落 ，而 lac Z 互 补 型 菌 株 本 身 为 白 色 菌 落 。 当 lac Z区 插 入 外 源 基 因 后 ， 再 转 化 lac Z 互 补 型 菌 株 ，由 于 不 能 翻 译 -半 乳 糖 苷 酶 ， 转 化 子 即 使 在 含 有X gal和 IPTG的 培 养 基 上 也 只 能 长 成 白 色 菌 落 。这 样 可 以 区 分 含 外 源 基 因 和 不 含 外 源 基 因

10、的 转 化子 。 此 方 法 主 要 用 于 原 核 生 物 。 互补的检测 以 显 色 剂 x-gal作 为 选 择 物 时 : DNA对 照 组 不 应 出 现 任 何 菌 落 ； 感 受 态 细 胞 对 照 组 长 出 的 菌 落 应 全 是 蓝 色的 ； 感 受 态 细 胞 有 效 性 对 照 组 长 出 的 菌 落 中 应有 白 色 的 。其 中 一 项 不 符 ， 就 有 可 能 挑 出 假 的 转 化 子菌 落 。 （ 5） 利 用 报 告 基 因 筛 选 植 物 转 化 细 胞 报 告 基 因 ： 系 指 其 编 码 产 物 能 够 被 快 速 地 测 定 ，常 用 来 判 断

11、 外 源 基 因 是 否 已 经 成 功 地 导 入 寄 主 细胞 （ 器 官 或 组 织 ） 并 检 测 其 表 达 活 性 的 一 类 特 殊用 途 的 基 因 。 在 植 物 转 基 因 研 究 中 ， 在 有 选 择 压 力 的 情 况 下 ，可 利 用 报 告 基 因 在 受 体 细 胞 内 的 表 达 ， 从 大 量 非转 化 克 隆 中 选 择 出 转 化 细 胞 ； 同 时 ， 报 告 基 因 可以 和 某 些 目 的 基 因 构 成 嵌 合 基 因 ， 从 报 告 基 因 的表 达 了 解 目 的 基 因 的 表 达 情 况 及 推 测 基 因 调 控 序列 。 常 用 的

12、报 告 基 因 有 抗 生 素 抗 性 基 因 以 及 编 码某 些 酶 类 或 其 他 持 殊 产 物 的 基 因 等 。 特 征 作 为 报 告 基 因 ， 在 遗 传 选 择 和 筛 选 检测 方 面 必 须 具 有 以 下 几 个 条 件 ： (1)已 被 克 隆 和 全 序 列 已 测 定 ； (2)表 达 产 物 在 受 体 细 胞 中 本 不 存 在 ，即 无 背 景 ， 在 被 转 染 的 细 胞 中 无 相 似 的 内源 性 表 达 产 物 ； (3)其 表 达 产 物 能 进 行 定 量 测 定 。 新 霉 素 磷 酸 转 移 酶 基 因 （ npt ） 抗 新 霉 素 、

13、 卡那 霉 素 、 庆 大 霉 素 和 G418等 抗 生 素 ， 成 为 筛 选 动植 物 转 化 子 的 选 择 标 记 基 因 。 潮 霉 素 磷 酸 转 移 酶 基 因 （ hpt） 赋 予 转 化 子 能 抗潮 霉 素 ， 作 为 选 择 标 记 基 因 主 要 用 于 筛 选 动 植 物转 化 子 。 潮 霉 素 是 致 癌 物 质 ， 操 作 时 应 慎 重 。 氯 霉 素 乙 酰 转 移 酶 基 因 （ cat） 也 被 用 于 筛 选 动植 物 转 化 子 的 标 记 基 因 。 -葡 萄 糖 酸 酶 基 因 （ gus） gus的 基 因 产 物 -葡 萄 糖 酸 酶 （

14、GUS） 能 够 催 化 4-甲 基 伞 形 花 酮 - -D-葡 萄 糖 苷 酸 ， 产 生 荧 光 物 质4-甲 基 伞 形 花 酮 ， 以 此 筛 选 含 gus基 因 的 转 化 子 。 由 于 植 物 细 胞 GUS本 底 非 常 低 ， 因 此 广 泛 地 应 用 于筛 选 植 物 转 化 子 。 尤 其 是 gus基 因 的 3 端 与 其 他 结 构 基 因 连 接 产 生的 嵌 合 基 因 仍 能 正 常 表 达 ， 产 生 的 融 合 蛋 白 中 仍有 GUS活 性 ， 可 用 于 外 源 基 因 在 转 化 生 物 体 中 的 定位 分 析 。 萤 火 虫 荧 光 素 酶

15、 基 因 （ luc） luc表 达 产 物 萤 火 虫 荧 光 素 酶 （ LUC） 在 Mg2+的 作 用下 ， 可 以 与 荧 光 素 和 ATP底 物 发 生 反 应 ， 形 成 与 酶结 合 的 腺 苷 酸 荧 光 素 酰 化 复 合 物 ， 经 过 氧 化 脱 羧 作用 后 ， 该 复 合 物 转 变 成 为 处 于 激 活 状 态 的 氧 化 荧 光素 ， 可 以 用 荧 光 测 定 仪 快 速 灵 敏 地 检 测 出 产 生 的 荧光 ， 是 目 前 研 究 动 植 物 转 基 因 很 好 用 的 一 种 报 告 基因 。 Luc基 因 检 测 十 分 迅 速 ， 灵 敏 度

16、高 ， 成 本 低 ， 不 存在 放 射 性 同 位 素 检 测 对 人 体 健 康 和 环 境 生 态 所 造 成的 危 害 ， 也 没 有 内 源 荧 光 产 生 的 背 景 干 扰 ， 因 此 ，Luc是 一 种 理 想 的 报 告 基 因 。 抗 除 草 剂 bar基 因 。 bar基 因 编 码 磷 化 乙 酰 转 移酶 （ PAT） ， 使 转 化 子 对 含 有 磷 化 麦 黄 酮 （ PPT）成 分 的 除 草 剂 具 有 抗 性 。 冠 瘿 碱 合 成 酶 基 因 。 主 要 包 括 胭 脂 碱 合 成 酶 基 因和 章 鱼 碱 合 成 基 因 两 类 ， 存 在 于 土 壤

17、 农 杆 菌 Ti质 粒的 T-DNA区 段 。 冠 瘿 碱 合 成 酶 基 因 在 植 物 细 胞 中 的 表 达 产 物 可 以 催化 一 些 特 殊 反 应 ， 通 过 电 泳 分 离 及 菲 醌 荧 光 染 料 染色 ， 方 便 地 观 察 ， 据 此 作 为 报 告 基 因 用 于 转 植 物 基因 细 胞 的 筛 选 。 冠 瘿 碱 合 成 酶 基 因 在 植 物 基 因 工 程 早 期 应 用 较 多 ，现 已 逐 渐 被 其 他 更 为 理 想 的 报 告 基 因 所 取 代 。 （ 6） 利 用 遗 传 选 择 标 记 筛 选哺 乳 动 物 转 基 因 细 胞 在 植 物 转

18、 基 因 研 究 中 采 用 的 氯 霉 素 乙 酰 转 移酶 (Cat)基 因 和 新 霉 素 磷 酸 转 移 酶 (Npt )基因 也 可 用 于 哺 乳 动 物 转 基 因 细 胞 的 筛 选 。 常 用 的 标 记 基 因 还 有 ： - 胸 腺 核 苷 激 酶 基 因 （ tk） 、 - 二 氢 叶 酸 还 原 酶 基 因 （ dhfr） - 次 黄 嘌 呤 -鸟 嘌 呤 磷 酸 核 糖 转 移 酶 基 因（ hgprt） - 细 菌 的 黄 嘌 呤 -鸟 嘌 呤 磷 酸 核 糖 基 转 移 酶基 因 (ecogpt)等 。 胸 腺 核 苷 激 酶 基 因 （ tk） 、 二 氢 叶

19、 酸 还 原 酶 基 因（ dhfr） 及 次 黄 嘌 呤 -鸟 嘌 呤 磷 酸 核 糖 转 移 酶 基 因（ hgprt） 等 的 表 达 产 物 直 接 或 间 接 参 与 核 苷 酸 合成 代 谢 。这 些 基 因 缺 失 的 缺 陷 型 细 胞 因 核 苷 酸 合 成 代 谢 失 调而 死 亡 ， 只 有 在 添 加 某 些 核 苷 酸 的 培 养 基 中 才 能 生长 。如 果 用 这 样 的 缺 陷 型 细 胞 作 为 受 体 细 胞 ， 导 入 含 有上 述 基 因 的 外 源 DNA， 补 充 原 来 缺 失 的 基 因 ， 使 核苷 酸 合 成 代 谢 恢 复 正 常 ， 可

20、 以 在 不 添 加 核 苷 酸 的 培养 基 中 正 常 生 长 。 根 据 这 一 性 质 可 以 在 不 添 加 核 苷酸 的 培 养 基 中 筛 选 出 转 化 子 。 三 、 核 酸 分 子 杂 交 检 测 法 （ p239）基 本 原 理 复 性RNA DNA 待 测 的 核 酸 序 列杂 交 的 双 方 用 于 检 测 的 已 知 核 酸 片 段 探 针 根 据 待 测 核 酸 的 来 源 以 及 将 其 分 子 结合 到 固 相 支 持 物 上 的 方 法 的 不 同 。 Southern印 迹 杂 交Northern印 迹 杂 交斑 点 和 狭 线 印 迹 杂 交菌 落 （

21、或 噬 菌 体 ） 原 位 杂 交核 酸 分 子 杂 交 检 测 法 分 类 又 称 DNA印 迹 杂 交 、 Southern DNA印 迹 杂 交1、 Southern印 迹 杂 交经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 的 DNA片 段转 移 到 滤 膜 上 与 标 记 的 DNA或 RNA探 针 杂 交放 射 自 显 影 显 杂 交 带基 本 原 理 ： （ 1） 提 取 总 DNA （ 2） 酶 解 （ 3） 电 泳 （ 4） 转 印 （ 5） 变 性 解 链 （ 6） 杂 交 （ 7） 洗 脱 （ 8） 放 射 自 显 影 （ 9） 比 较 分 析 毛 细 管 虹 吸 印 迹 法电

22、 转 移 印 迹 法真 空 转 移 法核 酸 转 移 （ 印 迹 ） 方 法 毛细管虹吸印迹法湿 滤 纸高 盐 缓 冲 液 滤 纸 桥凝 胶硝 酸 纤维 素 膜吸 水 纸玻 璃 板 支 持 台容 器 重 物 利 用 核 酸 分 子 在 电 场 中 的 电 泳 作 用 将 凝 胶中 的 DNA转 移 到 固 相 支 持 物 上 。湿 式 电 转 移干 式 电 转 移电 转 移 法 尼龙膜凝胶滤纸海绵凝胶支持夹缓冲液电极+滤纸电极湿式电转移法 真空转移法 真空转移装置 硝 酸 纤 维 素 膜（ 简 称 NC膜 ）优 点 ： 吸 附 能 力 强 ， 杂 交信 号 本 底 低缺 点 ： DNA分 子

23、结 合 不 牢固 ， 膜 易 碎 裂 ， 依 赖 高 盐溶 液常 用 的 固 相 支 持 物 尼 龙 膜 （ Nylon）优 点 ： 结 合 单 链 ， 双 链DNA的 能 力 比 NC膜 强 ，韧 性 高 ， 可 重 复 杂 交缺 点 ： 杂 交 信 号 本 底 高常 用 的 固 相 支 持 物 凝 胶滤 膜转 移 RNA 至 膜 上RNA 分 子甲 醛 变 性 电 泳 （ 聚 丙 烯酰 胺 凝 胶 电 泳 ）带 有 RNA片 段 的 凝 胶转 膜 杂 交 、 显 影2、 Northern印 迹 杂 交 两种印迹技术的比较 (P248)1234 3、 斑 点 印 迹 杂 交 和 狭 线 印

24、迹 杂 交 两 种 方 法 的 基 本 原 理 和 操 作 步 骤 相 同 即 通 过 特 殊 的 加 样 装 置 将 变 性 的 DNA或RNA核 酸 样 品 ， 直 接 转 移 到 适 当 的 杂 交 滤膜 上 ， 然 后 与 核 酸 探 针 分 子 进 行 杂 交 以 检测 核 酸 样 品 中 是 否 存 在 特 异 性 DNA或 RNA。 斑 点 杂 交 法 狭 缝 式 点 样 器 1、 斑 点 印 迹 为 圆 形 2、 狭 缝 印 迹 为 线 状 3、 鉴 别 DNA、 RNA 4、 简 单 、 快 速 ， 同 一 张 膜 可 检 测 多 个 样 品 5、 特 异 性 不 高 、 不

25、 能 鉴 别 核 酸 分 子 量斑点及狭缝印迹杂交的特点 4、 菌 落 （ 或 噬 菌 斑 ） 原 位 杂 交基 本 原 理直 接 把 菌 落 和 噬 菌 斑 转 移 到 滤 膜 上溶 菌 、 变 性DNA暴 露 并 于 滤 膜 原 位 结 合与 探 针 杂 交 溶 菌 、 使 DNA暴 露洗 菌 体 碎 片 和Pr使 单 链 DNA牢固 结 合 在 膜 上 操 作 用 途Southern印 迹 杂 交 从 转 化 子 中 提 取 总 DNA， 经酶 切 、 电 泳 分 带 及 变 性 ，转 移 膜 上 ， 再 用 DNA探 针 与其 杂 交 。 操 作 麻 烦 。 鉴 定 转 化 子 中 是

26、 否 含 有待 检 测 重 组 DNA分 子 ；鉴 定 待 检 测 的 DNA分 子的 大 小 。斑 点 印 迹杂 交 把 提 取 的 转 化 子 总 DNA直 接点 样 到 膜 上 ， 变 性 处 理 后再 用 DNA探 针 与 其 杂 交 。 操作 简 单 。 只 能 区 别 总 DNA中 是 否含 有 待 检 测 重 组 DNA分子 的 重 组 子菌 落 （ 或噬 菌 斑 ）原 位 杂 交 直 接 把 菌 落 或 噬 菌 斑 印 迹转 移 到 膜 上 ， 经 溶 菌 和 变性 处 理 后 使 DNA暴 露 出 来 并与 滤 膜 原 位 结 合 ， 再 用 DNA 探 针 与 其 杂 交

27、。 操 作 简 单 。 广 泛 地 用 于 从 基 因 组DNA文 库 和 cDNA文 库 中筛 选 含 目 的 基 因 的 重 组子 。 三 种 筛 选 方 法 的 比 较 杂 交 探 针 指 具 有 一 定 序 列 的 核 苷 酸片 段 ， 它 能 与 互 补 的 核 酸 序 列 复 性 杂 交 ，并 且 通 过 适 当 标 记 进 行 检 测 。 5、核酸杂交探针( 自学) 同 源 或 部 分 同 源 探 针 总 cDNA探 针 特 异 性 cDNA探 针 人 工 合 成 的 寡 核 苷 酸 探 针（1）核酸杂交探针的种类 理 想 的 探 针 标 记 物 应 满 足 的 条 件 ： 1)

28、不 会 影 响 探 针 的 主 要 理 化 性 质 ； 2)检 测 灵 敏 度 高 、 特 异 性 强 、 本 底 低 、重 复 性 好 ； 3)操 作 简 便 、 省 时 经 济 实 用 ： 4)化 学 稳 定 性 高 、 易 于 长 期 保 存 ； 5)安 全 、 无 环 境 污 染 。 常 用 于 分 子 杂 交 的 探 针 标 记 物 分 放 射 性及 非 放 射 性 。（ 2） 探 针 标 记 物 放 射 性 标 记 物 是 指 以 放 射 性 同 位 素 对 核 苷酸 等 进 行 标 记 后 的 产 物 ， 常 见 的 放 射 性 同位 素 有 32P、 3H、 35S、 14C、

29、 125I等 ， 其 中 以32P、 3H、 35S最 为 常 用 。 标 记 物 放 射 性 的 检 测 主 要 使 用 盖 革 计 数 器和 液 体 闪 烁 计 数 器 等 射 线 探 测 仪 来 完 成 。 放射性标记物 非 放 射 性 标 记 物 的 最 大 优 势 是 无 放 射 性 污染 ， 分 辨 力 高 ， 稳 定 性 好 ， 可 以 较 长 时 间保 存 使 用 ， 但 与 放 射 性 探 针 相 比 ， 多 数 非放 射 性 探 针 的 敏 感 性 及 特 异 性 较 差 。 目 前 已 广 泛 应 用 的 非 放 射 性 标 记 物 有 ： 生 物 素 (biotin)标

30、 记 的 核 苷 酸 、 地 高 辛 (digoxigenin)标 记 的 核 苷 酸 荧 光 素 (fluorescein)标 记 的 核 苷 酸非放射性标记物 （ 3） 探 针 标 记 方 法 探 针 的 标 记 有 体 内 标 记 及 体 外 标 记 两 种方 法 。 体 内 标 记 法 是 以 标 记 化 合 物 作 为 代 谢 底物 ， 通 过 活 体 生 物 或 活 细 胞 的 体 内 代 谢完 成 核 酸 分 子 标 记 ， 例 如 在 培 养 基 中 加入 3H-胸 苷 ， 就 可 以 标 记 到 生 长 在 该 培 养基 中 的 活 细 胞 DNA分 子 上 。 体 内 标

31、记 法 受 多 种 因 素 的 限 制 ， 且 标 记活 性 不 高 ， 一 般 很 少 使 用 。 体 外 标 记 包 括 化 学 法 和 酶 法 两 种 。 化 学 标 记 法 是 利 用 标 记 物 的 活 性 基 团 与 核 酸 分 子 中的 某 种 基 因 (如 磷 酸 基 团 )发 生 化 学 反 应 而 直 接 将 标记 物 连 接 到 探 针 分 子 上 ， 具 有 简 单 快 速 、 标 记 均 匀的 特 点 ， 尤 其 适 于 制 备 非 放 射 性 标 记 物 的 探 针 。 酶 标 记 法 则 是 先 将 标 记 物 标 记 在 核 苷 酸 上 ， 然 后 通过 酶 促

32、 聚 合 反 应 使 带 标 记 的 核 苷 酸 掺 入 到 核 酸 序 列中 ， 获 得 核 酸 探 针 。 酶 法 应 用 广 泛 ， 适 于 制 备 所 有放 射 性 标 记 探 针 及 部 分 非 放 射 性 标 记 探 针 。 常 用 的 酶 法 有 DNA缺 口 平 移 标 记 法 、 DNA随 机 引 物 标记 法 、 DNA末 端 标 记 法 及 PCR标 记 法 等 。 切 口 平 移 标 记 法(nick thanslation labeling) DNA聚 合 酶 该 法 标 记 模 板 链 随 机 引 物 标 记 法 (random primed DNA labelin

33、g) Klenow片 段 催 化 该 法 标 记 模 板 互 补 链随机引物是含有各种可能排列的寡核苷酸片段的混合物。 随 机 引 物 ： 46 使 用 随 机 引 物 标 记 的 探 针 一 般 长 400-600个核 苷 酸 ， 具 多 种 序 列 ， 但 都 与 模 板 互 补 。 与 切 口 平 移 法 不 同 的 是 ， 该 方 法 标 记 的 是模 板 互 补 链 ， 而 非 模 板 本 身 。 末 端 标 记 法(DNA terminal labeling) 该 法 标 记 的 是 线 性 DNA或 RNA的 5 端 或 3 端 ， 属非 均 一 性 标 记 。 1)3 凸 出

34、末 端 的 加 尾 标 记 法 ： 末 端 脱 氧 核 苷 酸 转移 酶 将 带 有 标 记 的 dGTP或 dCTP加 到 DNA3 -OH端 2)双 链 DNA3 隐 蔽 末 端 的 填 充 标 记 ： （ 若 反 应 体系 存 在 全 部 与 模 板 序 列 互 补 的 dNTP） 以 凸 出 序 列为 模 板 ， Klenow酶 或 T4DNA连 接 酶 催 化 补 平 3 末端 （ 若 一 种 dNTP带 标 记 则 成 为 探 针 ） 。 3)5 末 端 标 记 ： T4多 聚 核 苷 酸 激 酶 将 ATP的 标 记的 -磷 酸 基 团 转 移 到 游 离 的 5 -OH上 。

35、PCR标 记 法 (PCR labeling)： 标 记 的 一 种 dNTP 光 敏 标 记 法 化 学 衍 生 结 合 标 记 法 ： 生 物 素 和 地 高 辛 等 非 放 射性 标 记 物 可 以 与 事 先 经 过 化 学 修 饰 得 到 的 核 酸 衍 生 物更 加 牢 固 地 结 合 ， 进 行 非 放 射 性 探 针 的 制 备 。 常 用 的化 学 修 饰 反 应 包 括 磺 化 、 转 氨 、 溴 化 等 反 应 类 型 。 交 叉 相 连 标 记 法 ： 利 用 一 些 高 分 子 化 合 物 ， 如细 胞 色 素 c、 组 蛋 白 H1及 大 肠 杆 菌 单 链 结 合

36、 蛋 白 质等 能 与 核 酸 结 合 的 特 性 ， 制 备 相 应 的 探 针 。 四 、 DNA序 列 测 定 法 （ 录 像 ） DNA序 列 测 定 ， 即 核 酸 一 级 结 构 的 测 定 ， 简 称 DNA测 序 。 对 克 隆 DNA片 段 进 行 序 列 测 定 及 分 析 : 可 以 直 观 地 鉴 定 出 重 组 DNA分 子 中 是 否 含 有 目 的 基 因 ; 可 以 获 得 目 的 基 因 的 编 码 序 列 和 基 因 调 控 序 列 . 这 对 目 的 基 因 的 表 达 及 其 功 能 研 究 具 有 重 要 意 义 。 DNA序 列 分 析 目 前 用

37、于 测 序 的 技 术 主 要 有 : Sanger等 （ 1975） 发 明 的 双 脱 氧 链 末 端 终 止法 Maxam和 Gilbert（ 1977） 发 明 的 化 学 降 解 法 。 这 二 种 方 法 在 原 理 上 差 异 很 大 ， 但 都 是 根 据核 苷 酸 在 某 一 固 定 的 点 开 始 ， 随 机 在 某 一 个特 定 的 碱 基 处 终 止 ， 产 生 A， T， C， G四 组 不同 长 度 的 一 系 列 核 苷 酸 ， 然 后 在 尿 素 变 性 的PAGE胶 上 电 泳 进 行 检 测 ， 从 而 获 得 DNA序 列 。 目 前 Sanger测 序

38、法 得 到 了 广 泛 的 应 用 。 1 DNA的 化 学 降 解 测 序 法 DNA的 化 学 降 解 测 序 法 也 叫 Maxam-Gilbert测 序 法 基 本 原 理 是 ， 将 待 测 DNA分 子 进 行 末 端 放 射 性 标 记 ，然 后 置 于 4组 独 立 的 化 学 反 应 体 系 中 分 别 进 行 部 分降 解 ， 其 中 每 一 组 反 应 特 异 性 地 针 对 某 一 碱 基 或某 一 类 碱 基 。 通 过 化 学 降 解 一 段 时 间 后 ， 在 每 一组 反 应 体 系 中 ， 生 成 各 种 不 同 长 度 的 、 一 端 为 放射 性 标 记

39、固 定 的 寡 聚 核 苷 酸 分 子 ， 经 聚 丙 烯 酰 胺凝 胶 电 泳 和 放 射 自 显 影 检 测 后 可 以 读 出 待 测 DNA分子 的 碱 基 序 列 。 （ 2） 碱 基 切 割 反 应 体 系 进 行 碱 基 特 异 性 化 学 切 割 反 应 的 试 剂 是 硫 酸 二 甲酯 、 肼 （ 联 氨 ） 以 及 哌 啶 （ 六 氢 吡 啶 ） 。硫 酸 二 甲 酯 、 肼 （ 联 氨 ） 碱 基 进 行 化 学 修 饰 ；哌 啶 从 修 饰 碱 基 处 断 裂 核 苷 酸 链 。 在 不 同 的 酸 、 碱 、 高 盐 和 低 盐 条 件 下 ， 三 种化 学 试 剂

40、按 不 同 的 组 合 能 特 异 地 切 割 核 苷 酸 序 列 中的 特 定 碱 基 ， 降 解 待 测 模 板 DNA分 子 。 硫 酸 二 甲 酯 （ DMS） ： G；pH2甲 酸 哌 啶 ： G+A;肼 （ NH2NH2） ： C+T;肼 （ NH2NH2） +高 盐 ： C 1、 待 测 模 板的 制 备3、 待 测 模 板DNA分 子 的 序 列 分 析2、 化 学 降 解待 测 模 板DNA分 子测序步骤 化 学 降 解 测 序 法 不 仅 适 于 单 链 DNA， 也 适 于 双 链DNA的 测 序 ， 主 要 用 于 研 究 DNA的 一 级 和 二 级 结构 、 DNA

41、甲 基 化 位 点 测 定 和 DNA-蛋 白 质 相 互 作 用等 方 面 ， 结 果 准 确 可 靠 ， 是 DNA测 序 的 基 本 方 法之 一 。 它 的 缺 点 是 一 轮 反 应 所 能 测 定 模 板 DNA长 度 只 有250bp左 右 ， 若 测 定 大 片 段 DNA分 子 时 ， 操 作 较为 繁 琐 费 时 。 另 外 ， 化 学 降 解 测 序 法 不 能 在 载体 上 直 接 进 行 ， 标 记 后 的 模 板 DNA分 子 难 以 纯 化 。 2 DNA的双脱氧链终止测序法 双 脱 氧 链 终 止 测 序 法 是 由 Sanger等 在 加 减 法的 基 础 上

42、 建 立 的 一 种 简 单 快 速 的 DNA序 列 分析 法 ， 故 也 称 为 Sanger测 序 法 。 有 时 又 称 为引 物 合 成 法 ， 或 酶 促 引 物 合 成 法 ， 因 为 该 法是 以 待 测 DNA分 子 为 模 板 ， 在 DNA聚 合 酶 的作 用 下 ， 利 用 适 当 的 DNA合 成 引 物 进 行 DNA互补 链 的 合 成 来 完 成 测 序 工 作 的 。 基 本 原 理 ： DNA聚 合 酶 能 够 利 用 单 链 DNA作模 板 ， 合 成 出 对 应 的 DNA互 补 链 ， 但 在 反 应过 程 中 ， 如 果 2 ， 3 -双 脱 氧 核

43、 糖 核 苷 三磷 酸 底 物 （ ddNTP） 掺 入 到 寡 核 苷 酸 链 的 3端 ， DNA链 的 延 伸 反 应 即 被 终 止 。 ddNTP 链 终 止 核 苷 酸 在 4个 特 定 反 应 体 系 中 分 别 加 入 一 种 ddNTP反 应 底物 （ ddCTP、 ddATP、 ddGTP、 ddTTP） 以 及 DNA模板 、 合 成 引 物 、 DNA聚 合 酶 I、 一 定 浓 度 的 dNTP（ dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTP， 其 中 有 一 种 是 带 32P放 射 性 标 记 的 ） ， DNA链 的 合 成 随 机 终 止 于 某 一 特定 d

44、dNTPs。 最 后 通 过 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 和 放 射自 显 影 技 术 读 出 待 测 DNA模 板 的 碱 基 序 列 。 双 脱 氧 链 终 止 测 序 法 的 精 确 度 较 高 ， 绝 大 多 数 以单 纯 测 定 DNA序 列 为 目 的 的 实 验 室 均 采 用 此 法 。 此 法 读 取 的 碱 基 序 列 是 待 测 DNA模 板 的 互 补 链 ， 而非 模 板 链 本 身 。 ddNTP （ 2） 双 脱 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸 的 作 用 机 制 2 ， 3 -双 脱 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸 （ ddNTP）的 分 子 结 构 式

45、 与 2 -脱 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸 （ dNTP）极 为 相 似 ， 惟 一 的 区 别 是 ， ddNTP在 脱 氧 核 糖 的 3位 置 上 缺 少 一 个 羟 基 。 在 DNA链 的 合 成 过 程 中 ， ddNTP可 以 利 用 其5 -磷 酸 基 团 与 DNA链 上 的 游 离 羟 基 基 团 形 成 磷 酸二 酯 键 而 使 链 得 以 延 伸 ， 但 是 由 于 ddNTP缺 少 3 -0H基 团 ， 不 能 与 下 一 个 底 物 分 子 的 5 -磷 酸 基 团进 行 反 应 ， 因 此 新 生 的 寡 核 酸 链 一 旦 加 入 ddNTP，DNA链 的

46、合 成 就 会 终 止 。 （ 3） 待 测 模 板 DNA分 子 的 制 备 限 制 性 核 酸 内 切 酶 消 化 切 割 形 成 DNA小 片 段 随 机 地 克 隆 到 一 种 合 适 的 载 体 分 子 上 经 转 化 筛 选 后 得 到 含 有 同 一 来 源 DNA片 段 的 重 组子 克 隆 后 代 以 此 大 量 制 备 重 组 DNA分 子 ， 直 接 用 于 DNA测 序 需要 因 为 新 生 DNA链 的 合 成 反 应 是 从 引 物3 端 定 向 进 行 的 ， 无 须 将 待 测 DNA片 段 从载 体 上 切 下 。 事 实 上 ， 载 体 的 存 在 不 但

47、不 会 影 响测 序 的 结 果 ， 反 而 有 利 于 测 序 的 进 行 ， 因为 在 实 际 操 作 中 ， 引 物 往 往 是 与 载 体 克 隆位 点 的 两 侧 序 列 互 补 ， 这 样 可 以 测 定 完 整的 DNA序 列 。 M13载 体 能 克 隆 单 链 DNA分 子 ， 制 备 的 产 物 可 直 接 用 作引 物 合 成 反 应 中 的 单 链 模 板 ， 同 时 ， 由 于 待 测 DNA片 段 均 被克 隆 在 M13载 体 的 同 一 个 特 定 区 段 内 ， 所 有 的 待 测 DNA片 段 ，都 可 以 使 用 同 一 种 引 物 ， 即 M13载 体

48、克 隆 位 点 两 侧 的 通 用 引物 （ universal primer） 进 行 DNA链 的 合 成 延 伸 ， 避 免 了 因合 成 和 分 离 各 种 不 同 引 物 而 导 致 的 许 多 麻 烦 。 因 此 ， M13载 体 双 脱 氧 链 终 止 法 目 前 已 经 成 为 一 种 普遍 采 用 的 快 速 DNA序 列 分 析 法 。 1985年 Chen和 Seeburg为 了 提 高 DNA测 序 速 度 建 立 。 该 法 是 将 待 测 定 的 DNA片 段 克 隆 到 质 粒 载 体 上 ， 直接 用 闭 合 环 形 的 双 链 质 粒 DNA按 双 脱 氧 链

49、 终 止 法 测 定 模 板DNA序 列 。 由 于 通 常 使 用 的 质 粒 是 PUC载 体 系 列 ， 所 以 又 称之 为 Sanger双 脱 氧 链 终 止 -pUC体 系 DNA序 列 分 析 法 。 这 种 方 法 的 最 大 优 点 是 ， 它 无 须 将 DNA克 隆 到 M13载 体 分 子上 ， 而 是 直 接 用 碱 变 性 的 双 链 闭 合 环 形 的 重 组 质 粒 DNA作为 模 板 进 行 序 列 分 析 ， 因 此 比 M13法 更 为 简 单 快 速 ， 实 用价 值 高 。针对双链DNA模板进行的双脱氧链终止测序法 （ 4） 测 序 反 应 物 的 合

50、 理 应 用 双 脱 氧 链 终 止 测 序 法 的 操 作 关 键 ： 是 ddNTP与 dNTP的 用 量 比 例 ， 两 者 较 为 理 想 的 分 子比 在 1： 3至 1： 4之 间 。 大 肠 杆 菌 DNA聚 合 酶 Klenow片 段 、 测 序 酶（ 经 过 改 造 的 T7噬 菌 体 聚 合 酶 ） 、 TaqDNA聚 合 酶 DNA序 列 分 析 中 通 常 采 用 -35S dATP代 替 - 32P dNTP， 以 便 获 得 更 高 的 分 辨 率 。 3 大 片 段 DNA的 测 序 策 略 DNA测 序 通 常 包 括 克 隆 、 测 序 反 应 和 读 序 三

51、 个 步 骤 。 前 述 两 种 DNA测 序 方 法 中 ， 一 次 测 序 能 直 接 读 出 的DNA序 列 长 度 受 到 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 分 离 效 果 的 限 制 ， 一 般情 况 下 ， 最 大 限 度 不 超 过 350个 碱 基 序 列 。 因 此 ， 对 于 较大 的 DNA片 段 而 言 ， 必 须 将 其 分 成 较 小 的 片 段 分 别 测 序 ，才 能 获 得 完 整 的 碱 基 序 列 。 选 择 恰 当 的 测 序 策 略 将 直 接 关 系 到 大 片 段 DNA或 基因 组 DNA序 列 分 析 的 工 作 效 率 。 随 机 克 隆 策 略

52、又 叫 鸟 枪 法 克 隆 策 略 ， 先 将 克 隆 DNA片 段 用 超 声 波打 断 或 DNA酶 切 断 ， 随 机 亚 克 隆 到 M13载 体 上 ，分 别 进 行 DNA序 列 测 定 ， 然 后 利 用 计 算 机 进 行 数 据分 析 ， 排 出 完 整 的 DNA序 列 。 鸟 枪 法 的 缺 点随 机 亚 克 隆 易 造 成 序 列 重 复 测 定 ， 也 易 丢 失 某 些序 列 ；测 序 及 测 序 后 的 数 据 处 理 和 分 析 工 作 量 大 ， 并 需要 计 算 机 帮 助 进 行 排 序 才 能 得 到 完 整 的 序 列 。 引 物 步 移 策 略 将

53、待 测 DNA片 段 克 隆 在 质 粒 载 体 上 ， 利 用 引物 步 移 延 伸 ， 从 DNA片 段 的 一 端 开 始 逐 步 进行 序 列 测 定 ， 直 到 另 一 端 为 止 。 引 物 步 移 法 克 服 了 鸟 枪 法 的 盲 目 性 ， 并 省 去 亚 克隆 制 备 的 繁 琐 步 骤 ， 也 减 轻 了 随 后 数 据 分 析 的 工作 量 。 但 由 于 测 定 下 一 段 序 列 前 要 预 先 知 道 上 游 序 列 的碱 基 序 列 ， 才 能 合 成 适 当 的 引 物 进 行 测 序 ， 因 此该 策 略 难 以 自 动 化 操 作 。 此 外 ， 引 物

54、合 成 费 时 费力 ， 再 加 上 目 前 常 用 的 质 粒 载 体 不 易 纯 化 等 也 都影 响 了 该 法 的 实 施 。 最 近 的 研 究 表 明 ： 随 机 引 物 可 作 为 引 物 步 移 法 中的 测 序 引 物 ， 例 如 采 用 线 性 连 接 的 3条 6碱 基 的 随机 引 物 即 可 很 好 地 引 导 测 序 反 应 ， 这 些 结 果 为 引物 步 移 法 的 自 动 化 带 来 可 能 。 定 向 缺 失 克 隆 策 略 利 用 核 酸 外 切 酶、 Bal31或 T4 DNA聚 合 酶 等 酶 解方 法 ， 从 克 隆 DNA片 段 一 侧 进 行 不

55、 同 时 间 的 定 向 缺失 ， 逐 步 缩 短 DNA片 段 大 小 ， 分 别 回 收 并 环 化 DNA缺 失 片 段 ， 使 DNA片 段 被 保 护 一 侧 的 引 物 结 合 位 点与 缺 失 不 同 长 度 的 一 侧 连 接 重 组 ， 转 化 筛 选 后 得到 一 系 列 由 待 测 DNA片 段 定 向 缺 失 后 形 成 的 嵌 套 重组 子 ， 然 后 利 用 引 物 结 合 位 点 逐 一 测 定 这 些 嵌 套重 组 子 中 的 待 测 DNA模 板 ， 最 后 根 据 重 叠 序 列 将 不同 片 段 的 序 列 拼 接 为 完 整 的 DNA片 段 序 列 。

56、 利 用 Exo能 特 异性 起 始 切 割 5凸 出端 或 平 末 端 的 双链 DNA， 而 不 能有 效 切 割 3凸 出 端的 双 链 DNA的 特性 ， 构 建 待 测DNA的 定 向 嵌 套缺 失 。 4、 DNA测 序 技 术 的 发 展 第 一 ， 非 放 射 性 标 记 检 测 物 的 使 用 第 二 ， DNA测 序 自 动 化 ： 1是 测 序 过 程 中 某 些 具 体 步 骤 的机 械 化 和 自 动 化 ， 2是 高 度 集 成 的 自 动 化 测 序 仪 的 发 明 及应 用 第 三 ， 计 算 机 在 DNA测 序 中 的 应 用 ： 大 规 模 测 序 计 划

57、 在 很大 程 度 上 依 赖 于 计 算 机 程 序 对 原 始 数 据 进 行 分 类 、 整 理 和排 序 ， 尤 其 是 在 随 机 测 序 策 略 中 ， 采 用 计 算 机 辅 助 分 析 ，大 大 加 快 了 DNA测 序 的 发 展 进 程 。 第 四 ， 现 有 技 术 的 其 他 改 进 。 主 要 包 括 ： 增 加 每 块 胶 上 的 泳 道 数 ； 采 用 新 型 凝 胶 和 电 泳 技 术 ； 改 进 光 学 检 测 系 统 ； 提 高 测 序 聚 合 酶 的 催 化 效 能 等 。 其 目 的 是 大 大 加 快 测 序 速 度 ， 提 高测 序 反 应 的 灵

58、敏 度 及 准 确 性 ， 降 低 测 序 反应 对 模 板 质 量 的 要 求 ， 简 化 模 板 制 备 程 序等 。 DNA测 序 方 法 分 为 两 类 ： 一 类 是 基 于 凝 胶 电 泳 技 术 的 测 序 法 ， 包 括目 前 普 遍 采 用 的 手 工 DNA测 序 技 术 、 自 动 化DNA测 序 技 术 、 毛 细 管 凝 胶 电 泳 激 光 荧 光 法 、阵 列 毛 细 管 电 泳 激 光 荧 光 法 和 超 薄 层 凝 胶板 电 泳 激 光 荧 光 法 等 ； 另 一 类 是 不 依 赖 于 电 泳 分 离 的 直 接 测 序 法 ，包 括 质 谱 法 、 原 子

59、探 针 法 、 杂 交 法 和 流 动式 单 分 子 荧 光 检 测 法 等 。 （ 1） 以 凝 胶 电 泳 为 基 础 的 测 序 方法 DNA全 自 动 序 列 分 析 系 统 （ ALF system）DNA自动测序采 用 荧 光 替 代 放 射 性 核 素 标 记 是 实 现 DNA序列 分 析 自 动 化 的 基 础 。 用 不 同 荧 光 分 子 标 记 四 种 双脱 氧 核 苷 酸 ， 然 后 进 行 Sanger测 序 反 应 ， 反 应 产 物经 电 泳 （ 平 板 电 泳 或 毛 细 管 电 泳 ） 分 离 后 ， 通 过 四种 激 光 激 发 不 同 大 小 DNA片

60、段 上 的 荧 光 分 子 使 之发 射 出 四 种 不 同 波 长 荧 光 ， 检 测 器 采 集 荧 光 信 号 ，并 依 此 确 定 DNA碱 基 的 排 列 顺 序 。 超 薄 层 板 凝 胶 电 泳 （ ultra-thin gel electrophoresis， UGE） 激 光 荧 光 法 在 电 泳 方 式 方 面 有 2处 改 进 ： 1是 超 高 压 电 场 的 使 用 ，它 可 以 大 幅 度 提 高 电 泳 速 度 ； 2是 超 薄 凝 胶 的 使 用 ，由 于 降 低 了 凝 胶 厚 度 ， 不 仅 提 高 了 电 泳 速 度 ， 还 可 以提 高 电 泳 条 带

61、的 分 辨 率 ， 使 一 次 性 阅 读 由 原 来 的 500个 碱 基 上 升 至 1000个 碱 基 ， 总 的 效 果 是 测 序 速 度 提 高到 8000bp h以 上 。 在 电 泳 结 果 检 测 方 式 方 面 ， 以 激光 荧 光 检 测 法 取 代 了 传 统 的 放 射 自 显 影 检 测 法 ， 既 杜绝 了 放 射 性 核 素 带 来 的 危 害 ， 也 便 于 自 动 化 操 作 。 PCR测 序 技 术 第 一 ， 利 用 PCR技 术 直 接 从 大 的 DNA片 段 或 基 因 组 DNA中 扩 增获 得 足 够 量 的 待 测 DNA模 板 ， 从 而

62、省 去 亚 克 隆 等 繁 琐 步 骤 。目 前 ， 不 对 称 PCR、 单 链 PCR、 固 相 PCR以 及 循 环 PCR等 新 的PCR技 术 都 已 应 用 到 DNA测 序 中 。 第 二 ， 通 过 PCR技 术 进 行 重 叠 群 排 序 。 将 由 重 叠 群 末 端 序 列确 定 的 引 物 逐 一 配 对 ， 以 待 测 大 片 段 DNA为 模 板 进 行 PCR，如 能 扩 增 出 阳 性 条 带 ， 便 说 明 这 两 个 重 叠 群 相 邻 。 重 叠 群顺 序 一 经 确 定 ， 便 可 利 用 PCR扩 增 重 叠 群 间 的 DNA片 段 。 第 三 ，

63、利 用 PCR技 术 进 行 DNA链 终 止 测 序 反 应 ， 这 一 过 程 被称 为 循 环 测 序 。 循 环 测 序 是 在 模 板 DNA分 子 过 少 时 ， 用 耐 高温 的 Taq酶 代 替 DNA聚 合 酶 进 行 酶 法 测 序 。 在 测 序 反 应 中 ，一 方 面 模 板 DNA分 子 得 以 扩 增 ， 另 一 方 面 ddNTP的 插 入 造 成以 特 定 ddNTP结 尾 的 长 短 不 同 的 DNA片 段 。 通 过 电 泳 分 离 便可 获 得 待 测 DNA分 子 的 碱 基 序 列 。 循 环 测 序 的 优 点 有 ： 大 大减 少 了 模 板

64、DNA的 用 量 ； 重 复 的 变 性 、 复 性 、 链 延 伸 循 环 可使 双 链 DNA的 酶 法 测 序 高 效 进 行 ； 初 始 阶 段 加 入 试 剂 后 不 必在 中 途 补 充 ， 可 实 现 自 动 化 。 毛 细 管 及 阵 列 毛 细 管 电 泳 激 光 荧 光 法 与 普 通 凝 胶 电 泳 相 比 ， 毛 细 管 凝 胶 电 泳 具 备 很 多 优 势 ： 第 一 ， 高 效 、 快 速 。 毛 细 管 内 径 一 般 在 25 100pm， 比 表面 积 大 ， 散 热 快 ， 可 使 用 较 高 的 电 场 强 度 ， 大 大 提 高 了 分析 速 度 和

65、分 辨 率 。 第 二 ， 所 需 样 品 量 少 ， 灵 敏 度 高 。 采 用 电 动 进 样 或 压 力 进样 ， 样 品 量 仅 为 1-50ul， 普 通 紫 外 检 测 器 可 检 测 10-13-10-15mol， 激 光 诱 导 荧 光 检 测 可 达 10-18-10-21mol。 第 三 ， 在 线 检 测 。 利 用 检 测 窗 口 直 接 进 行 柱 检 测 ， 不 受 凝胶 长 度 的 影 响 。 第 四 ， 操 作 自 动 化 、 重 复 实 验 误 差 低 。 因 此 ， 利 用 毛 细 管 凝 胶 电 泳 进 行 DNA测 序 ， 分 辨 率 极 高 ，其 关

66、键 在 于 选 择 合 适 的 毛 细 管 长 度 、 电 场 强 度 、 凝 胶 聚 合物 浓 度 及 温 度 因 素 等 ， 以 达 到 将 一 个 碱 基 大 小 差 异 的 DNA片 段 顺 利 分 离 开 来 的 目 的 。 （ 2） 非 电 泳 分 离 的 测 序 技术 杂 交 法 （ SBH） SBH的 基 本 原 理 是 ， 用 特 定 长 度 的 具 有 所有 可 能 碱 基 序 列 的 寡 核 苷 酸 群 体 ， 与 未知 序 列 的 特 点 数 目 的 DNA片 段 杂 交 ， 根 据某 些 寡 核 苷 酸 探 针 形 成 的 完 全 双 链 推 知目 的 DNA的 碱 基 序 列 。 利 用 共 价 结 合 在 寡 核 苷 酸 3 或 5 端 的 衍 生 物 与 玻 璃 板 或凝 胶 结 合 ， 形 成 固 定 的 寡 核 苷 酸 小 区 ； 不 同 碱 基 组 合 的 寡核 苷 酸 小 区 排 列 在 一 起 形 成 探 针 点 阵 ， 构 成 DNA测 序 芯 片或 称 为 基 因 芯 片 、 寡 核 苷 酸 矩 阵 芯 片 。 芯 片 中 寡 核 苷 酸