八年制综合实验.ppt

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1、HBV DNA定 量 检 测上 海 交 通 大 学 医 学 院刘 湘 帆 讲 师 PCR的 基 本 原 理 The software displays the fluorescence signals in real-time immediately after each measurement. Signals from the samples are obtained as the machine positions the capillaries sequentially over the optical unit. During thermal cycling, fluorescenc

2、e can be measured once per cycle for every capillary and the fluorescence values are displayed immediately on the screen and updated after every cycle (Fig.3). The generated data are stored for further analysis. 荧 光 定 量 PCR在 每 一 次 循 环后 对 进 行 实 时 监 控 ， 因 此能 最 准 确 反 映 出 对 数 期 。确 定 准 确 的 初 始 浓 度 。 软 件

3、系 统 可 以 进 行 参数 设 定 、 保 存 数 据 和报 告 结 果 ， 并 将 结 果自 动 保 存 在 计 算 机 中 。 相 同 模 板 进 行 96次 扩 增 的 扩 增 曲 线 图 。 Ct值 ， C代 表 Cycle， t代 表 threshold， Ct值 的 含 义是 ： 每 个 反 应 管 内 的 荧 光 信 号 到 达 设 定 的 域 值 时 所 经 历的 循 环 数 。 Ct值 分 析 实 际 上 就 是 低 浓 度 的 荧 光 值 分 析 。由 于 是 低 浓 度 ， 影 响 因 素 小 ， 所 以 具 有 良 好 的 重 现 性 。 研 究 表 明 ， 每 个

4、模 板 的 Ct值 与 该 模 板 的 起 始 拷 贝 数的 对 数 存 在 线 性 关 系 ， 起 始 拷 贝 数 越 多 ， Ct值 越 小 。 利 用 已 知 起 始 拷 贝 数 的 标 准品 可 作 出 标 准 曲 线 ， 其 中 横坐 标 代 表 起 始 拷 贝 数 的 对 数 ，纵 坐 标 代 Ct值 。 因 此 ， 只 要获 得 未 知 样 品 的 Ct值 ， 即 可从 标 准 曲 线 上 计 算 出 该 样 品的 起 始 拷 贝 数 。 The biggest disadvantage of SYBR is that it binds to any dsDNA; the spe

5、cific product, non-specific products and primer dimers are detected equally well. The LightCycler Instrument allows melting curve analysis Once the melting point of the product has been determined the LightCycler Instruments flexible programming allows the user to acquire fluorescence above the melt

6、ing temperature of the primer dimers, but below the melting temperature of the product. 缺 点 ： 存 在 非 特 异 性 产 物 ，可 以 与 非 特 异 性 产 物 ， 甚 至引 物 二 聚 体 结 合 发 出 荧 光 。可 以 使 用 熔 点 曲 线 分 析 进行 鉴 别 ， 明 显 提 高 诊 断 的特 异 性 。 （ F1通 道 ） 2、 TaqMan水 解 探 针 技 术 杂 交 探 针 技 术 对 PCR产 物 定 量 又 称 荧 光 共 振 能 量 转 移 ， FRET需 要 一 对 引 物

7、 和 一 对 探 针 ， 探 针 A的 3端 为 荧 光 染 料 供 体 ； 探针 B的 5端 作 为 荧 光 染 料 受 体 。 2个 探 针 首 尾 相 连 ， 仅 差 一 个碱 基 。 检 测 在 退 火 时 进 行 。 Advantages of the LightCycler SystemWatch amplification as it occurs: real-time, on-line fluorescence allows you to see the results of every cycle as soon as PCR proceeds Save time: extr

8、emely rapid PCR, 20 minutes for 30 cycles Verify amplicon specificity: melting curve analysis provides differentiation between amplification products Detect mutations: changes in the melting curve analysis can be used to identify mutations Minimize contamination: amplification and detection are perf

9、ormed in the same closed tube 荧 光 定 量 PCR技 术 的 优 点1） 定 量 准 确 ， 实 时 监 控2） 敏 感 性 和 特 异 性 高3） 简 单 快 速 ， 30个 循 环 20几 分钟 就 能 够 完 成 。4） 污 染 可 能 性 小5） 不 需 要 常 规 的 产 物 后 期 复 杂处 理 ， 直 接 观 测 结 果6） 可 以 进 行 点 突 变 分 析 ， 根 据熔 点 曲 线 的 不 同 直 接 分 析 点 突变 的 情 况 。 Figure 3. Mutation detection by melting curve analysis.

10、 Top panel: melting curves of amplified gene fragments from wild-type and mutant individuals. Bottom panel: negative first derivatives of the melting curves showing the unique melting peak of each genotype. The gene fragment amplified from the heterozygous individual exhibits a melting curve with both the wild-type and mutant peaks (red plot). 标 准 品 扩 增 曲 线 标 准 曲 线 报 告 结 果 ： H BV DNA拷 贝 数 /ml， 如 6.20 106拷 贝 数 /ml或 6.20 E +06 参 考 范 围 ： 最 小 检 测 值 ， 5 102拷 贝 数 /ml（ 5E+02）